一种金雀根提取物的制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种金雀根提取物的制备方法，属于医药技术领域。

背景技术：

类风湿性关节炎(ra)是一种以慢性滑膜炎、软骨和骨破坏为特征的自身免疫性疾病，是造成人群致残主要病因之一。ra影响全球成年人口的百分之一左右，给患者造成较高的经济损失和沉重的负担。导致ra的原因及生理病理机制尚未完全阐明。目前，ra治疗的一线药物主要包括非甾体类抗炎药，糖皮质激素和糖皮质激素抗细胞因子药物，但其效果相对有限，且不良反应发生率高，价格也相对较高。因此急需开发新型高效且安全的ra治疗药物。

金雀根始载于《本草纲目拾遗》，为豆科植物锦鸡儿属植物锦鸡儿caraganasinica(buc，hoz)rehd根或根皮。异名阳雀花根皮，板参、阳雀花根、土黄芪、野黄芪。为落叶灌木，生于林绿、路旁灌丛中或村庄附近，广泛分布于河北、陕西、河南等省区。金雀根具有清肺益脾、活血通脉之功效，主治虚损劳热、咳嗽、高血压，妇女白带，血崩，关节痛风、跌打损伤、胃下垂，乳汁不足等。

金雀根中主要的化学有效成分为生物碱、甙类、皂甙和淀粉等，近年来的研究表明，金雀根提取物中还含有异黄酮，二苯乙烯类等类植物激素样化合物，因此其生理作用和生物活性是多样的。毒理研究证明金雀根无毒，小鼠腹腔注射金雀根醇提物的半数致死量(ld50)为10.4g/kg，相当于生药309.7g/kg。另有报道，甲醇提取物50g/kg灌服对小鼠未引起死亡。现有技术中，有关金雀根中活性成分提取的介绍较少，也鲜有以金雀根提取物治疗类风湿性关节炎方面的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种金雀根提取物的制备方法。

技术方案

一种金雀根提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)取金雀根药材，粉碎后得到金雀根粉末，加入乙醇溶液进行回流提取，将得到的提取液浓缩并干燥，得到金雀根总浸膏；

(2)将金雀根总浸膏用水分散后，得到金雀根分散液，然后用石油醚萃取2-4次，得到水相和有机相，有机相除去石油醚后，得到金雀根石油醚部位；

(3)将步骤(2)中石油醚萃取后得到的水相用氯仿萃取2-4次，得到有机相和水相，有机相除去氯仿后，得到金雀根氯仿部位；

(4)将氯仿萃取后得到的水相用乙酸乙酯萃取2-4次，得到金雀根乙酸乙酯部位，除去乙酸乙酯后，得到金雀根乙酸乙酯部位，将其冷冻干燥，即得本发明的金雀根提取物。

步骤(1)中，乙醇溶液的体积浓度为80％。

步骤(1)中，回流提取的次数为2-5次，每次提取时间为2小时，每次回流提取时，乙醇溶液的用量为金雀根粉末重量的8倍(v/w)。

步骤(2)中，金雀根分散液的浓度为70-90g/l。

步骤(2)中，每次萃取，石油醚用量为金雀根分散液体积的1-3倍量。

步骤(3)中，每次萃取，氯仿用量为石油醚萃取后得到的水相体积的1-3倍量。

步骤(4)中，每次萃取，乙酸乙酯用量为氯仿萃取后得到的水相体积的1-3倍量。

上述制备方法制得的金雀根提取物用于治疗类风湿性关节炎的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种金雀根提取物的制备方法，本发明采用溶剂萃取法纯化金雀根的有效部位，工艺简单，效率高，易于实现产业化，制得的金雀根提取物可以用于治疗类风湿性关节炎。

附图说明

图1为给药后各组大鼠的足趾肿胀程度；

图2为给药后各组大鼠血清中il-1β的浓度；

图3为给药后各组大鼠血清中tnf-α的浓度；

图4为给药后各组大鼠血清中il-6的浓度。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种金雀根提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)取金雀根药材，粉碎后得到10kg金雀根粉末，加入80v％的乙醇溶液回流提取3次(每次乙醇溶液用量为80l，每次提取时间为2小时)，合并提取液并浓缩、干燥，得到金雀根总浸膏0.8kg；

(2)将0.2kg金雀根总浸膏用2.5l水分散后，得到金雀根分散液，然后用石油醚萃取3次(每次萃取，石油醚用量为金雀根分散液体积的1倍量)，得到水相和有机相，将有机相用旋转蒸发仪除去石油醚后，冷冻干燥，得到18g金雀根石油醚部位；

(3)将步骤(2)中石油醚萃取后得到的水相用氯仿萃取3次(每次萃取，氯仿用量为石油醚萃取后得到的水相体积的1倍量)，得到有机相和水相，将有机相用旋转蒸发仪除去氯仿后，冷冻干燥，得到13g金雀根氯仿部位；

(4)将氯仿萃取后得到的水相用乙酸乙酯萃取3次(每次萃取，乙酸乙酯用量为氯仿萃取后得到的水相体积的1倍量)，得到金雀根乙酸乙酯部位，将有机相用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯后，得到金雀根乙酸乙酯部位，将其冷冻干燥，得到41g金雀根提取物。

1.实施例1制得的金雀根提取物中总黄酮含量测定

对照品的制备：精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品适量，用70％乙醇定容至刻度，制成质量浓度为125μg·ml^-1的溶液，摇匀，备用。

供试液的制备：精密称取乙酸乙酯部分100mg，加70％乙醇定容至100ml，摇匀，用滤头过滤，滤液即得供试液。

标准曲线的制备：精密移取对照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml分别置于10ml具塞试管中，以70％乙醇补足为4ml，加5％亚硝酸钠0.4ml，放置6min后加10％硝酸铝0.4ml，放置6min，再加4％氢氧化钠4ml，用70％乙醇定容，摇匀，放置15min。处理后，于500nm处测定吸光度，建立回归方程y＝0.0102x-0.0064(y为吸光度，x为芦丁浓度)，r＝0.9992。取供试液1ml于10ml具塞试管中，设3个重复，以70％乙醇补足为4ml，加5％亚硝酸钠0.4ml，放置6min后加10％硝酸铝0.4ml，放置6min，再加4％氢氧化钠4ml，用70％乙醇定容，摇匀，放置15min处理后，于500nm处测定吸光度，利用标准曲线a测定并计算金雀根提取物中黄酮含量。

实验结果：计算出1ml供试品中所含的总黄酮的量平均为34.68μg/ml，换算得金雀根提取物中总黄酮百分含量为3.47％。

2.金雀根提取物对佐剂型关节炎大鼠的治疗作用

(1)实验材料：成年雄性160～180gsd大鼠(济南鹏悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号：scxk(鲁)2014-0007)。主要仪器：足趾容积测量仪(pv200，成都泰盟科技有限公司)、酶标仪(bio-rad550)、离心机(德国eppendorf公司)、不完全弗氏佐剂(sigma公司,美国)、tnf-α，il-6，il-1的elisa试剂盒(杭州联科生物公司)。

实验造模及给药：bcg于80℃水浴灭活1h,用不完全弗式佐剂制成10mg/ml的乳剂,得弗氏完全佐剂(cfa)。

(2)实验方法：实验前将大鼠称重，随机均分为7组，自由饮食、进水。分为正常组、模型组、阿司匹林(aspirin)组(50mg/kg)、金雀根总浸膏高剂量组(400mg/kg)、金雀根总浸膏低剂量组(100mg/kg)、实施例1金雀根提取物高剂量组(200mg/kg)，实施例1金雀根提取物低剂量组(50mg/kg)七组。除正常组以外,其余各组均用cfa进行造模,造模时,选取大鼠右后足垫注射0.1mlcfa,正常组用同样方法注射生理盐水0.1ml。确保除正常组8只外，每组造模成功大鼠8只。各组每天给药一次，固定灌胃时间，灌胃2周，期间注意观察记录大鼠体重(每7天称重一次)和足爪肿胀程度(用足趾容积测量仪测量造模前日和造模9日后各组大鼠足趾肿胀程度，此后每6天测量一次)。2周后，停止用药。杀掉大鼠，检测大鼠血液中炎症因子的含量(大鼠血清tnf-α、il-1β、il-6水平测定:给药后第15天,3％戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉,腹主动脉取血4-6ml,静置0.5h,3000r/min离心10min,收集上清于ep管中,-80℃冰箱中待测。放射免疫法测定tnf-α、il-1β、il-6,操作步骤按说明书进行)。

(3)实验结果：

数据结果用mean±sd表示，采用spss20.0进行统计分析，体重，足容积的前后变化用两个重复测量因素的方差分析，其余数据进行单因素方差分析，p<0.05时认为差异有统计学意义，p＜0.01表示具有极显著性差异。

1)正常组大鼠精神振奋，活跃好动，毛色发亮，体重增长较明显；模型组大鼠毛色发黄，精神萎靡，瘫坐不动，在实验后2周体重有降低。模型组大鼠足趾原发侧及继发侧均明显发红、肿胀，足趾明显增厚，反应迟钝；总浸膏组(400mg/kg)，实施例1金雀根提取物高剂量组(200mg/kg)，实施例1金雀根提取物低剂量组(50mg/kg)大鼠可见足趾及关节部位原发侧及继发侧稍轻微的红肿，进食饮水较多，活跃情况及毛色亮度明显改善，但不及正常组，以高剂量组更明显，可能有剂量依赖性；阿司匹林组大鼠足趾及关节红肿情况较模型组减轻，但整体精神状态、饮食活动等不及实施例1金雀根提取物高剂量组(200mg/kg)和总浸膏(400mg/kg)组，如表2所示:

表2

2)大鼠足趾肿胀度比较

足趾肿胀度是反应aa模型关节炎症轻重程度的外部客观指标。实验结果表明(图1，与正常组相比，^##p<0.01；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01)，各组大鼠在致炎后的第9天，模型组大鼠足趾肿胀度与正常组比较有显著性差异(p<0.01)，在致炎后第14天左右模型组大鼠足趾肿胀达到高峰(p<0.01)，各组给药14天后，总浸膏(400mg/kg)，实施例1金雀根提取物(200mg/kg，50mg/kg)与阳性药阿司匹林(50mg/kg)均有很好的抑制模型大鼠足趾肿胀的作用，与模型组比较差异性非常显著(p<0.01)，且实施例1金雀根提取物高剂量组(200mg/kg)效果最好。结果说明实施例1金雀根提取物能明显降低aa模型大鼠的足趾肿胀程度。

3)大鼠血清il-1β、tnf-α、il-6水平比较

药物治疗14d后，大鼠血清il-1β、tnf-α、il-6水平分别见图2、图3和图4(与正常组相比，^###p<0.001；与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。可以看出，与正常组相比，模型组il-lβ、il-6和tnf-α水平显著升高(p＜0.001)。不同剂量的实施例1金雀根提取物组(200mg/kg；50mg/kg)tnf-α、il-1β和il-6水平显著低于模型组(p＜0.01或p＜0.05或p＜0.001)。实施例1金雀根提取物(200mg/kg)和总浸膏(400mg/kg)给药可以显著降低模型大鼠血清中il-lβ、il-6和tnf-α含量(p<0.001)，且实施例1金雀根提取物效果比总浸膏效果较好。鉴于上述药效实验结果，实施例1金雀根提取物具有显著抗类风湿性关节炎活性，因此可用于制备抗类风湿性关节炎及其他相关免疫性和炎性疾病药物、保健药物或食品。