巴马司他作为制备水母皮炎药物的应用的制作方法

本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种巴马司他(特异性基质金属蛋白酶抑制剂)作为制备水母皮炎药物的应用。

背景技术：

近年来，全球许多海域出现水母大规模暴发现象，给海洋生态系统、渔业生产、军事训练及滨海旅游等带来严重的影响。水母蜇伤已成为最常见的海洋生物伤，据美国国立卫生院估计，全球每年约有1.5亿人次被水母蜇伤，其中不乏死亡病例。水母皮炎是水母蜇伤的主要症状，被水母蜇伤后，即感到刺痒、麻痛或灼烧感，随后局部发生红斑、丘疹或荨麻疹样皮疹，奇痒无比，影响日常生活，特别是睡眠。

水母毒素是水母蜇伤的物质基础，是发病的根本原因。水母毒素成分复杂，是多肽和蛋白质的复杂混合物，具有多种生物活性，如溶血性、心脏毒性、神经毒性、细胞毒性和皮肤毒性。此外，还发现水母毒素具有金属蛋白酶活性。金属蛋白酶是生物毒素的重要组成部分，参与多种细胞过程，如细胞内信号传导、降解细胞外基质、炎症反应等。研究表明，蛇毒中的金属蛋白酶成分在其咬伤导致的伤口疼痛、流血不止以及溃烂等中毒现象中起重要作用。因此，水母毒素中的金属蛋白酶可能是导致水母皮炎的重要因素。所以,亟需根据水母毒素的生物活性研制治疗水母皮炎的药物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种巴马司他(特异性基质金属蛋白酶抑制剂)作为制备水母皮炎药物的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为

一种巴马司他作为制备水母皮炎药物的应用。

所述式ⅰ所示巴马司他经溶解稀释后作为制备水母皮炎药物的应用；

所述式ⅰ所示巴马司他经二甲基亚砜(dmso)溶解后，再用10mm磷酸盐缓冲液(nah2po4-na2hpo4，ph7.4)稀释。

巴马司他抑制水母毒素对人角质形成细胞hacat和人胚胎成纤维细胞ccc-esf-1死亡率的实验方法为：

将巴马司他用二甲基亚砜(dmso)溶解后，再用10mm磷酸盐缓冲液(nah2po4-na2hpo4，ph7.4)稀释得到巴马司他溶液。

然后向水母毒素中加入巴马司他溶液混合，使混合液中巴马司他与水母毒素(以蛋白计)的质量比等于或小于0.19:1，混匀，37℃下反应30min后待用。

向铺有1×10⁵个/ml细胞(细胞可为hacat或ccc-esf-1)的96孔板中分别加入100μl的巴马司他溶液和水母毒素的混合液、100μl的按体积比为1:1混合的水母毒素与细胞培养基混合液(对照)及100μl的细胞培养基(空白)，用mtt法测定细胞的存活率。

巴马司他抑制水母毒素导致的人角质形成细胞hacat和人胚胎成纤维细胞ccc-esf-1炎症因子mrna表达量的实验方法为：

将巴马司他用二甲基亚砜(dmso)溶解后，再用10mm磷酸盐缓冲液(nah2po4-na2hpo4，ph7.4)稀释得到巴马司他溶液。

然后向水母毒素中加入巴马司他溶液混合，使混合液中巴马司他与水母毒素(以蛋白计)的质量比等于或小于0.19:1，混匀，37℃下反应30min后待用。

向铺有1×10⁵个/ml细胞(细胞可为hacat或ccc-esf-1)的各培养皿中分别加入1ml巴马司他溶液与水母毒素的混合液、1ml按体积比为1:1混合的水母毒素与细胞培养基混合液(对照)及1ml细胞培养基(空白)，37℃培养箱中反应24h后，提取各培养条件下细胞的rna并反转录成cdna，根据qrt-pcr法(pfaffl,m.w.(2001).anewmathematicalmodelforrelativequantificationinreal-timert-pcr.nucleicacidsresearch,29(9),45e–45.https://doi.org/10.1093/nar/29.9.e45)测定细胞中炎症因子mrna的表达量。

本发明的优点：

本发明采用巴马司他可有效抑制水母毒素引起的两种细胞(人角质形成细胞hacat和人胚胎成纤维细胞ccc-esf-1)的死亡和炎症因子mrna的表达量，进而可将其作为用于制备水母皮炎的药物，拓宽了巴马司他的应用范围。

附图说明：

图1为本发明实施例提供的巴马司他和水母毒素(以蛋白计)在不同质量比条件下，巴马司他对人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)存活率的影响图。

图2为本发明实施例提供的巴马司他和水母毒素(以蛋白计)在不同质量比条件下，巴马司他对人角质形成细胞(hacat)存活率的影响图。

图3为本发明实施例提供的巴马司他抑制水母毒素对人角质形成细胞(hacat)炎症因子mrna的表达图。

图4为本发明实施例提供的巴马司他抑制水母毒素对人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)炎症因子mrna的表达图。

具体实施例：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下述实施例中采用的溶液分别为：

巴马司他溶液的配制方法为：取1mg巴马司他，用209.4μldmso溶解，制得10mm的巴马司他溶液；然后将10mm的巴马司他溶液用10mm磷酸盐缓冲液(nah2po4-na2hpo4，ph7.4)稀释，分别配制浓度为1μm、2μm、4μm、10μm、20μm的巴马司他溶液。

50μg/ml的水母毒素溶液的配制方法为：冰冻的水母触手组织从-80℃冰箱中取出后，置于4℃冷藏柜中解冻、自溶2-4天。期间为加速水母触手溶解，每隔一天小心倾倒上层海水后加入新鲜海水，加速刺丝囊细胞从触手上脱落。待水母组织完全自溶后，缓慢倒掉上层自溶液，收集下层带有沉淀的自溶液，然后分别用60目和100目的分样筛过滤。收集过滤液，3000g离心15min，收集下层沉淀，再用干净海水洗2-3次并离心，即得到较为纯净的刺丝囊。将刺丝囊细胞置于-80℃冰箱中保存备用。将刺丝囊和4℃中预冷的20mm磷酸盐缓冲液(nah2po4-na2hpo4，ph7.4)按照1:3(w/v)的比例进行提取。破碎完成后4℃、15000g冷冻离心30min，上清液即为水母毒素溶液。水母毒素的测定采用福林酚法(张蕾，刘昱，蒋达和，杨明园，曹志贱.生物化学实验指导[m].武汉:武汉大学出版社，2011.95-98.)，以牛血清白蛋白(bsa)为标准。再将毒素用4℃中预冷的20mm磷酸盐缓冲液(nah2po4-na2hpo4，ph7.4)稀释成50μg/ml即可。

人角质形成细胞hacat培养基的配制：向500mlmem/ebss培养基中加入55.6ml的胎牛血清和5.6ml的双抗。

人胚胎纤维形成细胞ccc-esf-1培养基的配制：向500mldmem高糖培养基中加入125ml的胎牛血清和6.3ml的双抗。

细胞反应终止液的配制：称取sds20g用200ml蒸馏水溶解后，加入0.176mlhcl。

实施例1:

取上述1μm的巴马司他溶液与50μg/ml的水母毒素按照体积比1:1混合均匀，在37℃下反应30min后，作为混合液a，待用；

向铺有100μl1×10⁵个/ml人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)的96孔板中分别加入100μl的混合液a、100μl的按体积比为1:1混合的水母毒素与细胞培养基混合液(对照)及100μl的细胞培养基(空白)，反应24h后，移除上清液，加入mtt反应4h后，加入终止液，24h内用酶标仪测量a490nm，反应设置三个平行。根据以下公式计算细胞存活率。

实验结果显示(参见图1)，当巴马司他与水母毒素(以蛋白计)的质量比为0.0096:1时，细胞存活率分别为80.14％、84.09％、83.82％，平均值为82.68±2.21％，高于对照组细胞存活率66.17％，表明巴马司他能够抑制水母毒素导致的人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)的死亡。

实施例2:

取2μm的巴马司他溶液与50μg/ml的水母毒素按照体积比1:1混合均匀，在37℃下反应30min后，作为混合液b，待用；

向铺有100μl1×10⁵个/ml人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)的96孔板中分别加入100μl的混合液b、100μl的按体积比为1:1混合的水母毒素与细胞培养基混合液(对照)及100μl的细胞培养基(空白)，反应24h后，移除上清液，加入mtt反应4h后，加入终止液，24h内用酶标仪测量a490nm，反应设置三个平行。根据以下公式计算细胞存活率。

实验结果显示(参见图1)，当巴马司他与水母毒素(以蛋白计)的质量比为0.019:1时，细胞存活率分别为84.41％、91.66％、81.22％，平均值为85.76±5.35％，高于对照组细胞存活率66.17％，表明巴马司他能够抑制水母毒素导致的人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)的死亡。

实施例3:

取4μm的巴马司他溶液与50μg/ml的水母毒素按照体积比1:1混合均匀，在37℃下反应30min后，作为混合液c，待用；

向铺有100μl1×10⁵个/ml人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)的96孔板中分别加入100μl的混合液c、100μl的按体积比为1:1混合的水母毒素与细胞培养基混合液(对照)及100μl的细胞培养基(空白)，反应24h后，移除上清液，加入mtt反应4h后，加入终止液，24h内用酶标仪测量a490nm，反应设置三个平行。根据以下公式计算细胞存活率。

实验结果显示(参见图1)，当巴马司他与水母毒素(以蛋白计)的质量比为0.038:1时，细胞存活率分别为82.52％、80.85％、81.29％，平均值为81.55±0.87％，高于对照组细胞存活率66.17％，表明巴马司他能够抑制水母毒素导致的人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)的死亡。

实施例4:

取10μm的巴马司他溶液与50μg/ml的水母毒素按照体积比1:1混合均匀，在37℃下反应30min后，作为混合液d，待用；

向铺有100μl1×10⁵个/ml人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)的96孔板中分别加入100μl的混合液d、100μl的按体积比为1:1混合的水母毒素与细胞培养基混合液(对照)及100μl的细胞培养基(空白)，反应24h后，移除上清液，加入mtt反应4h后，加入终止液，24h内用酶标仪测量a490nm，反应设置三个平行。根据以下公式计算细胞存活率。

实验结果显示(参见图1)，当巴马司他与水母毒素(以蛋白计)的质量比为0.096:1时，细胞存活率分别为78.99％、76.20％、75.01％，平均值为76.73±2.04％，高于对照组细胞存活率66.17％，表明巴马司他能够抑制水母毒素导致的人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)的死亡。

实施例5:

取20μm的巴马司他溶液与50μg/ml的水母毒素按照体积比1:1混合均匀，在37℃下反应30min后，作为混合液e，待用；

向铺有100μl1×10⁵个/ml人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)的96孔板中分别加入100μl的混合液e、100μl的按体积比为1:1混合的水母毒素与细胞培养基混合液(对照)及100μl的细胞培养基(空白)，反应24h后，移除上清液，加入mtt反应4h后，加入终止液，24h内用酶标仪测量a490nm，反应设置三个平行。根据以下公式计算细胞存活率。

实验结果显示(参见图1)，当巴马司他与水母毒素(以蛋白计)的质量比为0.19:1时，细胞存活率分别为65.98％、67.02％、71.05％，平均值为68.02±2.68％，高于对照组细胞存活率66.17％，表明巴马司他能够抑制水母毒素导致的人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)的死亡。

由图1可见，当巴马司他与水母毒素质量比(以蛋白计)等于或小于0.19:1时，能够抑制水母毒素导致的人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)的死亡。

实施例6:

取1μm的巴马司他与50μg/ml的水母毒素按照体积比1:1混合均匀，在37℃下反应30min后，作为混合液a，待用；

向铺有100μl1×10⁵个/ml人角质形成细胞(hacat)的96孔板中分别加入100μl的混合液a、100μl的按体积比为1:1混合的水母毒素与细胞培养基混合液(对照)及100μl的细胞培养基(空白)，反应24h后，移除上清液，加入mtt反应4h后，加入终止液，24h内用酶标仪测量a490nm，反应设置三个平行。根据以下公式计算细胞存活率。

实验结果显示(参见图2)，当巴马司他与水母毒素(以蛋白计)的质量比为0.0096:1时，细胞存活率分别为68.49％、62.52％、65.53％，平均值为65.51±2.98％，高于对照组细胞存活率50.59％，表明巴马司他能够抑制水母毒素导致的人角质形成细胞(hacat)的死亡。

实施例7:

取2μm的巴马司他与50μg/ml的水母毒素按照体积比1:1混合均匀，在37℃下反应30min后，作为混合液b，待用；

向铺有100μl1×10⁵个/ml人角质形成细胞(hacat)的96孔板中分别加入100μl的混合液b、100μl的按体积比为1:1混合的水母毒素与细胞培养基混合液(对照)及100μl的细胞培养基(空白)，反应24h后，移除上清液，加入mtt反应4h后，加入终止液，24h内用酶标仪测量a490nm，反应设置三个平行。根据以下公式计算细胞存活率。

实验结果显示(参见图2)，当巴马司他与水母毒素(以蛋白计)的质量比为0.019:1时，细胞存活率分别为58.66％、54.57％、70.39％，平均值为61.21±8.21％，高于对照组细胞存活率50.59％，表明巴马司他能够抑制水母毒素导致的人角质形成细胞(hacat)的死亡。

实施例8:

取4μm的巴马司他溶液与50μg/ml的水母毒素按照体积比1:1混合均匀，在37℃下反应30min后，作为混合液c，待用；

向铺有100μl1×10⁵个/ml人角质形成细胞(hacat)的96孔板中分别加入100μl的混合液c、100μl的按体积比为1:1混合的水母毒素与细胞培养基混合液(对照)及100μl的细胞培养基(空白)，反应24h后，移除上清液，加入mtt反应4h后，加入终止液，24h内用酶标仪测量a490nm，反应设置三个平行。根据以下公式计算细胞存活率。

实验结果显示(参见图2)，当巴马司他与水母毒素(以蛋白计)的质量比为0.038:1时，细胞存活率分别为60.23％、65.66％、57.03％，平均值为60.97±4.36％，高于对照组细胞存活率50.59％，表明巴马司他能够抑制水母毒素导致的人角质形成细胞(hacat)的死亡。

实施例9:

取1μm的巴马司他与50μg/ml的水母毒素按照体积比为1:1混合均匀，在37℃条件下反应30min，作为混合液a，待用；

向铺有1ml1×10⁵个/ml人角质形成细胞(hacat)的细胞培养皿中分别加入1ml的混合液a、1ml的按体积比为1:1混合的水母毒素与细胞培养基混合液(对照)及1ml的细胞培养基(空白)，反应24h后，移除上清液，根据qrt-pcr法测定人角质形成细胞(hacat)中炎症因子il-6和tnf-α的mrna表达量，反应设置三个平行。

如图3所示，当1μm的巴马司他溶液与50μg/ml的水母毒素等体积混合反应后，能够降低人角质形成细胞(hacat)中炎症因子的mrna表达量。

实施例10:

取1μm的巴马司他溶液与50μg/ml的水母毒素按照体积比为1:1混合均匀，在37℃条件下反应30min，作为混合液a，待用；

向铺有1ml1×10⁵个/ml人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)的细胞培养皿中分别加入1ml的混合液a、1ml的按体积比为1:1混合的水母毒素与细胞培养基混合液(对照)及1ml的细胞培养基(空白)，反应24h后，移除上清液，根据qrt-pcr法测定人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)中炎症因子il-6和tnf-α的mrna表达量，反应设置三个平行。

如图4所示，当1μm的巴马司他溶液与50μg/ml的水母毒素等体积混合反应后，能够降低人胚胎成纤维细胞(ccc-esf-1)中炎症因子的mrna表达量。