一种用于治疗皮肤鳞状细胞癌的药物组合物及其制备方法与流程

本发明涉及一种用于治疗皮肤鳞状细胞癌的药物组合物及其制备方法，属于生物医药领域。

背景技术：

皮肤鳞状细胞癌(skimsquamouscellcarcinoma,scc)是一种起源于表皮的恶性肿瘤，在澳大利亚地区，紫外线照射强烈，且居民主要为白色人种，其scc发病率可高达25人/万。scc常见于面部、头皮、下唇、手背等处，患病处易形成溃疡，其基底部隆起外翻，对患者的形象以及身心健康造成巨大影响。随着居民户外活动频率的增加，scc的发病率逐年增加，已成为高发肿瘤之一。目前，临床上治疗scc主要采用手术切除和化疗，但是，这两种方法仍存在诸多不足，如手术切除影响外观，且有复发的风险，而化疗药物为细胞毒药物，对患者身体有一定的毒副作用，常会引起呕吐，脱发，厌食，免疫力下降等症状，给患者身心健康带来伤害。

光动力治疗法(photodynamictherapy，pdt)是近20年发展起来的一种新的治疗恶性肿瘤的方法。其治疗肿瘤的原理是将光敏剂输入人体后以特定波长的光照射病变部位，再利用反应产生的单线态氧(singletoxygen)或自由基(freeradical)氧化破坏组织和细胞中的各种生物大分子，从而使癌细胞发生不可逆损伤而死亡。该方法已成功地应用于膀胱癌、食管癌、支气管癌、口腔癌、皮肤癌、鼻咽癌、肋膜间皮癌、肝癌、喉癌、乳腺癌以及脑癌等的治疗。在杀伤肿瘤细胞的过程中，光敏剂作为能量的载体和反应的桥梁起着决定性的作用。

光动力疗法对肿瘤有双重的选择特异性，能定向地消灭原发和复发肿瘤，很少损伤正常组织，毒副作用小，可使患者免受全身麻醉的危险且简单易行。

光敏剂被认为是光动力疗法临床治疗的核心组成部分，到目前为止，临床上主要使用有两代光敏剂，包括第一代光敏剂血卟啉衍生物(hpd)，第二代光敏剂初卟啉锡、亚甲基兰等。然而，已开发的光敏剂尚存在不足之处，其中：

第一代光敏剂组份复杂，且容易引起皮肤光过敏反应，治疗深度不够；第二代光敏剂虽在第一代的基础上有了很大的改进，但仍有许多缺陷，如：中国发明专利(申请号：cn02806725.8，公开号：cn1531442)中涉及的苝醌，其水溶性较差，在水溶液中稳定性较差，吸收波长的调整幅度不大且分子结构不易进行修饰。

在运用光动力疗法治疗皮肤鳞状细胞癌时，片剂类光敏药物需经患者服下后，随循环系统到达病变组织，不仅用时长，而且药物中含有的其他辅助成分容易对患者身体造成不必要的影响，注射类光敏药物则对药物性能要求相对较高，生产成本大，相比之下，霜剂制剂不仅能直接作用于病变组织，而且性质稳定，能常时间黏附于皮肤表面，有利于药物的释放。

基于此，我们开发了akt和makp细胞信号抑制剂-etnbse耦合物，并联合乙二胺四乙酸锰二钠制成复合药物霜。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明采用光敏剂etnbse，耦合akt和makp细胞信号抑制剂作为光敏药物核心成分，并制成复合霜剂类药物。本发明的目的在于提供一种可有效提高光动力疗效，降低耐药性的akt和makp细胞信号抑制剂耦合etnbse光敏剂复合药物霜，通过光动力疗法治疗皮肤鳞状细胞癌。

本发明的技术方案是，提供一种用于治疗皮肤鳞状细胞癌的药物组合物，该药物组合物包括辅料和活性成分，所述活性成分包括光敏剂耦合物和乙二胺四乙酸锰二钠；其中乙二胺四乙酸锰二钠与光敏剂耦合物的质量比为1:10-30；所述光敏剂耦合物由壳聚糖、透明质酸复合物、光敏剂按3:1:1的摩尔比制成；

其中，透明质酸复合物为摩尔比相同的渥曼青霉素与透明质酸钠复合得到；所述光敏剂的化学结构式为：其中et表示乙基。该光敏剂的缩写为etnbse。

乙二胺四乙酸锰二钠含有的锰离子可有效促进光敏剂产生单线态氧，提高光敏剂耦合物杀灭相近癌细胞的效果。

本发明的光敏剂耦合物包括透明质酸或盐(如透明质钠)、渥曼青霉素、壳聚糖、etnbse。这些物质之间虽然可以形成新和复合结构，但是尚未达到共价键结合的程度，因此，本发明将其称为耦合物。根据初步分析，其可能为钙钛矿型结构。

优选地，该药物组合物为霜剂，辅料即为霜剂基质。

优选地，所述霜剂基质由油相和水相乳化得到，按重量份，油相由羊毛脂5-10份、单硬脂酸甘油酯1-10份、白凡士林15-20份、液体石蜡5-10份组成；水相由蒸馏水30-50份、甘油5-10份、尼泊金乙酯2-4份组成。

优选地，其中乙二胺四乙酸锰二钠与光敏剂耦合物的质量比为1:20。

所述药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将等摩尔比的渥曼青霉素与透明质酸钠混合，得到透明质酸复合物；

(2)将壳聚糖、透明质酸复合物、光敏剂按3:1:1的摩尔比混合，溶于有机溶剂中，超声震荡(80khz)5-20min，再进行离心，取上清液，干燥后得到光敏剂耦合物；

(3)将光敏剂耦合物分散在霜剂基质的油相中，将乙二胺四乙酸锰二钠分散在霜剂基质的水相中，再将油相和水相乳化得到所述药物组合物。

优选地，步骤(2)中，离心的速率为6000～8000r/min。

本发明的有益效果是，本发明制备的药物组合物能直接作用于病变组织，性质稳定，可长时间黏附于皮肤表面，有利于药物的释放，且治疗效果很好。

附图说明

图1为梯度浓度药物组合物处理后，a-431细胞产生的自噬体量示意图。

图2为梯度浓度药物组合物处理后，a-431细胞中lc3b和lamp的相对表达量示意图。

图3为a-431细胞中lc3b，lamp相对表达量与药物组合物浓度的柱状关系图。

图4为梯度浓度药物组合物处理后，a-431细胞中p-akt、p-erk、p-jnk和p-p38相对表达量示意图。

图5为a-431细胞中p-akt、p-erk、p-jnk和p-p38相对表达量与药物组合物浓度的柱状关系图。

图6为400nm药物组合物梯度时间处理后，a-431细胞中p-akt、p-erk、p-jnk和p-p38相对表达量示意图。

图7为a-431细胞中p-akt、p-erk、p-jnk和p-p38相对表达量与药物组合物处理时间的柱状关系图。

图8为经药物组合物的pdt处理后，不同时间段裸鼠肿瘤切片电镜观察示意图。

图9为经药物组合物的pdt处理后，不同时间段裸鼠肿瘤变化情况示意图。

图10为由etnbse、药物组合物分别单独经照光处理后，经mtt分析的a-431细胞活性图。

具体实施方式

下面结合实验和附图对光敏剂耦合物治疗皮肤鳞状细胞癌效果进行详细说明。

实施例1：药物组合物的制备

本实施例的药物组合的制备方法如下：

(1)取羊毛脂5g、单硬脂酸甘油酯2g、白凡士林15g、液体石蜡5g，混合得到油相；取蒸馏水30ml、甘油5g、尼泊金乙酯2g，混合得到水相。将所得油相和水相分别放在一旁备用。

(2)室温下，将0.01mol渥曼青霉素和0.01mol透明质酸钠溶于5ml乙二醇中，充分混合，得到透明质酸复合物。

(3)再依次加入0.03mol壳聚糖和0.01mol光敏剂etnbse充分反应，以80khz的超声震荡，持续10min，再5000r/min离心5min取上清液，5℃下干燥即为光敏剂耦合物。

(4)将所得光敏剂耦合物分散在制得的油相中，取0.2g乙二胺四乙酸锰二钠，将其分散制得的水相中，利用磁力加热搅拌器将水相缓慢加至油相中，直至生成乳白色霜剂即可。

将本实施例制备的药物组合物用于以下实验进行效果评价。

应用例1，药物组合物使鳞状细胞癌产生自噬实施例

(1)实验方法

鳞癌细胞a-431细胞系培养于10％小牛血清的dmem培养液中，添加100iu/l的青霉素和100mg/l的链霉素，置于37℃，5％co2的恒温培养箱中常规培养，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，pbs液冲洗两次，再用0.25％的胰酶和0.02％的edta消化5分钟，将其分瓶培养，2至3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

取对数生长期的a-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于37℃，5％co2的恒温培养箱中常规培养，待生长至80％～90％融合状态时，在每孔中分别加入浓度为0nm，100nm，200nm，400nm，800nm的光敏剂耦合物，孵育1h后，用20j/cm²的红光照射15min，16h后用吖啶橙染色，观察细胞发生自噬的情况。

取对数生长期的a-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于37℃，5％co2的恒温培养箱中常规培养，待生长至80％～90％融合状态时，在每孔中分别加入浓度为0nm，100nm，200nm，400nm，800nm的光敏剂耦合物，孵育1h后，用20j/cm²的红光照射15min，16h后收集细胞提取总蛋白，用westernblot法检测细胞中lc3b，lamp的表达量。

(2)实验结果

a-431细胞经过梯度剂量药物组合物-pdt处理后产生的自噬体染色情况如图1所示，分析结果可得出，a-431细胞产生的自噬体量与药物组合物的浓度梯度呈正相关的关系。

a-431细胞经过梯度剂量药物组合物-pdt处理后自噬关键蛋白lc3b，lamp相对表达量如图2所示。根据图2，分别作出自噬关键蛋白lc3b，lamp相对表达量与药物组合物浓度柱状关系图，如图3所示，分析结果可得出，a-431细胞中lc3b和lamp的表达量在经药物组合物-pdt处理后明显增加，并与药物组合物的剂量成正相关。

实验表明药物组合物-pdt能明显促进鳞状癌细胞系a-431发生自噬，且促进作用随着药物组合物浓度增加而增强。

应用例2，药物组合物-pdt抑制鳞状癌细胞akt和mapk信号实施例

(1)实验方法

鳞癌细胞a-431细胞系培养于10％小牛血清的dmem培养液中，添加100iu/l的青霉素和100mg/l的链霉素，置于37℃，5％co2的恒温培养箱中常规培养，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液，pbs液冲洗两次，再用0.25％的胰酶和0.02％的edta消化5分钟，将其分瓶培养，2至3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

取对数生长期的a-431细胞经胰酶消化后接种于六孔培养板中，置于37℃，5％co2的恒温培养箱中常规培养，待生长至80％～90％融合状态时，在每孔中分别加入浓度为0nm，100nm，200nm，400nm，800nm的药物组合物，孵育1h后，用20j/cm²的红光照射15min，半小时后收集细胞提取总蛋白，用westernblot法检测细胞中p-akt、p-erk、p-jnk和p-p38的表达量。

取对数生长期的a-431细胞经胰酶消化后接种于培养皿中，置于37℃，5％co2的恒温培养箱中常规培养，待生长至80％～90％融合状态时，在每个培养皿中加入400nm药物组合物，孵育1h后，用20j/cm²的红光照射15min，分别于药物组合物-pdt处理0.5h、1h、2h、8h和16h后收集细胞提取总蛋白，用westernblot法检测细胞中p-akt、p-erk、p-jnk和p-p38的表达量。

(2)实验结果

a-431细胞经过梯度剂量药物组合物-pdt处理后其p-akt、p-erk、p-jnk和p-p38相对表达量如图4所示。根据图4，分别作出p-akt、p-erk、p-jnk和p-p38相对表达量与药物组合物浓度柱状关系图，如图5所示。分析结果可得出，在经etnbse-pdt处理后的a-431细胞中，p-akt，p-jnk和p-p38相对表达量随着药物组合物剂量增高明显增加；p-erk相对表达量明显增加，但当药物组合物剂量达到400nm，增强效果逐渐降低。

a-431细胞经过400nm药物组合物-pdt梯度时间处理后其p-akt、p-erk、p-jnk和p-p38相对表达量如图6所示。根据图6，分别作出p-akt、p-erk、p-jnk和p-p38相对表达量与渥曼青霉素-etnbse处理时间柱状关系图，如图7所示。分析结果可得出，在药物组合物-pdt处理a-431细胞后0.5h时，细胞中p-akt、p-erk、p-jnk和p-p38相对表达量达到最高值，随后逐渐回复到正常值。

实验表明药物组合物-pdt对鳞状癌细胞akt和mapk信号通路有明显抑制作用，且在处理时长为0.5小时时抑制作用效果最为明显。

应用例3，药物组合物-pdt治疗皮肤鳞癌细胞瘤实施例

(1)动物实验

小鼠鳞状细胞瘤模型，选用重量为18-20g雄性裸鼠。实验时，取生长良好的a-431细胞，经胰酶消化后用无菌生理盐水按1:10比例稀释后制成肿瘤细胞悬液，每只小鼠左右腋下部接种0.1ml瘤液。待肿瘤接种成功后，给每只裸鼠右侧肿瘤经皮下注射1mm药物组合物药剂，左侧肿瘤不处理作为对照，用20j/cm²的红光照射15min，分别于药物组合物-pdt处理3天、7天、14天和21天后处死一只裸鼠并收集处理肿瘤和未处理肿瘤切片，电镜观察肿瘤产生自噬情况。

另取一只裸鼠左侧肿瘤经皮下注射1mm药物组合物药剂，右侧肿瘤不处理作为对照，用20j/cm²的红光照射15min，于2天、4天、7天、12天、14天、17天和24天观察肿瘤情况。

(2)实验结果

药物组合物-pdt处理后不同时间收集裸鼠肿瘤制作切片，电镜观察结果如图8所示。据观察结果可得出，处理组相比未处理组产生大量自噬体，细胞通过自噬自身凋亡，表明药物组合物-pdt能促进肿瘤块产生自噬。

药物组合物-pdt处理后不同时间观察肿瘤变化情况，观察裸鼠结果如图9所示。据观察结果可得出，随着处理时间的推移，药物组合物-pdt处理后肿瘤块明显坏死并逐渐缩小，表明药物组合物-pdt对鳞状细胞肿瘤有良好的治疗效果。

应用例4，药物组合物-pdt抑制a-431细胞活性

(1)实验方法

将鳞癌细胞a-431细胞系培养于含10％胎小牛血清的培养液中，配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞的标准将所述细胞悬液接种于三个96孔板中，每孔的体积为200ul。向上述三个孔板各孔中分别加入生理盐水、etnbse以及药物组合物400nmol，经激光照射1min后，将所述细胞系置于37℃，5％co2的恒温培养箱中常规培养3天。

培养结束后，向所述孔板的每个孔中加入5mg/ml由pbs配制而成的mtt溶液20ul，并继续在含5％co2的恒温培养箱中孵育4小时，孵育温度为37℃。孵育终止后，小心吸弃所述孔内的培养上清液，离心后，再次吸弃孔内的培养上清液。随后，向所述孔板的每个孔中加入150uldmso，振荡10分钟，待结晶物充分溶解后，将所述孔板置于酶联免疫监测仪中，以评估各孔液体在490nm的吸光度，并记录结果。

(2)实验结果

分别经etnbse、药物组合物处理并用激光照射后的细胞活性如图10所示。由图中结果可知，与对照组相比较而言，光照条件下的etnbse组与药物组合物组的a-431细胞活性均很低，然而，所述两者相较而言，药物组合物的细胞致死率更高，表明本发明药物组合物比etnbse更能抑制a-431细胞的活性。