一种香椿提取物的制备方法与流程

本发明属于医学领域，涉及一种香椿提取物的制备方法，特别涉及一种香椿子提取物的制备方法。

背景技术：

顺铂由于其抗癌谱广、作用强且可以和多种抗肿瘤药物一同作用的特点，是目前最常用的肿瘤药物之一。但由于顺铂对细胞杀伤不具有特异性，因此在使用顺铂治疗癌症的同时也会对正常细胞造成损伤，产生较强的毒副作用，这大大限制了顺铂在临床上的运用。微核(micronucleus，mn)试验，作为一种常规的基因毒性检测方法，已经得到了广泛的应用。其检测的标本也从骨髓扩展到血液和组织。除常规的药物基因毒性检测外，在基因改变性疾病的诊断，疗效的评估和预防等方面具有重要的作用^[2]。

香椿子又可称为椿花、香椿铃，是香椿的果实。研究表明，香椿子含有多酚、挥发油、生物碱等多种活性成分，具有较强的降血糖等作用。姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄(curcuminlonga)中提取的一种天然酚类色素，具有无毒无害的特点^[6]。研究发现，姜黄素除了具有优良的着色性，还具有多种营养活性和药理学功能，包括抗氧化、降血脂和免疫增强等作用^[5]。

参考文献：

[1]nohaibrahimsaidsalem,magdamohammadnoshy,azzaalisaid.modulatoryeffectofcurcuminagainstgenotoxicityandoxidativestressinducedbycisplatinandmethotrexateinmalemice[j].foodandchemicaltoxicology,2017,105.

[2]agarwal,rakhi.,goel,sudhirk.,behari,jairaj..(2010).detoxificationandantioxidanteffectsofcurcumininratsexperimentallyexposedtomercury.,jappltoxicol,30(5),457-68.

[3]韩何丹,王海,李艾琳,韩照玉,高丽萍.红景天提取物对顺铂致肾细胞毒性的保护作用[j].癌变·畸变·突变,2018,30(03):204-208.

[4]余明泽,刘以农,蒋中仁,谢惠萍,葛宇杰,敬明武,郭明.环磷酰胺诱导小鼠骨髓细胞微核的影响因素的研究[j].现代预防医学,2007(05):935-936+941.

[5]李联营.对姜黄素抗肿瘤作用及机制的研究探讨[j].当代医学,2014,20(32):21-22.

[6]陈建平,李琳,苏健裕.姜黄素的抗氧化及抗肿瘤活性研究[j].现代食品科技,2014,30(12):11-15+6.

[7]覃默,韦美艳,周芹,方玲,韦力嘉,郑茳尧.6种明胶胶囊药壳对小鼠骨髓细胞微核率的影响[j].广东医学,2015,36(13):1982-1986.

技术实现要素：

香椿子[toonasinensis(a.juss.)roemseed]为楝科植物香椿的果实，本文研究了香椿子提取物(extractfromtoonasinensisseeds，etss)提取物对顺铂(cis-diamminedichloroplatinum，cddp)诱导小鼠骨髓细胞毒性的防护作用。本实验通过提取香椿子提取物对小鼠进行预处理，通过体内实验，以香椿子提取物为干预物，同时采用姜黄素(curcumin,cmn)作为阳性对照，通过给小鼠连续三天腹腔注射香椿子提取物后，再通过顺铂诱导处理，24h后处死小鼠，取小鼠骨髓细胞比较各组微核率及肾脏组织gsh、mda生化指标值，研究香椿子提取物对顺铂诱导小鼠细胞毒性的防护效果。结果表明，与顺铂模型组相比，香椿子提取物组、姜黄素组以及香椿子提取物与姜黄素联合组微核率显著降低，gsh含量显著升高，mda含量显著降低(p﹤0.05或p﹤0.01)。结论：香椿子提取物对顺铂诱导小鼠骨髓细胞与肾细胞毒性具有防护作用，可以降低体内的氧化应激程度，提高自身抗氧化能力，且联合姜黄素效果更显著。

本申请提供了一种香椿提取物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(a)在乙醇中超声波辅助提取香椿，得到香椿提取混合液；

(b)将所述香椿提取混合液挥发至无乙醇味，离心，取沉淀，得到香椿提取物粗品。

在一些实施方式中，所述制备方法还包括如下步骤：

(c)用水将所述香椿提取物粗品制备成香椿粗提取物稀释液；

(d)将所述香椿粗提取物稀释液过大孔树脂柱；

(e)用蒸馏水洗所述大孔树脂柱，至流出的液体无色；

(f)用乙醇洗脱所述大孔树脂柱，至流出的液体无色，收集洗脱液；

(g)将所述洗脱液挥发浓缩至无醇味，得到香椿提取物纯品。

在一些实施方式中，所述制备方法还包括如下步骤：

(h)将所述香椿提取物纯品冻干，得到香椿提取物纯品粉末。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所用乙醇浓度为60-80％，优选70％；和/或

在步骤(a)中，所述超声波辅助提取的温度为65-75℃，优选70℃；和/或

在步骤(a)中，所述超声波辅助提取的功率为200-400w，优选320w；和/或

在步骤(a)中，所述超声波辅助提取的时间为30-120min，优选60min、45min；和/或

在步骤(a)中，所述超声波辅助提取的提取料液比为1:10-50，优选1:30或1:25；和/或

在步骤(a)中，在乙醇中超声波辅助提取香椿两次或更多次，混合使用得到的香椿提取混合液；和/或

在步骤(b)中，所述离心的速度是3500-4500r/min，优选4000r/min；和/或

在步骤(b)中，所述离心的时间是10-30min，优选20min。

在一些实施方式中，在步骤(c)中，所用水与步骤(a)所用香椿原料的重量比为1:2-10，优选1:5；和/或

在步骤(d)中，所述大孔树脂为ab-8大孔树脂；和/或

在执行步骤(d)之前，用90-98％乙醇浸泡12-36小时装柱,然后用90-98％乙醇洗涤,最后用水洗至无醇味，优选，用95％乙醇浸泡24小时装柱,然后用95％乙醇洗涤,最后用水洗至无醇味；和/或

在步骤(d)中，将所述香椿子粗提物稀释液以5-10ml/min优选8ml/min的速度过所述大孔树脂柱。

在一些实施方式中，在步骤(f)中，所用乙醇浓度为60-80％，优选70％。

在一些实施方式中，在步骤(h)之前，将所述香椿提取物纯品在-80℃冰箱中冷冻5-10小时，优选8小时。

在一些实施方式中，步骤(h)为将所述香椿提取物纯品置于冷冻干燥机中12-36小时优选24小时后得到所述香椿提取物粉末。

在一些实施方式中，所述香椿选自香椿子。

在一些实施方式中，所述香椿使用粉末。

该香椿提取物能够有效地降低顺铂对机体的损伤，增加体内谷胱甘肽含量，降低体内丙二醛含量。

附图说明

图1为空白对照骨髓细胞微核染色照片；

图2为香椿子提取物处理骨髓细胞微核染色照片；

图3为姜黄素处理骨髓细胞微核染色照片；

图4为香椿子提取物+姜黄素处理骨髓细胞微核染色照片；

图5为香椿子提取物+顺铂提取物处理骨髓细胞微核染色照片；

图6为姜黄素+顺铂处理骨髓细胞微核染色照片；

图7为香椿子提取物+姜黄素+顺铂处理骨髓细胞微核染色照片；

图8为顺铂处理骨髓细胞微核染色照片。

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。

1材料与方法

1.1材料

香椿子，购于安徽亳州药材市场；spf级昆明种成年雄性小鼠80只，6～8周龄，体重25～30g，自由采食与饮水，由安徽省抗衰老中草药工程技术中心提供。

1.2仪器与试剂

仪器：moticba400型生物显微镜(带数码照相及图像分析系统)、中药粉碎机(浙江省永康市溪岸五金药具厂)、电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)、台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、恒温水浴锅(北京东方精瑞科技发展有限公司)、酶标仪(thermo)、冷冻干燥机(siminternationalgroup)、烘干箱(上海精宏实验设备有限公司)、-80℃冰箱(thermo)、实验用水为millipore超纯水机制备的超纯水、超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。

试剂：giemsa色素、顺铂(cddp,冻干型)源自齐鲁制药(海南)有限公司(批号:2wa2a1307047b,20mg/瓶)、姜黄素(碧云天生物科技有限公司,产品编号sc0299-25mg)、gsh试剂盒以及mda试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3方法

1.3.1香椿子提取物的提取

称取香椿子粉末20g于烧杯中，以70％乙醇超声波辅助提取(70℃,320w),重复两次，提取料液比分别是1:30、1:25，提取时间分别是60min、45min，合并滤液，挥发浓缩至无乙醇味，4000r/min离心20min，取其沉淀，即香椿提取物粗品，加入100ml蒸馏水稀释备用，即为香椿子粗提取物稀释液。

取100gab-8大孔树脂，首先用95％乙醇浸泡24小时装柱,然后用95％乙醇洗涤,最后用水洗至无醇味，将香椿子粗提物稀释液以8ml/min的速度过ab-8大孔吸附树脂柱，吸附完毕后，首先用蒸馏水洗柱，洗去多余的色素及杂质，至流出液无色，然后用70％乙醇洗脱至流出的液体无色，最后将洗脱液挥发浓缩至无醇味，在-80℃冰箱冷冻8小时，再置于冷冻干燥机中24小时后得到香椿子提取物粉末，即香椿子提取物纯品，4℃冰箱中储存备用。

以下试验所述香椿子提取物使用的是该香椿子提取物纯品。

1.3.2小鼠腹腔注射香椿子提取物、姜黄素的毒性预实验

取雄性小鼠32只，随机均分为4组，分组情况为:(1)空白对照组；(2)香椿子提取物组；(3)姜黄素组；(4)香椿子提取物组、姜黄素联合组。适应饲喂1周后，各组进行如下处理：

(1)组连续3天给予腹腔注射生理盐水0.1ml/kgbw；(2)组连续3天给予腹腔注射香椿子提取物150mg/kgbw；(3)组连续3天给予腹腔注射姜黄素150mg/kgbw；(4)组连续3天给予腹腔注射香椿子提取物和姜黄素150mg/kgbw(香椿子提取物与姜黄素之比为1：1)。上述各组腹腔注射均每天操作一次。

每只小鼠最后一次给药24h后处死，取出两侧股骨用ph6.8的pbs溶液冲洗骨髓，取骨髓细胞分别用于以下微核试验，取肾组织制备成10％匀浆备用，测定肾脏组织中丙二醛(mda)及谷胱甘肽(gsh)含量。

1.3.3小鼠腹腔注射香椿子提取物、姜黄素联合顺铂对小鼠的影响

雄性小鼠32只，随机均分为4组，为:(1)香椿提取物和顺铂复合处理组；(2)姜黄素和顺铂复合处理组；(3)香椿提取物、姜黄素联合和顺铂处理组；(4)顺铂模型组。

平行适应饲喂1周后，各组进行如下处理：

(1)组连续3天给予腹腔注射香椿子提取物150mg/kgbw后再单次腹腔注射顺铂6.5mg/kgbw；(2)组连续3天给予腹腔注射姜黄素150mg/kgbw后再单次腹腔注射顺铂6.5mg/kgbw；(3)组连续3天给予腹腔注射香椿子提取物和姜黄素共150mg/kgbw(香椿子提取物与姜黄素之比为1：1)后再单次腹腔注射顺铂6.5mg/kgbw；(4)组连续3天给予腹腔注射生理盐水(0.9％氯化钠溶液)后单次腹腔注射顺铂6.5mg/kgbw。上述各组腹腔注射均每天操作一次。

每只小鼠最后一次给药24h后处死，取出两侧股骨用ph6.8的pbs溶液冲洗骨髓，取骨髓细胞分别用于以下微核试验，取肾组织制备成10％匀浆备用，测定肾脏组织中丙二醛(mda)及谷胱甘肽(gsh)含量。

1.4微核试验

取适量骨髓在凹孔瓷板内，与灭活的胎牛血清混匀、滴加到载玻片上推片，自然干燥。每个标本制作2片。将推片放入甲醇中固定10min，取出后放入giemsa染液中染色15～30min，纯水冲洗，晾干。选择细胞完整、涂片均匀、染色适当的区域，在油镜下观察。先在低倍镜下进行观察,选择分布均匀,染色较好的区域,再在油镜下观察计数。嗜多染红细胞(polychromaticerythrocytes,pce)呈灰蓝色，一个细胞内可出现一个或多个微核^[7]。出现多个微核的pce按一个计算，针对每只鼠计数1000pce中含微核的pce数(mnpces/1000pces)以及含微核的pce的百分比(％mnpces)。

1.5统计方法

采用spss12.0统计软件进行分析。计数数据用卡方检验，计量数据用方差分析进行比较。以p＜0.05为差异有显著意义，以p＜0.01为差异有极显著意义。

2实验结果

2.1香椿子提取物与姜黄素对小鼠骨髓细胞微核率的影响

正常小鼠pce微核率为5‰以下，微核率大于5‰即为阳性^[4]。关于药物毒性，根据中草药制剂的有关规定，每种中药在两部以上古籍中记载无毒，便视为无毒性作用，该实验选取的单味中药姜科植物、香椿在在文献《本草》、《本草纲目》、《别目》均未见有毒性记载，说明选取的药物安全可靠^[3]。由表1可知，与空白对照组相比，单纯注射姜黄素或香椿子提取物不会导致微核率的增加，无显著性差异，且各组平均值均在5‰以下，为阴性。初步证明香椿子提取物和姜黄素对小鼠不会产生毒作用。图1至图4分别是各组部分骨髓细胞微核染色情况，微核出现率极低甚至无微核出现，箭头所示为微核，图1-4为各组pce微核的照片(giemsa，×1000油镜)。

表1香椿子提取物、姜黄素对小鼠骨髓细胞微核率的影响

2.2香椿子提取物、姜黄素对顺铂诱导小鼠骨髓细胞微核率的影响

由表2可知，与空白对照组相比，顺铂模型组微核率显著增高，微核率大于5‰即为阳性，且差异极显著(p<0.01)。其余给药组也呈现程度不一的微核率阳性，说明一定量的顺铂均会诱导小鼠产生细胞毒性。但与顺铂模型组相比，小鼠给予香椿子提取物和姜黄素处理后其微核率明显降低，单独的香椿子提取物和姜黄素处理组差异显著(p<0.05)，香椿子提取物与姜黄素联合处理差异极显著(p<0.01)。说明经过香椿子提取物和姜黄素处理过的小鼠对顺铂诱导的细胞毒性有一定的防护作用，而且香椿子提取物和姜黄素联合处理比单独处理效果好。图5至图8分别是各组部分骨髓细胞微核染色情况的照片。

表2香椿子提取物、姜黄素对顺铂诱导小鼠骨髓细胞微核率的影响

注：与对照组相比，*p＜0.05，**p<0.01；与模型组相比，#p＜0.05，##p<0.01。箭头所示为微核，图5-8各组pce微核(giemsa，×1000油镜)

结合2.1节与2.2节的结果可知，香椿子提取物与姜黄素或二者的组合对普通小鼠骨髓组织中的微核占pce比例影响不明显，说明对健康小鼠的生理机能影响很小。而在顺铂处理的小鼠骨髓组织中，能够显著降低微核含量。由此可知，香椿子提取物与姜黄或二者的组合至少能够用于预防、治疗或减缓由顺铂引起的小鼠机体的损伤。

2.3香椿子提取物与姜黄素对小鼠肾脏组织gsh、mda含量的影响

由表3可知，与空白对照组相比，单纯注射姜黄素或香椿子提取物不会导致gsh、mda含量异常，且与对照组相比无显著性差异。进一步证明了香椿子提取物和姜黄素对小鼠均不会产生毒作用。

表3香椿子提取物、姜黄素对小鼠肾脏组织gsh、mda含量的影响

2.4香椿子提取物、姜黄素对顺铂诱导小鼠肾脏组织gsh、mda值的影响

由表4可知，与空白对照组相比，顺铂模型组gsh含量显著降低，mda含量显著升高，且差异极显著(p<0.01)。与顺铂模型组相比，小鼠给予香椿子提取物和姜黄素处理后其gsh含量明显升高，单独的香椿子提取物和姜黄素处理组差异显著(p<0.05)，香椿子提取物与姜黄素联合处理差异极显著(p<0.01)；小鼠给予香椿子提取物和姜黄素处理后其mda含量明显降低，单独的香椿子提取物和姜黄素处理组差异显著(p<0.05)，香椿子提取物与姜黄素联合处理差异极显著(p<0.01)。说明经过香椿子提取物和姜黄素处理过的小鼠对顺铂诱导的细胞毒性及肾毒性和肾损伤有一定的防护作用，而且香椿子提取物和姜黄素联合处理比单独处理效果好，说明香椿提取物与姜黄素能够产生协同作用。

表4香椿子提取物、姜黄素对顺铂诱导小鼠肾脏组织gsh、mda的含量

注：与对照组相比，*p＜0.05，**p<0.01；与模型组相比，#p＜0.05，##p<0.01。

结合2.3节与2.4节的结果可知，香椿子提取物与姜黄素或二者的组合对普通小鼠肾组织中的gsh、mda的含量影响不明显，说明对健康小鼠的生理机能影响很小。而在顺铂处理的小鼠肾组织中，gsh含量显著增加，mda含量显著减少。

gsh含量显著增加能够激活或提高很多依赖gsh的解毒、抗氧化等对机体起到保护作用的生化反应。mda含量显著减少可以降低mda对机体的促进蛋白等生物大分子交联变性的危害。

由此可知，香椿子提取物与姜黄或二者的组合至少能够用于预防、治疗或减缓由顺铂引起的小鼠机体的损伤。

3讨论

研究表明氧化应激是顺铂毒性的主要机制之一，活性氧簇(ros)介导的氧化应激在顺铂毒性中具有重要的作用。顺铂在体内主要经肾脏排泄，金属铂离子可蓄积在肾脏，故其肾毒性最明显。顺铂对肾脏的不同部位均有毒性，可引起肾小球、肾小管功能及形态学改变。顺铂能与抗氧化系统相互作用，影响抗氧化系统和抗氧化酶系，导致不同组织发生氧化损伤，氧化应激反应程度和组织结构损耗的轻重呈明显的正相关。

小鼠骨髓细胞微核试验被认为是进行体内遗传毒性试验的首选方法，用来检测染色体断裂剂和非整倍体诱导剂对染色体的损伤作用^[1]。测定骨髓pce的微核发生率是检测细胞遗传损伤的一个非常有用的指标,凡能使染色体发生断裂,或使染色体和纺锤体联结遭到破坏的遗传损伤物质,都可以用微核试验来检测。

已研究表明，姜黄素的结构中含有酚羟基，在细胞膜发生脂质过氧化反应时，其酚羟基可以发生氧化反应，能有效终止自由基反应^[1]，因而其表现出诸多生理活性，比如抗氧化、抗肿瘤、防止衰老等诸多功效^[6]，成为近年来天然药物中的研究热点。香椿子提取物对顺铂所致细胞毒性的防护作用可能与香椿抗氧化成分的抗氧化和清除自由基活性有关。

本实验以小鼠骨髓细胞为研究对象，建立了cddp诱导小鼠氧化损伤模型，证明了香椿子提取物以及姜黄素对细胞毒性的防护作用，根据实验结果进一步证明了香椿子提取物和姜黄素具有协同效果，本研究将为开发新的天然无害抗氧化剂提供了新的思路和资源。

本试验的研究结果表明两种天然植物酚类活性成分——香椿子提取物和姜黄素联合给药能够产生协同作用，能够有效降低由顺铂诱发的细胞毒性和小鼠体细胞的遗传损伤。初步判定香椿子提取物能够拮抗顺铂所致小鼠染色体突变，且香椿子提取物与姜黄素具有协同作用。综上所述，一定浓度的香椿子提取物能明显提高小鼠体内抗氧化能力，在对顺铂此类抗癌药物引起的基因毒性有良好的调节作用。

以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。