本发明涉及医药技术领域，尤其是一种含有牛膝总皂苷、龙胆苦苷和丹参酮iia的治疗膝骨关节炎的药物组合物。
背景技术：
孟河医派等中医流派研究的兴盛，与近年来对中国传统文化的重视与回归关系密切。中医需要创新，更需要继承，在继承基础上的创新，才符合中医发展的规律与要求。只有传统理论与方法继承基础上的创新，才是中医真正的创新中药配伍是传统中医药理论的特色和精华。药对是历代中医药学家在长期遣方用药过程中积累起来的简约而精妙的经验总结，尽管只是两药相合、却搭配巧妙、比例得当，能很好的诠释中药“合群妙用”的特点。挖掘中医流派中的常用药对，发现其优异的治疗作用，是现代中医药工作者应该肩负的责任。
膝骨关节炎(kneeosteoarthritis,koa)是一种退行性关节病，又名膝关节增生性关节炎、退行性骨关节炎等，以关节软骨的退变为主要病理特征，并累及关节滑膜、关节囊等关节周围组织的慢性炎症反应，以及关节周围骨赘形成、半月板退变、关节间隙狭窄等病理改变，从而导致膝关节肿胀、疼痛、活动障碍、畸形等临床症状，严重影响患者的生活质量，是老年人最常见的疾病之一。我国著名骨科管家邱贵兴院士的报告指出40岁以下人群的发病率约5％，60～75岁人群发病率高于5％，75岁以上人群发病率高达80％。我国六次人口普查数据显示60岁以上老年人占13.26％，随着老年人口比重的上升，其患病率也随之升高，给个人、家庭、社会带来了沉重的医疗经济负担，严重影响中老年人的日常生活和生活质量。
长期以来，孟河医派对痹症的治疗一直都有研究和相应的临床治疗文案记载。在《孟河四家医集》中，孟河名医费伯雄将痹症单列一章，并详细阐述了痹症的病因病机和经验方，指出“夫六淫之邪，暑燥火为阳，风寒湿为阴。阴气迭乘，营卫不通，经脉阻滞，进骨肉三部俱病，而三痹之症作矣”，并指出可用三痹汤、自制温经养荣汤、龙火汤、立极汤等分别治疗风痹(行痹)、痛痹、着痹。孟河名医马培之在“鹤膝风”章节中指出，“肝肾阴亏、阳明湿热下注者，膝肿热痛者，切不可进辛温助热耗阴”等，认为“所以诊治之时，须认定寒热、凭脉用药，斯无贻误”。
经过调研，我们发现在孟河医家治疗痹证的医案中，却是将通络、养营作为常用治法。已有文献报道孟河医派在治疗痹症用药中，常用药对包括“秦艽-牛膝”等。秦艽祛风湿、止痹痛、清虚热；牛膝逐瘀通经，补肝肾，强筋骨，利尿通淋，引血下行。二药合用，共凑通络止痛与养营清热之功。
秦艽为龙胆科植物秦艽(或麻花秦艽、粗茎秦艽、小秦艽)的干燥根。其味辛、苦，性平。归胃、肝、胆经，具有祛风湿，止痹痛，退虚热，清湿热等功效，传统用于风湿痹痛，筋脉拘挛，骨节酸痛等症，现代药理研究表明秦艽具有抗炎、镇痛、镇静、解热等作用，且相关药理作用与秦艽中含有的环烯醚萜苷类如龙胆苦苷等有一定的关联。其中龙胆苦苷为环烯醚萜类化合物，口服后在胃中容易被胃酸水解，且由于其水溶性差，一般溶于热水或醇类等有机试剂，故不易吸收。
牛膝为苋科植物牛膝的干燥根，其味苦、酸，性平。归肝肾经，具有补肝肾、强筋骨，并能“引诸药下行”等功效，在治疗骨关节疾病的使用频率中居首位。但牛膝引药下行的药效物质基础及作用机制尚不清楚，已有研究表明与牛膝中含有的昆虫变态活性甾酮类成分如蜕皮甾酮、多糖类和三萜皂苷类成分等均有一定关联。其中皂苷类成分的苷元具有一定的亲脂性，糖链又具有较强的亲水性，使皂苷类本身成为一种表面活性剂。
丹参为唇形科植物的干燥根和根茎，其味苦、微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀、止痛、凉血消痈的功效，是骨伤科临床常用的活血类药物。已有研究表明，丹参的抗炎作用主要与丹参中含有的丹参酮iia有关。其中丹参酮iia几乎难溶于水，影响口服给药的吸收。
mmp-1，又称为胶原酶-1，是第一个被定性和从人成纤维细胞中纯化出来的mmp，有研究表明mmp-1在人koa滑膜液中明显增高。在软骨退变过程中mmp-1表达最稳定，软骨退变越严重，mmp-1表达越高。
mmp-3，又称为间质溶解素mmp-3，在koa中起着很重要的作用，既往研究表明，koa患者血清和关节液中mmp-3含量较健康人增高，且mmp-3由软骨细胞、成纤维细胞、成骨细胞分泌，koa关节软骨滑液中mmp-3表达增高水平与软骨破坏程度相一致。
技术实现要素：
本发明的目的是：提供一种含有牛膝总皂苷、龙胆苦苷和丹参酮iia的治疗膝骨关节炎的药物组合物，该组合物具有良好的抗炎和软骨保护的作用；将龙胆苦苷、秦艽总皂苷和丹参酮iia配伍后，可显著抑制关节滑液中mmp-1(p<0.01)和mmp-3(p<0.05)在软骨细胞中的表达，并刺激软骨细胞增生，具有良好的抗炎和软骨保护的作用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种治疗膝骨关节炎的药物组合物，所述药物组合物的有效成分包括龙胆苦苷和牛膝总皂苷。
进一步的，所述龙胆苦苷和牛膝总皂苷的质量比为1:5～5:1。
进一步的，所述龙胆苦苷和牛膝总皂苷的质量比为1:3。
进一步的，还包括丹参酮iia。
进一步的，所述龙胆苦苷、牛膝总皂苷、丹参酮iia质量比为1～5:1～5:1～5。
进一步的，所述龙胆苦苷、牛膝总皂苷、丹参酮iia质量比为1:3:1。
进一步的，其特征在于，所述牛膝总皂苷的制备方法如下：牛膝经水或0.1～30％乙醇提取，浓缩至相对密度为1.02～1.10，采用d101或hpd100大孔树脂进行纯化，纯化后的提取物中牛膝总皂苷含量不少于50％。
进一步的，所述药物组合物配制成口服制剂使用。
进一步的，所述药物组合物用于治疗膝骨关节炎病症。
采用本发明的技术方案的有益效果是：
中医配伍以治疗主症的药物为君、增强或协同君药疗效为臣、治疗次证为佐、减毒或调和诸药为使。本发明在中医理论基础上，研究孟河医派用药历史规律，创新药物组合方式，以更具有疗效的中药提取物进行组合配伍，其中龙胆苦苷为主要治疗药物作为君，含有50％总皂苷有效部位的牛膝总皂苷为臣、丹参酮iia抗炎镇痛为佐，通过牛膝引血下行的中医理论和皂苷类成分作为表面活性剂有潜在的促吸收性能，促进龙胆苦苷和难溶性药物丹参酮iia对膝骨关节炎的治疗作用。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但是这些实施例不是对本发明保护范围的限制。此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本发明实施例提供了一种用于治疗膝骨关节炎的药物组合物，药物组合物的有效成分包括龙胆苦苷和牛膝总皂苷，龙胆苦苷和牛膝总皂苷的质量比为1:5～5:1，优选为1:3。
实施例2
本发明实施例提供了一种用于治疗膝骨关节炎的药物组合物，药物组合物的有效成分包括龙胆苦苷、牛膝总皂苷和丹参酮iia，龙胆苦苷、牛膝总皂苷、丹参酮iia质量比为1～5:1～5:1～5，优选为龙胆苦苷、牛膝总皂苷、丹参酮iia质量比为1:3:1。
实施例1-2中的药物组合物配制成口服制剂使用，用于治疗膝骨关节炎病症。
实施例1和实施例2中的牛膝总皂苷制备方法如下：
方法1：取牛膝饮片，加水煎煮两次，每次加10倍水，滤过，合并煎液，浓缩至含生药0.5g/ml(相对密度1.02～1.05)，上d101大孔树脂柱，以5bv水为除杂溶剂，以2bv·h-1流速进行洗脱除杂，弃去水洗脱液；再以50％乙醇8bv、4bv·h-1流速进行洗脱，收集洗脱液。为了提高浓缩与干燥的效率，减少有效成分的损失，70℃以下减压回收乙醇，再浓缩至相对密度1.12～1.15(70℃)，70℃以下真空干燥，粉碎备用。其中牛膝总皂苷含量不少于50％。
方法2：取牛膝饮片，加30％乙醇提取两次，每次加10倍量30％乙醇，滤过，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至含生药0.5g/ml(相对密度1.02～1.05)，上d101大孔树脂柱，以5bv水为除杂溶剂，以2bv·h-1流速进行洗脱除杂，弃去水洗脱液；再以60％乙醇6bv、4bv·h-1流速进行洗脱，收集洗脱液。为了提高浓缩与干燥的效率，减少有效成分的损失，70℃以下减压回收乙醇，再浓缩至相对密度1.12～1.15(70℃)，70℃以下真空干燥，粉碎备用。其中牛膝总皂苷含量不少于60％。
一、治疗koa药效学试验：
1、实验材料
(1)实验动物
取sd大鼠(雌雄各半)56只，体重200±20g，6周龄。
(2)主要实验器械和仪器
芬兰mk352型酶标仪，sigma冷冻高速离心机，olympus倒置显微镜，yd-6l组织包埋机，rm2235组织切片机，yd-6l组织包埋冷动台，tp1020组织脱水机，gnp9080型隔水式恒温培养箱，philips牌电动剃毛器，超低温冰箱(thermoscientificforma702)，电子秤(常州双杰)，洗板机等。
(3)主要实验试剂
75％酒精，10％水合氯醛，青霉素钠，伊红，二甲苯，苏木素，goat血清，pbs缓冲液，一抗稀释液(3％bsaintbs,ph7.4),柠檬酸盐缓冲液、dab工作液等，mmp-1、mmp-3检测试剂盒(美国r&dsystems公司)。
2、试验方法
(1)koa模型的建立：
麻醉：取sd大鼠，电子秤称重，10％水合氯醛腹腔注射(0.3ml/100g)麻醉。
手术组：先屈曲大鼠右膝，酒精消毒后，可见膝关节前方有一白色韧带即为髌韧带，用刀片沿髌韧带内侧切开皮肤，显露髌韧带，伸膝位切开内侧髌韧带，屈膝将髌骨向外侧脱位，充分显露股骨髁及胫骨，在股骨与胫骨内侧间隙，找到内侧半月板，剪去内侧半月板前1/3，然后间断前交叉韧带，伸膝使髌骨复位，术口给予20万u/ml青霉素2滴预防感染，1号丝线缝合术口。
假手术组：切开内侧髌韧带，显露关节腔后，不损伤半月板和交叉韧带，缝合关节囊及皮肤。
所有sd大鼠术后均采取右侧臀大肌肌注青霉素预防感染，每只0.3ml/天，连续5天。
(2)分组给药：将采购的sd大鼠分组，分别为空白组、假手术组、秦艽水煎液组、牛膝水煎液组、龙胆苦苷-牛膝总皂苷组、龙胆苦苷-牛膝总皂苷-丹参酮iia组、双醋瑞因(西药阳性对照药)组，每组8只。每天一次。连续给药10天，于第10天给药后2h后，断头处死，并迅速取出各组织，用生理盐水洗去残留血液，于-80℃冰冻保存备用。测定指标性成分含量。
牛膝水煎液配置方法：取牛膝饮片，加水煎煮2次，每次加8杯水，煎煮1小时，滤过，合并煎液，浓缩至含生药1g/ml。
秦艽水煎液配置方法：取秦艽饮片，加水煎煮2次，每次加10杯水，煎煮1小时，滤过，合并煎液，浓缩至含生药1g/ml。
龙胆苦苷-牛膝总皂苷组配置方法：按照1:3比例称取龙胆苦苷和牛膝总皂苷，加适量热水溶解或分散稀释成含提取物1g/ml，使用前可适当摇匀或超声使分散均匀。每次大鼠给药2ml，即2g提取物。
龙胆苦苷-牛膝总皂苷-丹参酮iia组样品配置方法：按照1:3:1比例称取龙胆苦苷、牛膝总皂苷和丹参酮iia，加适量热水溶解或分散稀释成含提取物1g/ml，使用前可适当摇匀或超声使分散均匀。每次大鼠给药2ml，即2g提取物。
(3)标本采集与保存
关节冲洗液：将麻醉后大鼠固定、消毒术口，打开右侧关节腔，肉眼观察膝关节软骨及滑膜，用1ml注射器抽去0.5ml生理盐水反复冲洗关节腔，取其关节液，放入ep管内，离心(3000r/min)5分钟，取上清液，作好标记，-80℃冰冻保存备用。
关节软骨：取关节液后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，取右膝胫骨平台软骨，用10％甲醛固定，脱钙，脱水，透明，石蜡包埋，纵向5μm连续切片，常温保存。
(4)肉眼观察膝关节软骨面的退变程度及滑膜组织病理改变情况。
(5)elisa检测关节冲洗液中mmp-1、-3含量
实验原理：采用双抗体夹心法测定关节液mmp-1、-3的组织抑制因子水平。用纯化的mmps抗体包被微孔板，制成固相抗体，向包被单相抗体微孔依次加入mmps，在与hrp标记的mmps抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经洗涤后，加底物tmb显色；tmb在hrp酶的催化下转化成蓝色，在酸作用下转化为黄色；颜色的深浅和样品中的mmps呈正相关；用酶标仪在450nm下测定吸光度(od值)，通过标准曲线计算样品中mmps的浓度。
标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，第1、2孔加标准品μl，分别稀释后，各孔加样量都为50μl，浓度分别为150、100、50、25、12.5μl/l。
加样：分别设空白孔和待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
温育：用封板膜封板后37℃温育30min。
配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次。
加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
温育：37℃温育30min。
洗涤：去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次。
显色：加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。
终止：每孔加终止液50μl，终止反应。
测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的od值，建立标准曲线，计算样品浓度。
统计分析：采用spss21.0处理数据，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，检验水准α＝0.05，p<0.05有统计学意义。
3、实验结果
(1)肉眼观察软骨和滑膜退变情况
正常组和假手术组：关节软骨表面光滑，呈蓝白色，无裂纹及软化灶，未见骨赘形成；滑膜光滑无粘连；
模型组：关节软骨呈淡黄色、表面粗糙、局部骨质缺损、周边骨赘形成、有粘膜增生；
秦艽组：关节软骨呈淡黄色、表面稍粗糙、局部骨质缺损、周边骨赘形成、有少量粘膜增生；
牛膝组：关节软骨呈淡黄色至黄白色、表面粗糙、局部骨质缺损、周边骨赘形成、有粘膜增生；
秦艽牛膝组：关节软骨表面基本光滑，呈白色至微红白色，有少量软化灶和骨赘形成，滑膜光滑基本无粘连；
秦艽牛膝丹参组：关节软骨表面基本光滑，呈白色至微红白色，有少量软化灶和骨赘形成，滑膜光滑基本无粘连；
双醋瑞因组：关节软骨表面基本光滑，呈白色，有少量软化灶和骨赘形成，滑膜光滑基本无粘连；
(2)关节滑液mmp-1、mmp-3检测结果
表1关节滑液mmp-1、mmp-3检测结果
注：各组关节滑液中mmp-1和mmp-3的含量比较采用单因素方差分析。*与假手术组比较，p<0.05，**与假手术组比较，p<0.01；&与模型组比较，p<0.054、讨论
本实验结果表明：
假手术组中mmp-1和mmp-3在软骨细胞的表达水平低，模型组mmp-1和mmp-3在软骨细胞的表达水平明显升高(p<0.01)。说明关节软骨中mmp-1和mmp-3可以作为评级关节软骨退变的生物学标记物。
在给药组中，单用秦艽煎液可以抑制关节滑液中mmp-1和mmp-3在软骨细胞的表达，但是与模型组比较无显著性差异(p>0.05)。将龙胆苦苷和秦艽总皂苷配伍后，可显著抑制关节滑液中mmp-1和mmp-3在软骨细胞中的表达(p<0.05)，并刺激软骨细胞增生，具有良好的抗炎和软骨保护的作用。将龙胆苦苷、秦艽总皂苷和丹参酮iia配伍后，可显著抑制关节滑液中mmp-1(p<0.01)和mmp-3(p<0.05)在软骨细胞中的表达，并刺激软骨细胞增生，具有良好的抗炎和软骨保护的作用。
二、对腹腔注射冰醋酸所致小鼠扭体反应的影响
实验目的
观察药物组合物对小鼠的镇痛作用。
1实验材料
1.1供试品：
牛膝水煎液配置方法：取牛膝饮片，加水煎煮2次，每次加8杯水，煎煮1小时，滤过，合并煎液，浓缩至含生药1g/ml。
秦艽水煎液配置方法：取秦艽饮片，加水煎煮2次，每次加10杯水，煎煮1小时，滤过，合并煎液，浓缩至含生药1g/ml。
龙胆苦苷-牛膝总皂苷组配置方法：按照1:3比例称取龙胆苦苷和牛膝总皂苷，加适量热水溶解或分散稀释成含提取物0.5g/ml，使用前可适当摇匀或超声使分散均匀。每次大鼠给药2ml，即1g提取物。
龙胆苦苷-牛膝总皂苷-丹参酮iia组样品配置方法：按照1:3:1比例称取龙胆苦苷、牛膝总皂苷和丹参酮iia，加适量热水溶解或分散稀释成含提取物0.5g/ml，使用前可适当摇匀或超声使分散均匀。每次大鼠给药2ml，即1g提取物。
1.2对照品
必理通(对乙酰氨基酚片)，中美天津史克制药有限公司，0.5g/片，每次1片，每日3次，即一日3片(1.5g)。
使用时按剂量以蒸馏水配制成所需浓度，4℃冰箱保存。
1.3试剂
冰醋酸，广州化学试剂厂。
1.4仪器
jj3000动物电子秤，g&g公司产品；bs224s电子天平(1/万)，德国sartorius产品；小鼠扭体观察仪，自制。
1.5动物
spf级nih小鼠，雌雄各半，体重18～22g。
2实验方法
2.1动物分组
取spf级nih小鼠72只，雌雄各半，按体重随机分为6组，分别为对照组、必理通片组、秦艽水煎液组、牛膝水煎液组、龙胆苦苷-牛膝总皂苷药物组合物组、龙胆苦苷-牛膝总皂苷-丹参酮iia药物组合物组。
2.2剂量设置
必理通片，根据药品说明书标示以每日1.5g临床日用量为基础，参考《中药药理研究方法学》中剂量换算方法“体表面积比”换算动物临床等效剂量，以此临床等效剂量作为必理通片小鼠药效学实验剂量。必理通片小鼠药效学实验剂量为0.195g·kg-1，实验时以蒸馏水按剂量配制，4℃冰箱保存。
秦艽水煎液、牛膝水煎液、龙胆苦苷-牛膝总皂苷混合物、龙胆苦苷-牛膝总皂苷-丹参酮iia混合物，每次给药2ml，分别相当于2g生药或1g提取物。
2.3实验统计方法
所有计量资料以均数加减标准差
2.4给药方法
供试品药物各剂量组及阳性对照药按剂量灌胃给药，给药体积20ml·kg-1，每天1次，对照组同法灌胃给予蒸馏水20ml·kg-1。
2.5测定方法
取spf级nih小鼠72只，雌雄各半，按体重随机分为6组，分别为对照组、必理通片组、济泰片组、亨昌戒毒瘾丸高、中、低剂量组，每组12只。各给药组按剂量灌胃给药20ml·kg-1，对照组同法灌胃给予等体积蒸馏水，每天1次，连续5d。末次给药前各组动物均禁食不禁水12h。末次给药后1h，每鼠ip0.7％冰醋酸10ml·kg-1，记录20min内小鼠的扭体潜伏期和扭体次数，比较各给药组与对照组的差异。
3实验结果
表2表明，与对照组比较，龙胆苦苷-牛膝总皂苷混合物组、龙胆苦苷-牛膝总皂苷-丹参酮iia混合物组小鼠扭体潜伏期明显延长(p<0.01)，扭体次数显著减少(p<0.01或p<0.05)。
与必理通片组比较，龙胆苦苷-牛膝总皂苷混合物组、龙胆苦苷-牛膝总皂苷-丹参酮iia混合物组小鼠扭体潜伏期明显缩短(p<0.05)，扭体次数明显增加(p<0.05)。
表2药物组合物对腹腔注射冰醋酸所致小鼠扭体反应的影响(
注：与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。与必理通片组比较，△p<0.05，△△p<0.01。
龙胆苦苷-牛膝总皂苷药物混合物组和龙胆苦苷-牛膝总皂苷-丹参酮iia药物混合物均对冰醋酸所致小鼠疼痛扭体反应有明显抑制作用，说明两种药物组合物具有一定的镇痛作用。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。