本发明属于生物材料领域，具体涉及一种丝素透明质酸多孔海绵及其制备方法和应用，本发明制得的丝素透明质酸多孔海绵可用于创面敷料。
背景技术：
医用敷料作为伤口处的覆盖物，在伤口愈合过程中，可以替代受损的皮肤起到暂时性屏障作用，避免或控制伤口感染，为创面愈合提供合适的微环境。近年来，丝素蛋白、透明质酸等天然高聚物材料作为功能性敷料的应用受到广泛关注。蚕丝丝素蛋白具有优异的生物相容性、机械性能和可降解性，作为生物医用材料前景广阔。然而，丝素蛋白吸水保湿性能不足，难以为创面提供长期润湿的微环境。透明质酸是一种天然的粘多糖，在人体皮肤中广泛存在，具有优异的保湿作用，是理想的天然保湿因子。因此，结合两种天然高聚物的特点，可以制备具有良好的结构稳定性和保湿性能的多孔海绵材料，用于创面敷料。但是，由于丝素和透明质酸都属于水溶性高聚物，在制备共混材料时需要使用化学交联剂。如果能够找到一种不使用化学交联剂制备出不溶于水的多孔海绵材料，对于丝素透明质酸在生物医用敷料中的应用及产业化将具有重要的意义。
公开号为cn101502669b的专利报道了将冷冻的丝素蛋白在-5～-25℃保存2～60d，获得不溶于水的丝素蛋白多孔材料。公开号为cn105749343a的专利报道了将冷冻的丝素蛋白在0～-7℃保存2～168h并在37℃下解冻获得湿态下不溶的多孔材料。这些方法制备丝素多孔材料不需要使用化学交联剂和变性剂，但单一的丝素蛋白材料吸水和保湿性差。专利公开号为cn102836465a的专利报道了一种通过化学交联剂制备的丝素蛋白透明质酸凝胶材料，通过交联，透明质酸明显提高了丝素蛋白材料的吸水性能，但这种方法需要化学交联剂的使用。公开号为cn104497327a的专利报道了一种无交联剂的丝素透明质酸复合膜的制备方法，采用37℃下缓慢干燥成膜制备难溶于水的共混膜，但是膜作为创面敷料应用受限。有研究也采用超声波诱导的方法制备丝素蛋白透明质酸复合凝胶，但凝胶力学性能差不能满足敷料的应用，而且超声波作用会降解丝素蛋白和透明质酸大分子的分子量。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种丝素透明质酸多孔海绵及其制备方法和应用。本发明制得的丝素透明质酸多孔海绵具有良好的吸水性，且本发明制备方法未使用任何化学交联剂，环保无毒；另外，本发明制得的丝素透明质酸多孔海绵可用作创面敷料。
为了实现本发明上述第一个目的，本发明采用如下技术方案：
一种丝素透明质酸多孔海绵，所述的丝素透明质酸多孔海绵难溶于水，具有孔径为10～500μm的相互贯通的孔隙；所述的丝素透明质酸多孔海绵包括丝素蛋白和透明质酸，以多孔海绵的总质量为100％计，其中：透明质酸的质量分数为0.5～10％。
进一步，上述技术方案，所述丝素蛋白主要结构为silkⅰ结构，难溶于水。
本发明的第二个目的在于提供上述所述的丝素透明质酸多孔海绵的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)配制质量百分浓度为2～10％的丝素蛋白溶液，然后向所述丝素蛋白溶液中加入透明质酸或透明质酸盐溶液，充分混合均匀，得到丝素蛋白-透明质酸混合溶液；
(2)将步骤(1)得到的混合溶液注入到金属模具中，在-10～-80℃条件下冷冻2～4h，得到一次冷冻体；
(3)将步骤(2)得到的一次冷冻体置于0～-7℃条件下处理48～96h，得到二次冷冻体；
(4)将步骤(3)得到的二次冷冻体进行冷冻干燥，获得本发明所述的难溶于水的丝素透明质酸多孔海绵。
进一步，上述技术方案，步骤(1)中所述透明质酸盐为透明质酸钠盐、透明质酸钾盐、透明质酸镁盐、透明质酸钙盐、透明质酸锌盐中的任一种或两种或两种以上的组合。
进一步，上述技术方案，步骤(1)中所述的丝素蛋白溶液是将家蚕丝进行脱胶、溶解、透析处理后得到的再生丝素蛋白溶液。
优选地，上述所述的再生丝素蛋白溶液采用如下方法制得，包括如下步骤：
(a)将天然蚕丝在质量分数为0.05～1.0％的碳酸钠溶液中进行煮沸处理，使蚕丝脱胶，然后将脱胶的蚕丝充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维；
(b)将步骤(a)得到的纯丝素纤维加入到溶解液中，然后在60～80℃条件下搅拌溶解1～2h，得到丝素蛋白混合溶液；
(c)将步骤(b)得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析2～4d，得到丝素蛋白水溶液。
优选地，上述技术方案步骤(b)中所述的溶解液为libr溶液或硝酸钙溶液；所述的溶解液还可以为由氯化钙、饱和一元脂肪醇、去离子水组成的三元混合溶液。
更优选地，上述技术方案所述的饱和一元脂肪醇为甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的任一种或者多种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)由于本发明采用冷冻的方法形成难溶于水的丝素蛋白透明质酸多孔海绵，避免了化学试剂的使用，有效的保证了材料的生物相容性。
(2)本发明方法制得的丝素蛋白透明质酸多孔海绵具有良好的吸水保湿性能，能够为创面提供湿润环境；
(3)本发明制备过程条件温和，为全水相制备，无需使用任何化学交联剂和变性剂，也避免了高温、高压等条件，从而能够实现有效装载生物活性的生长因子；
(4)本发明方法简便可控，易于产业化。
具体实施方式
下面通过具体实施案例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
实施例1
本实施例的一种丝素透明质酸多孔海绵的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)再生丝素蛋白溶液的制备
(a)将天然蚕丝在质量分数为0.05％的碳酸钠溶液中，于98～100℃条件下煮沸处理30min，重复3次，使蚕丝脱胶，然后将脱胶的蚕丝充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维；
(b)将步骤(a)得到的纯丝素纤维加入到浓度为9.3mol/l的libr溶液中，然后在60℃条件下搅拌溶解2h，得到丝素蛋白混合溶液；
(c)将步骤(b)得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3d，得到丝素蛋白水溶液；
(2)丝素透明质酸多孔海绵的制备
(i)将上述步骤(c)得到的丝素蛋白水溶液的质量百分浓度调整到2％，然后向所述丝素蛋白水溶液中加入透明质酸钠溶液，充分混合均匀，得到丝素蛋白-透明质酸混合溶液，混合溶液中透明质酸钠的含量为0.5wt％；
(ii)将步骤(i)得到的混合溶液注入到金属模具中，在-80℃条件下冷冻2h，得到一次冷冻体；
(iii)将步骤(ii)得到的一次冷冻体置于-7℃条件下处理96h，得到二次冷冻体；
(iiii)将步骤(iii)得到的二次冷冻体在-80℃冷冻干燥2h，获得本发明所述的难溶于水的丝素透明质酸多孔海绵，所述的多孔海绵具有孔径为10～500μm的相互贯通的孔隙。
将本实施例上述制得的丝素透明质酸多孔海绵置于去离子水，于37℃条件下浸泡24h，称重计算可知，海绵溶失率仅为2.8％。
实施例2
本实施例的一种丝素透明质酸多孔海绵的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)再生丝素蛋白溶液的制备
(a)将天然蚕丝在质量分数为0.05％的碳酸钠溶液中，于98～100℃条件下煮沸处理30min，重复3次，使蚕丝脱胶，然后将脱胶的蚕丝充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维；
(b)将步骤(a)得到的纯丝素纤维加入到摩尔比为1：2：8的cacl2/ch3ch2oh/h2o三元溶液中，然后在70℃条件下搅拌溶解1h，得到丝素蛋白混合溶液；
(c)将步骤(b)得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3d，得到丝素蛋白水溶液；
(2)丝素透明质酸多孔海绵的制备
(i)将上述步骤(c)得到的丝素蛋白水溶液的质量百分浓度调整到5％，然后向所述丝素蛋白水溶液中加入透明质酸钾溶液，充分混合均匀，得到丝素蛋白-透明质酸混合溶液，混合溶液中透明质酸钠的含量为2.5wt％；
(ii)将步骤(i)得到的混合溶液注入到金属模具中，在-60℃条件下冷冻3h，得到一次冷冻体；
(iii)将步骤(ii)得到的一次冷冻体置于-4℃条件下处理72h，得到二次冷冻体；
(iiii)将步骤(iii)得到的二次冷冻体在-80℃冷冻干燥2h，获得本发明所述的难溶于水的丝素透明质酸多孔海绵，所述的多孔海绵具有孔径为10～500μm的相互贯通的孔隙。
将本实施例上述制得的丝素透明质酸多孔海绵置于去离子水，于37℃条件下浸泡24h，称重计算可知，海绵溶失率仅为3.2％。
实施例3
本实施例的一种丝素透明质酸多孔海绵的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)再生丝素蛋白溶液的制备
(a)将天然蚕丝在质量分数为0.05％的碳酸钠溶液中，于98～100℃条件下煮沸处理30min，重复3次，使蚕丝脱胶，然后将脱胶的蚕丝充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维；
(b)将步骤(a)得到的纯丝素纤维加入到浓度为7.5mol/l的硝酸钙溶液中，然后在80℃条件下搅拌溶解2h，得到丝素蛋白混合溶液；
(c)将步骤(b)得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3d，得到丝素蛋白水溶液；
(2)丝素透明质酸多孔海绵的制备
(i)将上述步骤(c)得到的丝素蛋白水溶液的质量百分浓度调整到7.5％，然后向所述丝素蛋白水溶液中加入透明质酸钠溶液，充分混合均匀，得到丝素蛋白-透明质酸混合溶液，混合溶液中透明质酸钠的含量为7.5wt％；
(ii)将步骤(i)得到的混合溶液注入到金属模具中，在-40℃条件下冷冻4h，得到一次冷冻体；
(iii)将步骤(ii)得到的一次冷冻体置于-1℃条件下处理48h，得到二次冷冻体；
(iiii)将步骤(iii)得到的二次冷冻体在-80℃冷冻干燥2h，获得本发明所述的难溶于水的丝素透明质酸多孔海绵，所述的多孔海绵具有孔径为10～500μm的相互贯通的孔隙。
将本实施例上述制得的丝素透明质酸多孔海绵置于去离子水，于37℃条件下浸泡24h，称重计算可知，海绵溶失率仅为3.0％。
实施例4
本实施例的一种丝素透明质酸多孔海绵的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)再生丝素蛋白溶液的制备
(a)将天然蚕丝在质量分数为0.05％的碳酸钠溶液中，于98～100℃条件下煮沸处理30min，重复3次，使蚕丝脱胶，然后将脱胶的蚕丝充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维；
(b)将步骤(a)得到的纯丝素纤维加入到浓度为7.5mol/l的硝酸钙溶液中，然后在60℃条件下搅拌溶解1h，得到丝素蛋白混合溶液；
(c)将步骤(b)得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3d，得到丝素蛋白水溶液；
(2)丝素透明质酸多孔海绵的制备
(i)将上述步骤(c)得到的丝素蛋白水溶液的质量百分浓度调整到10％，然后向所述丝素蛋白水溶液中加入透明质酸钠溶液，充分混合均匀，得到丝素蛋白-透明质酸混合溶液，混合溶液中透明质酸钠的含量为10wt％；
(ii)将步骤(i)得到的混合溶液注入到金属模具中，在-40℃条件下冷冻2h，得到一次冷冻体；
(iii)将步骤(ii)得到的一次冷冻体置于-4℃条件下处理72h，得到二次冷冻体；
(iiii)将步骤(iii)得到的二次冷冻体在-80℃冷冻干燥2h，获得本发明所述的难溶于水的丝素透明质酸多孔海绵，所述的多孔海绵具有孔径为10～500μm的相互贯通的孔隙。
将本实施例上述制得的丝素透明质酸多孔海绵置于去离子水，于37℃条件下浸泡24h，称重计算可知，海绵溶失率仅为3.0％。
实施例5
本实施例的一种丝素透明质酸多孔海绵的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)再生丝素蛋白溶液的制备
(a)将天然蚕丝在质量分数为0.5％的碳酸钠溶液中，于98～100℃条件下煮沸处理30min，重复3次，使蚕丝脱胶，然后将脱胶的蚕丝充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维；
(b)将步骤(a)得到的纯丝素纤维加入到浓度为9.3mol/l的libr溶液中，然后在65℃条件下搅拌溶解1.5h，得到丝素蛋白混合溶液；
(c)将步骤(b)得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析4d，得到丝素蛋白水溶液；
(2)丝素透明质酸多孔海绵的制备
(i)将上述步骤(c)得到的丝素蛋白水溶液的质量百分浓度调整到2％，然后向所述丝素蛋白水溶液中加入透明质酸钠溶液，充分混合均匀，得到丝素蛋白-透明质酸混合溶液，混合溶液中透明质酸钠的含量为0.5wt％；
(ii)将步骤(i)得到的混合溶液注入到金属模具中，在-10℃条件下冷冻4h，得到一次冷冻体；
(iii)将步骤(ii)得到的一次冷冻体置于0℃条件下处理96h，得到二次冷冻体；
(iiii)将步骤(iii)得到的二次冷冻体在-80℃冷冻干燥2h，获得本发明所述的难溶于水的丝素透明质酸多孔海绵，所述的多孔海绵具有孔径为10～500μm的相互贯通的孔隙。
将本实施例上述制得的丝素透明质酸多孔海绵置于去离子水，于37℃条件下浸泡24h，称重计算可知，海绵溶失率仅为2.9％。