角膜支架材料的制备方法及角膜支架材料与流程

本发明涉及组织工程技术领域，尤其是涉及一种角膜支架材料的制备方法及角膜支架材料。

背景技术：

角膜是位于眼球最前端的一层透明薄膜，覆盖虹膜、瞳孔及前房，井为眼睛提供大部分屈光力。由于角膜直接与外界环境接触，故极易受到机械外伤、热灼伤以及微生物的感染等，致使角膜发生病变，轻者引起角膜透明度下降影响患者视力，严重者将引起角膜混浊而使患者失明。据who统计，目前全世界角膜病盲患者近6000万人、我国有近500万人，绝大多数患者可以通过角膜移植来治愈，但由于捐献角膜的高度匾乏致使绝大部分患者得不到角膜移植而无法复明。近年来，角膜组织工程的兴起与发展为组织工程角膜的体外重建及其临床应用创造了条件，也为角膜病盲患者通过组织工程角膜的移植重见光明带来了新的希望，但如何获得理想的载体支架仍然是当前组织工程角膜体外重建研究的热点和难点。

在载体支架方面，虽然国内外学者对天然生物材料(包括捐献人角膜基质、胶原、明胶、羊膜、丝素蛋白、壳聚糖、纤维蛋白、角膜后弹力层和异种脱细胞角膜基质等)、人工合成材料(包括聚轻基乙酸、聚乳酸一聚轻基乙酸共聚物等)以及复合材料(即天然材料和人工合成材料通过一定的比例或者特定的方法进行交联和整合)等进行了广泛的研究与探索，但真正能制成满足组织工程角膜规模化体外重建需要的载体支架极少，且均存在一定的缺点和不足。利用胶原、明胶、丝素蛋白等大然生物大分子制成的组织工程角膜载体支架仍存在有结构致密度不足、力学性能欠佳、降解过快等缺陷；人工合成材料制成的组织工程角膜载体支架存在有生物相容性还不够理想、免疫原性较大的缺点。近年来，最接近自然状态的异种(猪等动物来源)角膜基质等天然生物材料经脱细胞处理制成的组织工程角膜载体支架成为研究热点，但其潜在的排斥反应、不同物种角膜曲率不同及伦理问题，使其永远难以成为被国人所接受的最佳载体材料。

由此可见，如何制备具有良好透明性、三维结构和生物相容性的角膜支架材料仍然组织工程角膜规模化体外重建的重点。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种角膜支架材料的制备方法，该方法工艺简便，合理利用医疗资源，适于规模化生产和临床推广应用，且制备得到的角膜支架材料具有良好光学性能、三维结构及生物相容性。

本发明的第二个目的在于提供应用上述制备方法制备得到的角膜支架材料，该角膜支架材料保留有人角膜天然细胞外基质组成成分，具有良好光学性能、三维结构及生物相容性。

本发明提供了一种角膜支架材料的制备方法，所述制备方法包括：

将人角膜基质的匀浆溶液经脱细胞后处理成型，得到所述角膜支架材料；

其中，所述人角膜基质来源于穿透角膜移植术后供体角膜剩余组织、板层角膜移植术后供体角膜剩余组织或全飞秒激光术后角膜基质透镜。

进一步的，所述供体角膜剩余组织为预处理后的供体角膜剩余组织；

优选地，所述预处理包括将供体角膜剩余组织去除角膜周边的巩膜及结膜，并清洗；

优选地，使用无菌pbs溶液进行清洗。

进一步的，所述反复冻融为将所述人角膜基质置于-180～-200℃下降温45～75s后，再自然复温至20-25℃；

每次完成所述复温后，再进行下一次的降温；

优选地，所述降温和所述复温的次数不少于3次。

进一步的，将所述反复冻融后的人角膜基质在-180～-200℃下研磨为粉末状，加水制得所述匀浆溶液；

其中，将所述人角膜基质研磨至150-250目，优选为170-230目；

优选地，使用研磨仪对所述人角膜基质进行研磨；

优选地，使用研磨仪对所述人角膜基质研磨20-40s后，预冷20-40s；

每次完成所述预冷后，再进行下一次的研磨。

进一步的，向所述匀浆溶液中加入dnase与rnase进行脱细胞；

优选地，加入40-60u/mldnase和0.5-2u/mlrnase进行脱细胞；

优选地，还包括脱细胞后进行清洗除杂然后再处理成型的步骤；

优选地，以超纯水进行清洗，以离心的方式进行除杂；

优选地，以8000-12000rpm离心20-40min进行除杂，最终收集沉淀。

进一步的，所述处理成型包括：

将脱细胞后的匀浆溶液于真空环境下冻干，得到白色海绵状物质，将所述白色海绵状物质溶于水得到的角膜组织混悬液加入模具中，风干然后成型；

优选地，所述角膜组织混悬液的浓度为1-100mg/ml，优选为2-80mg/ml，更优选为5-60mg/ml；

优选地，于恒温恒湿环境中风干；

优选地，所述恒温的温度为20-30℃，优选为22-28℃，更优选为25-27℃；

优选地，所述恒湿的湿度为70％-95％，优选为75％-90％，更优选为80％-85％；

优选地，所述风干的时间为60-80个小时。

进一步的，在处理成型后还包括交联反应的步骤；

优选地，将成型后的角膜支架材料浸泡于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺交联反应水溶液中进行交联反应；

优选地，所述交联反应的温度为3-5℃；

优选地，所述交联反应的时间为20-30个小时。

进一步的，在交联反应后还包括清洗的步骤；

优选地，将所述角膜支架材料用超纯水清洗10-15小时；

优选地，在清洗过程中每20-40min更换一次超纯水。

进一步的，还包括将得到的角膜支架材料进行灭菌的步骤；

优选地，采用物理方法进行灭菌，优选采用射线照射的方法进行灭菌，更优选采用钴60照射进行灭菌。

另外，本发明还提供了一种角膜支架材料，应用上述的制备方法制备得到。

本发明提供的角膜支架材料的制备方法，将人角膜基质的匀浆溶液经脱细胞后处理成型，得到角膜支架材料。该方法工艺简便，合理利用医疗资源，适于规模化生产和临床推广应用。该方法使用人角膜基质匀浆为原料，在保留角膜天然细胞外基质组成成分的基础上重建出人工角膜支架材料，一方面使制备得到的角膜支架材料具有良好光学性能、三维结构及生物相容性。另一方面，通过脱细胞去除角膜中残留的抗原成分，可降低角膜移植术后排斥反应发生几率，提高移植成功率。

另外，本发明还提供了应用上述制备方法制备得到的角膜支架材料，该角膜支架材料保留有角膜天然细胞外基质组成成分，具有良好光学性能、三维结构及生物相容性。同时，还能够降低角膜移植术后排斥反应发生几率，提高移植成功率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实验例2提供的角膜支架材料的透明度结果图；

图2为本发明实验例2提供的角膜支架材料的he染色结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种角膜支架材料的制备方法，包括：

将人角膜基质的匀浆溶液经脱细胞后处理成型，得到角膜支架材料；

其中，所述人角膜基质为穿透角膜移植术后供体角膜剩余组织、板层角膜移植术后供体角膜剩余组织或全飞秒激光术后角膜基质透镜。

本发明提供的角膜支架材料的制备方法，该方法工艺简便，合理利用医疗资源，适于规模化生产和临床推广应用。该方法使用异种角膜基质匀浆为原料，在保留角膜天然细胞外基质组成成分的基础上重建出人工角膜支架材料，一方面使制备得到的角膜支架材料具有良好光学性能、三维结构及生物相容性。另一方面，通过脱细胞去除角膜中残留的抗原成分，能够降低角膜移植术后排斥反应发生几率，提高移植成功率。

在一些优选的实施方式中，供体角膜剩余组织为预处理后的供体角膜剩余组织。

优选地，所述预处理包括将供体角膜剩余组织去除角膜周边的巩膜及结膜，并清洗。

去除角膜周边的巩膜及结膜，能够使制备得到的角膜支架材料仅保留角膜天然细胞外基质组成成分，而不含其它成分杂质，保证角膜支架材料的各项性能。

优选地，使用无菌pbs溶液进行清洗，优选清洗三遍。

在一些优选的实施方式中，反复冻融为将所述人角膜基质置于-180～-200℃下降温45～75s后，再自然复温至20-25℃。

其中，降温的环境温度例如可以为，但不限于-180℃、-185℃、-190℃、-195℃或-200℃。降温的时间例如可以为，但不限于45s、50s、55s、60s、65s或70s。复温的环境温度例如可以为，但不限于20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃。

每次完成复温后，再进行下一次的降温。

其中，降温与复温的次数相同。

优选地，降温和复温的次数不少于3次，例如可以为，但不限于3次、4次、5次或6次。

反复冻融能够使细胞中的水形成结晶，导致剩余细胞液中盐浓度增高，由于细胞内冰粒形成，剩余细胞液中盐浓度的增高可以使细胞破裂，从而达到仅保留角膜天然细胞外基质组成成分的目的。

优选使用pbs溶液漂洗，对人角膜基质进行复温。

在一些优选的实施方式中，将反复冻融后的人角膜基质在-180～-200℃下研磨为粉末状，加水制得所述匀浆溶液。

其中，研磨的环境温度例如可以为，但不限于-180℃、-185℃、-190℃、-195℃或-200℃。

其中，将所述人角膜基质研磨至150-250目，例如可以为，但不限于150目、160目、170目、180目、190目、200目、210目、220目、230目、240目或250目，优选为170-230目。

优选地，使用研磨仪对所人角膜基质进行研磨。

使用研磨仪进行研磨，能够使研磨更充分、更彻底，并且有效节约人力成本和时间成本。市售的研磨仪均可。

优选地，使用研磨仪对所述人角膜基质研磨20-40s后，预冷20-40s。

其中，研磨时间例如可以为，但不限于20s、25s、30s、35s或40s，预冷时间例如可以为，但不限于20s、25s、30s、35s或40s。

每次完成所述预冷后，再进行下一次的研磨。

将研磨与预冷相结合，能够保证研磨时的环境温度保持在-180～-200℃的低温环境下，避免因摩擦产热。

在一些优选的实施方式中，向匀浆溶液中加入dnase与rnase进行脱细胞。

dnase即deoxyribonuclease，中文名称为脱氧核糖核酸酶，是一种可以消化单链或双链dna产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。rnase即ribonuclease，中文名称为核糖核酸酶，是一类催化rna降解为小片段的核酸酶。

使用上述两种酶进行脱细胞处理，能够使制备得到的角膜支架材料的抗原性小，避免排斥反应。

优选地，加入40-60u/mldnase和0.5-2u/mlrnase进行脱细胞。

其中，dnase的加入量例如可以为，但不限于40u/ml、45u/ml、50u/ml、55u/ml或60u/ml；rnase的加入量例如可以为，但不限于0.5u/ml、1u/ml、1.5u/ml或2u/ml。

优选地，还包括脱细胞后进行清洗除杂然后再处理成型的步骤。

进行清洗和除杂，能够保证更好的脱细胞效果。

优选地，以超纯水进行清洗，以离心的方式进行除杂；

优选地，以8000-12000rpm离心20-40min进行除杂，最终收集沉淀。

其中，离心的速度例如可以为，但不限于8000rpm、9000rpm、10000rpm、11000rpm或12000rpm，离心的时间例如可以为，但不限于20min、25min、30min、35min或40min。

在一些优选的实施方式中，处理成型包括：

将脱细胞后的匀浆溶液于真空环境下冻干，得到白色海绵状物质，将所述白色海绵状物质溶于水得到的角膜组织混悬液加入模具中，风干然后成型。

优选地，所述角膜组织混悬液的浓度为1-100mg/ml，例如可以为，但不限于1mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml，优选为2-80mg/ml，更优选为5-60mg/ml；

成型可根据角膜病灶的部位及大小个性化定制角膜支架材料，通过改变角膜组织混悬液浓度分别制作出不同厚度需求的支架材料，针对例如感染性角膜炎、圆锥角膜、角膜内皮失代偿等疾病钻取病灶范围所需植片大小。

优选地，于恒温恒湿环境中风干。

优选地，所述恒温的温度为20-30℃，例如可以为，但不限于20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，优选为22-28℃，更优选为25-27℃；

优选地，所述恒湿的湿度为70％-95％，例如可以为，但不限于70％、75％、80％、85％、90％或95％，优选为75％-90％，更优选为80％-85％；

优选地，所述风干的时间为60-80个小时，例如可以为，但不限于60个小时、65个小时、70个小时、75个小时或80个小时。

在一些优选的实施方式中，在处理成型后还包括交联反应的步骤。

优选地，将成型后的角膜支架材料浸泡于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺交联反应水溶液中进行交联反应。

edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)是个可溶于水的碳二亚胺，用于蛋白质与核酸的交联和免疫偶连物的制取，其与nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)连用，能够提高偶联效率。

使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的水溶液作为交联反应液，能够有效提升角膜支架材料的力学性能。

优选地，所述交联反应的温度为3-5℃，例如可以为，但不限于3℃、4℃或5℃。

优选地，所述交联反应的时间为20-30个小时，例如可以为，但不限于20个小时、22个小时、24个小时、26个小时、28个小时或30个小时。

在一些优选的实施方式中，在交联反应后还包括清洗的步骤；

优选地，将所述角膜支架材料用超纯水清洗10-15小时。

其中，超纯水清洗的时间例如可以为，但不限于10小时、11小时、12小时、13小时、14小时或15小时。

优选地，在清洗过程中每20-40min更换一次清洗液，例如可以为，但不限于20min、25min、30min、35min或40min。

在一些优选的实施方式中，还包括将得到的角膜支架材料进行灭菌的步骤。

灭菌能够保证角膜支架材料为无菌状态，便于贮藏和使用。

优选地，采用物理方法进行灭菌，优选采用射线照射的方法进行灭菌，更优选采用钴60照射进行灭菌。

采用物理方法进行灭菌，避免使用任何有毒的化学试剂或药品，安全性更高。

另外，本发明还提供了一种角膜支架材料，应用上述的制备方法制备得到。

该角膜支架材料保留有角膜天然细胞外基质组成成分，具有良好光学性能、三维结构及生物相容性。同时，还能够降低角膜移植术后排斥反应发生几率，提高移植成功率。

下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1

本实施例提供了一种角膜支架材料，其制备方法包括如下步骤：

(a)、在生物安全柜内的解剖显微镜下，将穿透角膜移植术后供体角膜剩余组织去除角膜周边的巩膜及结膜，用无菌pbs溶液(1×)洗三遍，再将初步处理后的角膜组织置入超低温冰箱储存。

(b)、取出用无菌pbs溶液(1×)漂洗复温，再置入-180℃低温环境，75s后再次复温至20℃，反复进行3次，然后用无菌pbs反复冲洗干净。

(c)、去除表面水分后放入研磨容器中置入-180℃低温环境，用研磨仪20s运行——20s预冷，三个循环后打碎成粉末，加入超纯水混匀成匀浆溶液，匀浆溶液的浓度为1mg/ml。

(d)、加入40u/mldnasei与2u/mlrnase2h进行脱细胞处理，然后用超纯水以8000rpm40min反复清洗三次，收集最终沉淀。

(e)、置于-80℃中20h冻实后放入真空冷冻干燥机，冻干成白色海绵状。

(f)、将冻干后的海绵状物质溶于超纯水中，磁力搅拌4h得到角膜组织混悬液。

(g)、将角膜组织混悬液加入模具中，于温度20℃，湿度95％环境中风干3天，得到角膜支架材料。

(h)、配制edc/nhs交联反应水溶液，将角膜支架材料浸泡于其中，于4℃放置20h待交联反应完全。

(i)、将角膜支架材料用超纯水清洗1h，每40min更换一次清洗液。

(j)、密封后钴60灭菌，-20℃下保存备用。

实施例2

本实施例提供了一种角膜支架材料，其制备方法包括如下步骤：

(a)、在生物安全柜内的解剖显微镜下，将板层角膜移植术后供体角膜剩余组织去除角膜周边的巩膜及结膜，用无菌pbs溶液(1×)洗三遍，再将初步处理后的角膜组织置入超低温冰箱储存。

(b)、取出用无菌pbs溶液(1×)漂洗复温，再置入-200℃低温环境，45s后再次复温至25℃，反复进行3次，然后用无菌pbs反复冲洗干净。

(c)、去除表面水分后放入研磨容器中置入-200℃低温环境，用研磨仪40s运行——40s预冷，三个循环后打碎成粉末，加入超纯水混匀成匀浆溶液，匀浆溶液的浓度为100mg/ml。

(d)、加入60u/mldnasei与0.5u/mlrnase2h进行脱细胞处理，然后用超纯水以12000rpm20min反复清洗三次，收集最终沉淀。

(e)、置于-80℃中30h冻实后放入真空冷冻干燥机，冻干成白色海绵状。

(f)、将冻干后的海绵状物质溶于超纯水中，磁力搅拌4h得到角膜组织混悬液。

(g)、将角膜组织混悬液加入模具中，于温度30℃，湿度70％环境中风干3天，得到角膜支架材料。

(h)、配制edc/nhs交联反应水溶液，将角膜支架材料浸泡于其中，于4℃放置30h待交联反应完全。

(i)、将角膜支架材料用超纯水清洗3h，每20min更换一次清洗液。

(j)、密封后钴60灭菌，-20℃下保存备用。

实施例3

本实施例提供了一种角膜支架材料，其制备方法包括如下步骤：

(a)、在生物安全柜内的解剖显微镜下，将全飞秒激光术后角膜基质透镜用无菌pbs溶液(1×)洗三遍，置入超低温冰箱储存。

(b)、取出用无菌pbs溶液(1×)漂洗复温，再置入液氮中，1min后再次复温至22℃，反复进行3次，然后用无菌pbs反复冲洗干净。

(c)、去除表面水分后放入研磨容器中置入液氮中，用研磨仪30s运行——30s预冷，三个循环后打碎成粉末，加入超纯水混匀成匀浆溶液，匀浆溶液的浓度为50mg/ml。

(d)、加入50u/mldnasei与1u/mlrnase2h进行脱细胞处理，然后用超纯水以10000rpm30min反复清洗三次，收集最终沉淀。

(e)、置于-80℃中24h冻实后放入真空冷冻干燥机，冻干成白色海绵状。

(f)、将冻干后的海绵状物质溶于超纯水中，磁力搅拌4h得到角膜组织混悬液。

(g)、将角膜组织混悬液加入模具中，于温度25℃，湿度80％环境中风干3天，得到角膜支架材料。

(h)、配制edc/nhs交联反应水溶液，将角膜支架材料浸泡于其中，于4℃放置24h待交联反应完全。

(i)、将角膜支架材料用超纯水清洗2h，每30min更换一次清洗液。

(j)、密封后钴60灭菌，-20℃下保存备用。

实施例4

本实施例提供了一种角膜支架材料，其制备方法包括如下步骤：

(a)、在生物安全柜内的解剖显微镜下，将全飞秒激光术后角膜基质透镜，用无菌pbs溶液(1×)洗三遍，置入超低温冰箱储存。

(b)、取出用无菌pbs溶液(1×)漂洗复温，再置入-150℃低温环境，30s后再次复温至30℃，反复进行3次，然后用无菌pbs反复冲洗干净。

(c)、去除表面水分后放入研磨容器中置入-150℃低温环境，用研磨仪45s运行——45s预冷，三个循环后打碎成粉末，加入超纯水混匀成匀浆溶液，匀浆溶液的浓度为2mg/ml。

(d)、加入30u/mldnasei与3u/mlrnase2h进行脱细胞处理，然后用超纯水以6000rpm45min反复清洗三次，收集最终沉淀。

(e)、置于-80℃中24h冻实后放入真空冷冻干燥机，冻干成白色海绵状。

(f)、将冻干后的海绵状物质溶于超纯水中，磁力搅拌4h得到角膜组织混悬液。

(g)、将角膜组织混悬液加入模具中，于温度15℃，湿度60％环境中风干3天，得到角膜支架材料。

(h)、配制edc/nhs交联反应水溶液，将角膜支架材料浸泡于其中，于4℃放置15h待交联反应完全。

(i)、将角膜支架材料用超纯水清洗1h，每30min更换一次清洗液。

(j)、密封后钴60灭菌，-20℃下保存备用。

实验例1

本实验例选用实施例1提供的角膜支架材料进行后续实验。

1、透明度实验

将实施例3提供的的角膜支架材料浸泡于pbs溶液中24小时饱和吸水，用滤纸吸除表面水分，观察其透明情况，并进行拍照记录。

结果如图1所示，从图1中可以看出，本发明提供的角膜支架材料的透明度良好。

2、he染色实验

(1)石蜡切片：将重建的角膜支架材料浸泡于pbs溶液中24小时饱和吸水，经pfa固定后，常规石蜡包埋，切片。切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯(i)5min；二甲苯(ⅱ)5min；100％乙醇2min；95％的乙醇1min；80％乙醇1min；75％乙醇1min；pbs洗2min。

(2)苏木素染色5min，pbs洗5min。

(3)盐酸乙醇分化30s。

(4)pbs洗三次5min。

(5)置伊红液2min。

(6)常规脱水，透明，封片：95％乙醇(i)1min；95％乙醇(ⅱ)5min；100％乙醇(i)5min；100％乙醇(ⅱ)5min；二甲苯(i)5min；二甲苯(ⅱ)5min；二甲苯(iii)5min；中性树脂封固。

(7)光学显微镜下观察、拍片。

结果如图2所示，从图2中可以看出，本发明提供的角膜支架材料，结构完整连续，脱细胞效果明显。经过重建过程保留了角膜细胞外基质成分。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。