一种鸡骨草总皂苷的制备工艺及其医药用途的制作方法

本发明涉及一种鸡骨草总皂苷的制备工艺及其医药用途。

背景技术：

鸡骨草abruscantoniensishance，又名广东相思子、土甘草，为豆科相思子属植物，主要分布于广东、广西、福建及海南等地区。其应用范围较广，以根及全草入药，味甘苦，性凉,，有清热利湿、舒肝止痛、活血散瘀之功效。鸡骨草全草主要含皂苷、黄酮类、氨基酸、蒽醌类、糖类等化合物。其皂苷类成分主要为三萜皂苷类，据文献报道，具有护肝、抗肿瘤、降血糖、降血脂等诸多药理活性。

目前，提取鸡骨草总皂苷的工艺中采用的方法有：溶剂萃取法、溶剂沉淀法和大孔树脂吸附法等。这类方法都是采用传统的提取方法，提取过程单一、鸡骨草总皂苷的出率也比较低。

廖春燕,黄敏,黄瑶,etal.超声波辅助提取鸡骨草总皂苷的工艺研究[j].北方园艺,2013(3):161-163中提出了一种超声波法提取鸡骨草总皂苷，通过单因素实验和正交优化试验，得出超声波提取鸡骨草总皂苷的最佳工艺条件是：超声波90w，乙醇浓度50％，料液比1:25，超声时间20min。超声波提取法虽然提取时间一般比较短，提取效率高，但是药材在受超声波衰减因素的制约，超声有效作用区域为一环形，如果提取罐的直径太大，中央就会形成超声空白区，所以超声波提取量少，噪音大，不能适应工厂大批量提取。

cn104069154a公开了一种鸡骨草总皂苷的提取方法。方法步骤如下：1)将鸡骨草烘干，粉碎；2)称取一定量的鸡骨草粉末加水浸润，然后加入鸡骨草粉末重量0.5％-3％的生物酶试剂进行酶解处理；3)酶解完成后，加入乙醇水溶液回流提取，得到提取液；4)将提取液过滤，滤渣重复提取，合并提取液，减压浓缩，得到鸡骨草总皂苷浓缩液；5)浓缩液用有机溶剂萃取，收集所需层液减压浓缩，干燥，即得鸡骨草总皂苷。该发明中将生物酶解法和溶液提取法结合，虽然生物酶可以促进细胞壁的酶解，是细胞壁内物质充分暴露出来。但是，影响酶解反应的因素较多，该方法难以进行工厂化大规模生产，并且，其中也未对中药的质量、有效性、安全性等进行检测，无法判断使用生物酶解是否会给对提取得到的鸡骨草总皂苷产生影响。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种鸡骨草总皂苷的制备工艺及其医药用途。

本发明所采取的技术方案是：

一种鸡骨草总皂苷的制备工艺，其特征在于：鸡骨草总皂苷的制备工艺包括以下步骤：

1)将鸡骨草粗碎后使用乙醇热回流法进行提取，提取液浓缩后得乙醇浓缩液，加水得到粗提液a；

2)在粗提液a中加入石油醚进行萃取，收集水层得到粗提液b；

3)在粗提液b中加入正丁醇进行萃取，收集正丁醇层，旋干正丁醇，加水溶解得到粗提液c；

4)将粗提液c通过大孔树脂纯化，使用水、乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得。

进一步地，步骤1)中，乙醇浓度为60％～80％，料液比为1：(20～30)，提取温度为80～100℃，提取时间为2～3h。

进一步地，步骤1)中重复提取2次以上，合并提取液后，将其浓缩至浸膏状。

进一步地，步骤1)中，乙醇浓缩液中加入的水与鸡骨草生药的体积质量比(l/kg)为(1～1.5)：1。

进一步地，步骤2)中，石油醚与粗提液a的体积比为1：(0.5～2)，萃取4次以上，每次时间为8～16h。

进一步地，步骤3)中，使用的正丁醇为水饱和的正丁醇，正丁醇与粗提液b的体积比为1：(0.5～1.5)，萃取4次以上，每次时间为8～16h。

进一步地，步骤3)中，加水至总皂苷浓度为0.5～2mg/ml。

进一步地，步骤4)中，使用的大孔树脂的孔径为9～20nm，进一步地，大孔树脂为非极性大孔树脂，进一步地，大孔树脂为d101大孔树脂。

进一步地，步骤4)中上样流速：0.5bv/h，先用3～5bv水洗脱，流速1.5～2.5bv/h，再使用2～3bv30％乙醇洗脱，流速0.5～1.5bv/h，再用4～6bv70％乙醇洗脱，流速0.5～1.5bv/h，收集70％乙醇洗脱液；优选地，步骤4)中上样流速：0.5bv/h，先用4bv水洗脱，流速2bv/h，再使用2.5bv30％乙醇洗脱，流速1bv/h，再用5bv70％乙醇洗脱，流速1bv/h，收集70％乙醇洗脱液。

上述的制备工艺制备得到的鸡骨草总皂苷在抗乙肝病毒中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明中公开了一种鸡骨草总皂苷的制备工艺，在最佳工艺条件下制备得到的总皂苷粉末状样品，红褐色，经过紫外检测纯度达到53％以上，不同提取工艺提取的总皂苷所含成份均有所不同，本工艺提取出的总皂苷质量稳定，并对其药理活性进行了细胞水平和动物水平的验证，证明了本发明中制备工艺得到的鸡骨草总皂苷对乙肝病毒的两种抗原hbsag、hbeag和dna均有明显的抑制作用，并且起效快。

附图说明

图1为鸡骨草总皂苷的制备工艺工艺流程图；

图2为提取温度对总皂苷提取率的影响；

图3为提取时间对总皂苷提取率的影响；

图4为乙醇浓度对总皂苷提取率的影响；

图5为料液比对总皂苷提取率的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

本发明中的总皂苷提取率(％)＝(样液中皂苷的质量浓度×样液的体积/鸡骨草质量)×100％。

工艺条件优化

乙醇热回流法提取时有4个主要影响因素，我们先采用单因素方法确定每个影响因素的较好的条件范围。

提取温度对总皂苷提取率的影响：各称取1g鸡骨草粉末5份，乙醇浓度为80％，提取时间为2h，料液比为1:15，提取温度分别为60℃，70℃，80℃，90℃，100℃。每分样品热回流重复提取两次。结果如图2所示。根据图2可知，提取温度从60℃到80℃，提取率几乎未增长，从80℃到90℃时，提取率大幅上升，90℃达到峰值，而后到100℃时又缓慢下降，可能是提取温度过高会使可溶性成分溶出得更多，使黏性增大，后期操作损耗更多，使提取率减小。所以提取温度的正交条件是：80℃，90℃，100℃。

提取时间对总皂苷提取率的影响：各称取1g鸡骨草粉末5份，乙醇浓度为80％，提取温度为80℃，料液比为1:15，提取时间分别为1h，1.5h，2h，2.5h，3h。每分样品热回流重复提取两次。结果如图3所示，根据图3可知，提取时间对总皂苷的提取率影响都比较平缓，并且实验是经过两次重复的热回流操作，更说明时间的影响较小。从图3可以看出，提取时间从1.5h到3h，提取率都是缓慢上升，3h时达到最大，但考虑到提取时间成本的经济性，再增大时间提取率也上升缓慢，所以提取时间的正交条件是：2h，2.5h，3h。

乙醇浓度对总皂苷提取率的影响：各称取1g鸡骨草粉末5份，提取温度为80℃，料液比为1:15，提取时间2h，乙醇浓度分别为50％，60％，70％，80％，90％。每分样品热回流重复提取两次。结果如图4所示，根据图4可知，乙醇浓度从50％到60％时，总皂苷提取率增长缓慢，浓度从60％到80％时，提取率大幅上升，而当从80％到90％时，提取率急剧下降。原因可能是高浓度的乙醇使得大量的非皂苷类的杂质溶出，干扰皂苷的提取，而且对于后续提纯也不利。综合考虑，乙醇浓度的正交条件是60％，70％，80％。

料液比对总皂苷提取率的影响：各称取1g鸡骨草粉末5份，提取温度为80℃，提取时间2h，乙醇浓度为80％，料液比分别为1:10，1:15，1:20，1:25，1:30。每分样品热回流重复提取两次。结果如图5所示，根据图5可知，料液比从1:10到1:15时，提取率未增长，从1:15到1:25时，提取率增长迅速，并且达到峰值，而后从1:25到1:30时，提取率轻微下降，说明在1:25后，料液比增加对提取率影响不大，可能是料液比增大，所需旋干体积增大，使旋干过程中损耗更多导致。所以料液比的正交条件是：1:20，1:25，1:30。

根据单因素实验结果，确定每个因素的三个水平，正交实验设计为四因素，三水平，采用l9(3⁴)正交表设计，以获得最佳的提取工艺条件，结果如下表所示。

根据极差r的大小，发现影响鸡骨草总皂苷提取率的因素主次是料液比>提取温度>乙醇浓度>提取时间。根据方差分析，发现乙醇浓度对实验结果有显著影响，提取温度和提取时间对实验结果有一定的影响，而提取时间对实验结果影响最小，几乎可以看作无影响。所以根据正交结果和节省能耗方面考虑，最佳的工艺条件是a2b1c2d3组合：乙醇浓度70％，料液比1:25，提取温度90℃，提取时间2h。在最佳提取工艺条件下，总皂苷提取率最大，达到1.18％。

获得最佳工艺条件后，进一步对总皂苷后续纯化方法进行研究，根据静态吸附实验，选择出可以吸附总皂苷最多的大孔树脂。

具体步骤为：分别称取的d101，d201，hpd300，hpd600，lx-11，lx-60六种型号的大孔树脂各10g(湿重)，95％乙醇浸泡过夜，再用4～6bv水洗至无醇味，转移至500ml三角锥型瓶中，加入已知总皂苷浓度的样品溶液50ml，摇床，静态吸附24h后，抽滤，检测滤液中的总皂苷浓度。剩下的大孔树脂重新转移至500ml三角锥形瓶中，每瓶加入50ml浓度为70％的乙醇溶液进行解吸，摇床，解吸24h后，再次抽滤，检测滤液中的总皂苷浓度。

静态吸附率e1％＝(c0v0-c1v1)/c0v0×100％

静态解吸率＝c2v2/(c0v0-c1v1)×100％

式中：c0为样品初始浓度(mg/ml)；c1为吸附平衡液浓度(mg/ml)；v0为吸附前溶液体积(ml)；v1为吸附后溶液体积(ml)；w为树脂质量(g)；c2为解吸液浓度(mg/ml)，v2为解吸后溶液体积(ml)。

结果如下：

进一步对过柱条件也进行了考察，分别收集不同浓度乙醇洗脱的洗脱液，测定不同洗脱液中的总皂苷浓度和运用lc-ms进行成份分析，确定了总皂苷主要集中在30％～70％乙醇段洗脱液中，最后总皂苷纯度达到53％以上。

实施例1

一种鸡骨草总皂苷的制备工艺，工艺流程图如图1所示，具体方法如下：

鸡骨草药材称重，乙醇热回流法提取，提取工艺条件为：乙醇浓度70％，料液比1:25，提取温度90℃，提取时间2h，重复提取两次合并两次提取液，浓缩，得乙醇浓缩液，水溶，乙醇浓缩液中加入的水与鸡骨草生药的体积质量比(l/kg)为1：1。使用石油醚萃取，比例1:1，萃取四次，每次时间12h，收集水层，使用水饱和的正丁醇萃取，比例1:1，萃取四次，每次12h，收集正丁醇层，旋干正丁醇，水溶，过大孔树脂。大孔树脂型号为d101型，过柱条件为：上样总皂苷浓度：1mg/ml，上样体积＝1bv，上样流速：0.5bv/h，水洗条件：4bv，流速2bv/h，乙醇洗脱条件：30％乙醇洗脱，流速1bv/h，2.5bv，舍弃；再用70％乙醇洗脱，流速1bv/h，5bv，收集。收集的洗脱液旋干，可以得到总皂苷粉末状样品，红褐色，经过紫外检测纯度达到53％以上。

实施例2

鸡骨草总皂苷抗病毒性乙型肝炎活性，与鸡骨草总提取物做对比

鸡骨草总提物提取方法：将鸡骨草粗碎后使用乙醇热回流法进行提取，提取条件为最佳工艺条件：乙醇浓度70％，料液比1:25，提取温度90℃，提取时间2h，得到乙醇提取液浓缩旋干后得浸膏状提取物，即为鸡骨草总提物。

细胞实验验证：

以hepg2.2.15细胞为模型，此细胞为转染了hbvdna的人的肝癌细胞，可以稳定地分泌乙肝病毒，先通过cck-8法检测鸡骨草总皂苷，鸡骨草总提取物对hepg2.2.15细胞的增殖抑制作用，结果显示，鸡骨草总皂苷在62.5μg/ml浓度以下，鸡骨草总提取物在125μg/ml对细胞增殖均无明显抑制作用，鸡骨草总提取物。

再通过elisa法检测总皂苷和总提物对乙肝病毒两种抗原的抑制作用，鸡骨草总皂苷和总提物设置3个浓度60μg/ml，30μg/ml，15μg/ml(均在最高无抑制细胞活性浓度以下)，以拉米夫定为阳性对照组，浓度为100μg/ml，分别给药培养3天。收集细胞上清，用elisa试剂盒进行检测hbsag、hbeag抗原含量。鸡骨草总皂苷(60μg/ml)对hbeag的抑制率达到51.7％，对hbsag的抑制率达到39.0％，鸡骨草总提取物(60μg/ml)对hbeag的抑制率为37.7％，对hbsag的抑制率为30.0％，阳性药拉米夫定对hbeag的抑制率为5.63％，对hbsag的抑制率为17.26％。结果显示，鸡骨草总皂苷对乙肝病毒的两种抗原的有较强的抑制作用，并且比阳性药拉米夫定和鸡骨草总提物的效果更好。

通过荧光定量pcr法检测总皂苷和总提物对乙肝病毒dna合成的抑制作用。鸡骨草总皂苷和总提物设置3个浓度60μg/ml，30μg/ml，15μg/ml(均在最高无抑制细胞活性浓度以下)，以拉米夫定为阳性对照组，浓度为100μg/ml，分别给药培养3天，6天。收集细胞上清，用荧光定量pcr法检测样品中的hbvdna含量。结果显示，鸡骨草总皂苷(60μg/ml)对hbvdna合成的抑制率为26.1％，鸡骨草总提物(60μg/ml)的抑制率为17.8％，拉米夫定无明显抑制作用，给药6天时，鸡骨草总皂苷的抑制率为22.4％，鸡骨草总提物的抑制率为16.3％，拉米夫定抑制率为91.8％。根据结果分析，总皂苷给药3天时对hbvdna合成就有抑制作用，而给药3天时拉米夫定无明显抑制作用，说明总皂苷对hbvdna合成的抑制起效快，给药6天时，总皂苷的抑制率维持稳定，拉米夫定显示出较强的抑制作用，并且总皂苷对hbvdna合成作用均强于总提物。

综合而言，通过细胞实验验证了鸡骨草总皂苷对乙肝病毒的两种抗原及其dna合成均有明显的抑制作用，并且起效快，效果均强于鸡骨草总提物。

动物实验验证：

采用乙肝病毒转染小鼠模型，验证鸡骨草总皂苷的小鼠体内抗乙肝病毒活性。

造模：采用c57bl/6小鼠，6周龄，雄性，尾静脉注射raav8-1.3hbv5*10¹⁰μg/只(病毒来源，北京五加和分子医学研究所)。两周后小鼠眼眶取血，分离血清，检测hbvdna，hbsag，hbeag含量。根据检测结果选取各指标表达量高的小鼠进入给药实验，小鼠hbeag水平均值为2420iu/ml，hbsag水平均值为1240iu/ml，hbvdna水平均值为3.74e+05copies/ml。

给药实验：根据各指标平衡分成4组，每组8只小鼠，三个给药组(鸡骨草总提物，总皂苷，阳性药拉米夫定)，一个空白溶剂对照组。给药方式，每天灌胃一次。给药体积：0.1ml/10g。给药剂量：根据鸡骨草提取生药比和中国药典鸡骨草和拉米夫定给药剂量进行换算，总提物11mg/10g体重，总皂苷0.77mg/10g体重，拉米夫定0.15mg/10g体重。共给药6周，每两周眼眶取血一次，检测hbvdna，hbsag，hbeag含量。结果显示，给药6周后，以空白溶剂组为参照，鸡骨草总提物组小鼠hbvdna合成的抑制率为15.6％，总皂苷组抑制率为26.3％，拉米夫定组抑制率为33.9％，鸡骨草总提物组对小鼠hbsag，hbeag的抑制率分别为10.14％，10.8％，总皂苷组对hbsag，hbeag抑制率分别为31.57％，10.7％，拉米夫定组对hbsag，hbeag抑制率分别为45.4％，24.8％。

结论：鸡骨草总皂苷和总提物对乙肝病毒转染小鼠均有抗乙肝病毒活性，并且总皂苷效果优于总提物。