金银花总黄酮及其制备方法和应用与流程

本发明涉及植物医药技术领域，涉及金银花总黄酮及其制备方法和应用，尤其涉及药用植物金银花中总黄酮及其制备和在制备治疗阿尔兹海默疾病药物中的应用。

背景技术：

金银花(lonicerajaponicathunb.)为忍冬属植物忍冬的干燥花蕾，花蕾以肥大、色青白、握之干净者为佳。药用原植物除黑龙江、内蒙古、宁夏、青海、新疆、海南和西藏无自然生长外，全国各省均有分布。忍冬是一种具有悠久历史的常用中药，始载于《名医别录》，列为上品。“金银花”一名始见于李时珍《本草纲目》，在“忍冬”项下提及，现已公认为该药材的正名，并收入中国药典。金银花性甘寒，功能清热解毒、消炎退肿，对细菌性痢疾和各种化脓性疾病都有效。已生产的金银花制剂有“银翘解毒片”、“银黄片”、“银黄注射液”等。“金银花露”是金银花用蒸馏法提取的芳香性挥发油及水溶性溜出物，为清火解毒的良品，可治小儿胎毒、疮疖、发热口渴等症早期。对于金银花的研究主要集中在有机酸类的研究，尤其是绿原酸的研究。随着研究的深入，人们发现金银花中的黄酮类化合物也具有优良的生理活性，如抗菌、抗病毒、抗癌、防癌和抑制脂肪酶等，并且无害无毒。因此，对金银花中黄酮类化合物进行研究具有重要的实际意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种植物金银花中总黄酮及其制备方法，该方法是将金银花药用部位干燥花蕾用水提醇沉的方法进行提取，减压浓缩得到粗提物后用水混悬，通过chp20柱色谱柱，最后获得纯度较高的总黄酮。

本发明通过如下技术方案实现：

金银花总黄酮，通过如下方法制备：

(1)金银花药材，用水加热回流提取；

(2)减压浓缩，浓缩液加入工业乙醇，静置后过滤，回收乙醇，得浸膏；

(3)将所得浸膏加水混悬后，上hp20树脂，先用10％～20％乙醇水洗脱，再用60％～80％乙醇水洗脱，收集60％～80％乙醇水洗脱液，减压回收乙醇，干燥即得。

其中，

步骤(1)中，先用2-3倍体积量的水浸泡过夜，再用5-8倍体积量的水加热提取2-3次；

步骤(2)中，可在减压浓缩前调整提取液的ph值为3.00～5.00；

步骤(2)中，将水提取液浓缩至1：1，加入乙醇使其含醇量为70-80％；

步骤(3)中，所述的hp20为chp20y、chp20p、chp20ss中的一种或几种；

步骤(3)中，所述的乙醇洗脱液中可以加入酸，所述的酸为：盐酸。

所得的提取物利用fecl3颜色显色反应呈阳性，且hcl-mg反应呈阳性，确定所得提取物为总黄酮。

利用可见分光光度法(中国药典一部附录ⅴa)，以金丝桃苷(纯度98％)为对照品，并采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法，根据黄酮类化合物与铝盐反应生成红色络合物，检测波长510nm，用于检测各个色谱柱洗脱所获得总黄酮的含量。结果表明，用本发明的方法制备的金银花总黄酮在70％以上，甚至80％以上。

本发明还提供了所述方法制备的金银花总黄酮体外抗aβ淀粉样蛋白聚集活性的试验，结果表明，本发明的金银花总黄酮具有明显的抗老年痴呆作用，可以用于制备治疗阿尔兹海默疾病的药物。

本发明的有益之处是：1、在抑制aβ蛋白聚集活性导向分离的指导下，对药材中的有效部位进行了充分的提纯、浓缩及富集，采用了与以往不同的提取工艺，是将金银花干燥花蕾粉碎，水提醇沉后通过一步chp20树脂法，收集得到其总黄酮提取物，也是金银花中具有抗ad药理活性的有效部位，利用分光光度法测定总黄酮的含量达到70％，远优于用粗提物直接入药。2、用本方法获得的总黄酮，具有显著的药理作用，能够抑制aβ蛋白的聚集，制率达到60％以上，明显高于对照品姜黄素的抑制率，并且在老年痴呆模型大鼠的水迷宫实验中显示出良好的抗ad活性，3、金银花作为一种传统中药，其毒、副作用较低，资源丰富，对阿尔兹海默疾病具有良好的治疗潜力，可以开发成一种新的抗ad药物。4、本发明方法设计合理，具有工艺简单、成本低、能耗低和生产过程污染低的特点。

附图说明

图1为以姜黄素作为阳性对照，在20μm时，不同方案得到的总黄酮aβ蛋白聚集的抑制率，与阳性对照相比，*表示p＜0.05,**表示p＜0.01。

图2为不同方案得到的总黄酮对h2o2诱导的sh-sy5y细胞损伤的神经保护作用。使用mtt测定法测试5组不同方案得到的总黄酮(25,50,100μm)在sh-sy5y细胞中的细胞毒性作用。

图3为不同方案得到的总黄酮对h2o2诱导的sh-sy5y细胞损伤的神经保护作用。在不同浓度(25,50,100μm)的总黄酮的情况下，用mtt测定法测定h2o2(200μm)处理4小时后的细胞的存活率。

图4为金银花总黄酮对水迷宫实验中大鼠潜伏期的影响(mean±sd，n＝10)

注：与假手术组相比，**p＜0.01；与模型组相比，##p＜0.01.a，b，c分别代表实例中金银花总黄酮的三种不同剂量。

图5为金银花中总黄酮对水迷宫实验中大鼠在目标象限所待时间的影响(mean±sd，n＝10)。

注：与假手术组相比，**p＜0.01；与模型组相比，^##p＜0.01.a，b，c分别代表实例5中金银花总黄酮的三种不同剂量

图6为金银花中总黄酮对水迷宫实验中大鼠穿过平台位置次数的影响(mean±sd，n＝10)。

注：与假手术组相比，**p＜0.01；与模型组相比，##p＜0.01.a，b，c分别代表实例5中金银花总黄酮的三种不同剂量。

具体实施方式

本发明结合具体实施例作进一步的说明。

实施例1金银花总黄酮的制备

取金银花干燥药材1kg，用水加热(100℃)提取得到水提液，并将其浓缩，加入适当的乙醇(乙醇含量为70％)反复多次沉降，除去其不溶物质，最后干燥得到浸膏；将浸膏用1l水溶解后上chp20ss树脂，先用水洗脱8个体积，再用体积分数为70％乙醇水洗脱，直到流出的洗脱液为无色。收集所有70％乙醇水洗脱液，减压浓缩回收乙醇，喷雾干燥得到干燥粉末，得到82.3g总黄酮，利用fecl3显色呈阳性，且hcl-mg反应呈阳性，确定所得提取物为总黄酮。利用可见分光光度法(中国药典一部附录ⅴa)，以金丝桃苷(纯度98％)为对照品，采用乙酸乙酯萃取，加入碳酸钠使强酸弱碱结合除去绝大部分绿原酸成分，有效地消除了干扰成分的影响，并采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法，根据黄酮类化合物与铝盐反应生成红色络合物，检测波长510nm，检测结果显示所得馏分中，其总黄酮含量为84.7％。

实施例2金银花总黄酮的制备

取金银花干燥药材10kg，用水加热提取得到水提液，加入盐酸调节水提液的ph值为5.00后，再将其浓缩，加入适当的乙醇(乙醇含量为70％)反复数次沉降，除去其不溶物质，最后干燥得到浸膏；将浸膏用10l水溶解后上chp20p树脂，先用水洗脱4个体积，再用体积分数为10％～20％的乙醇水系统洗脱5个体积，接着用75％的乙醇水洗脱10个体积，最后用90％的乙醇水溶剂系统洗脱至流出的洗脱液为无色。收集所有75％乙醇水洗脱液，减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥得到干燥粉末，得到0.85kg总黄酮，利用fecl3显色呈阳性，且hcl-mg反应呈阳性，确定所得提取物为总黄酮。利用可见分光光度法(中国药典一部附录ⅴa)，以金丝桃苷(纯度98％)为对照品，采用乙酸乙酯萃取，加入碳酸钠使强酸弱碱结合除去绝大部分绿原酸成分，有效地消除了干扰成分的影响，并采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法，根据黄酮类化合物与铝盐反应生成红色络合物，检测波长510nm，检测结果显示所得馏分中，其总黄酮含量为85.4％。

实施例3金银花总黄酮的制备

取金银花干燥药材30kg，用水加热提取得到水提液，加入盐酸调节水提液的ph值为4.00后，加入适当的乙醇(乙醇含量为70％)反复数次沉降，除去其不溶物质，最后干燥得到浸膏；将浸膏用25l水溶解后上chp20y树脂，先用20％的乙醇水洗脱系统洗脱5个体积，再用体积分数为60％～80％乙醇水洗脱，直到流出的洗脱液为无色。收集所有60％～80％乙醇水洗脱液，减压浓缩回收乙醇，真空干燥得到干燥粉末，得到2.68kg总黄酮，利用fecl3显色呈阳性，且hcl-mg反应呈阳性，确定所得提取物为总黄酮。利用可见分光光度法(中国药典一部附录ⅴa)，以金丝桃苷(纯度98％)为对照品，采用乙酸乙酯萃取，加入碳酸钠使强酸弱碱结合除去绝大部分绿原酸成分，有效地消除了干扰成分的影响，并采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法，根据黄酮类化合物与铝盐反应生成红色络合物，检测波长510nm，检测结果显示所得馏分中，其总黄酮含量为86.5％。

实施例4金银花总黄酮的制备

取金银花干燥药材50kg，用水加热提取得到水提液，并将其浓缩，加入适当的乙醇(乙醇含量为70％)反复数次沉降，除去其不溶物质，最后干燥得到浸膏；将浸膏用60l水溶解后上chp20y树脂，为了提高chp20y树脂的分离效果，事先在乙醇水洗脱液中加入0.1％的甲酸，首先用10％、20％乙醇水(含有0.1％甲酸)洗脱系统洗脱7个体积，再用体积分数为80％的乙醇水(含有0.1％甲酸)洗脱，直到流出的洗脱液为无色。收集所有80％乙醇水洗脱液(含有0.1％甲酸)，减压浓缩回收乙醇，常压加热干燥得到纯度更高的总黄酮浸膏4.12kg，利用fecl3显色呈阳性，且hcl-mg反应呈阳性，确定所得提取物为总黄酮。利用可见分光光度法(中国药典一部附录ⅴa)，以芦丁(纯度98％)为对照品，采用乙酸乙酯萃取，加入碳酸钠使强酸弱碱结合除去绝大部分绿原酸成分，有效地消除了干扰成分的影响，并采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法，根据黄酮类化合物与铝盐反应生成红色络合物，检测波长510nm，检测结果显示所得馏分中，其总黄酮含量为86.1％。

实施例5金银花总黄酮的制备

取金银花干燥药材100kg，用水加热提取得到水提液，加入盐酸调节水提液的ph值为3.50后，将其减压低温浓缩，加入适当的乙醇(乙醇含量为70％)反复数次沉降，除去其不溶物质，最后干燥得到浸膏；将浸膏用90l水溶解后上chp20y树脂，为了提高chp20y树脂的分离效果，事先在乙醇水洗脱液中加入0.1％的磷酸，首先用水洗脱10(含有0.1％磷酸)个体积，再用体积分数为65％乙醇水(含有0.1％磷酸)洗脱，直到流出的洗脱液为无色。收集所有65％乙醇水洗脱液(含有0.1％磷酸)，减压浓缩回收乙醇，常压干燥后得到高纯度的总黄酮浸膏7.45kg。利用fecl3显色呈阳性，且hcl-mg反应呈阳性，确定所得提取物为总黄酮。利用可见分光光度法(中国药典一部附录ⅴa)，以芦丁(纯度98％)为对照品，采用乙酸乙酯萃取，加入碳酸钠使强酸弱碱结合除去绝大部分绿原酸成分，有效地消除了干扰成分的影响，并采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法，根据黄酮类化合物与铝盐反应生成红色络合物，检测波长510nm，检测结果显示所得馏分中，其总黄酮含量为85.9％。

实施例6

不同实例制备得到的金银花总黄酮体外抗aβ淀粉样蛋白聚集活性评价

1、aβ的预处理

将预先保存于-80℃冰箱中的aβ取出，以1mg/ml的浓度溶于hfip中。室温下静置30min待其二级结构完全去除后，真空冷冻干燥去除hfip，并置于-20℃冰箱中保存。

2、磷酸缓冲液(pbs,ph＝7.4,0.1m)制备

缓冲液的制备(pbs,buffer)：ph＝7.4，浓度为0.1mol/ml。参照中华人民共和国药典2010年版第二部附录，取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/l氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，用精密ph酸度计进行校正，即得。

3、aβ反应试液的制备

取预处理后的aβ冻干粉，用ph＝7.4的0.1mol/mlpbs将其配制成50μmol/l的aβ试液，-20℃冻存备用。

4、显色剂配置

精密称取th-t粉末，用ph＝7.4的0.1mol/mlpbs，配制成为10μmol/l的th-t试液，现用现配。

5、化合物溶液的配制

用ph＝7.4的0.1mol/mlpbs和dmso，将ve和待测样品分别配置浓度为10^-3，10^-4，10^-5，10^-6和10^-7mol/l，dmso的最终体积分数不大于0.001。

6、测定方法

组别设置：

(1)空白对照组：pbs60μl,aβ10μl,pbs+dmso10μl

(2)样品抑制组：pbs60μl,aβ10μl,药物10μl

(3)空白本底组：pbs60μl,pbs10μl,pbs+dmso10μl

(4)样品本底组：pbs60μl,pbs10μl,药物10μl

于96孔板分别加入上述各组溶液，置于恒温孵育箱中37℃孵育24h，然后向各组中加入80μlth-t溶液，置于恒温孵育箱中37℃孵育5min，用酶标仪于(λex＝450nm；λem＝485nm)处测定各组荧光值。每组重复3次。

7、结果分析：

以aβ单独孵育后用th-t测定的485nm处荧光值作为对照：为了避免化合物本身具有的荧光对结果的干扰，以扣除单独受试化合物用th-t测定的荧光值作为本底。抑制率的计算公式如下：

8、计算ic50值

通过spss16.0分析数据，计算ic50值。

9、活性结果见图1。

实施例7

金银花中总黄酮对双氧水介导的sy5y细胞的保护作用试验

细胞：sh-sy5y

模型：双氧水诱导氧化损伤

具体流程：

1.铺板：选取生长状态良好干净的sy5y细胞，铺到96孔板进行培养，筛药前12h铺板，细胞密度可选1.2*104个/孔。(铺板均匀，密度适宜)

2.配药：12h后，观察细胞是否贴壁，生长状态是否良好，如合格，可进行加药。

根据浓度组数和每组副孔数提前算好药物浓度，培养基体积(储备液浓度为50mm)。配药时从高浓度→低浓度稀释。注意混匀。

3.加药：将培养板从培养箱中拿出，在板盖标记好组别，甩板。将配好的药由低浓度→高浓度依次加入孔中(加药时枪头抵住侧壁，缓慢打入，不可冲击细胞)。

4.加双氧水造模：根据细胞密度提前计算好双氧水浓度。加药1h后加双氧水(双氧水易分解，现配现用)。首先将双氧水配成8.8mm储备液，再用培养基稀释至所需浓度，注意混匀(快速操作)。

将配好的双氧水加入加药组和模型组(缓慢加入)。control组加等体积的培养基作空白对照。

5.加mtt：加双氧水后1-2内,观察模型组细胞损伤率达60％左右时，加mtt。

6.测od值：加mtt后2-4h内，测板。

7.处理数据：根据测出的od值，计算细胞存活率，实验结果如图2和3所示。

实施例8老年痴呆模型大鼠的水迷宫实验

取sd大鼠，雄性，体重250～300g，建立大鼠老年痴呆模型，动物随机分为6组：

假手术组：动物不造模，灌胃给生理盐水，每日一次，连续给药30天；

模型组：动物造模后，灌胃给生理盐水，每日一次，连续给药30天；

阳性对照组：动物造模后，灌胃给多奈哌齐1.5mg/kg，每日一次，连续给药30天；

金银花总黄酮低剂量组：动物造模后，灌胃给金银花总黄酮100mg/kg，每日一次，连续给药30天；

金银花总黄酮中剂量组：动物造模后，灌胃给金银花总黄酮200mg/kg，每日一次，连续给药30天；

金银花总黄酮高剂量组：动物造模后，灌胃给金银花总黄酮400mg/kg，每日一次，连续给药30天。

应用水迷宫实验观察大鼠的认知功能。水迷宫仪器由一圆形水池和一可移动的圆形平台组成，水池直径100cm，水深40cm，水温控制在23±1℃，平台直径15cm，水面高出平台2cm。实验时，平台放置于第一象限的中间，水池上方设置自动摄像系统并连接计算机，跟踪记录大鼠的游泳轨迹，自动计算出大鼠在水池中游过的路程及找到平台所需要的时间。正式实验前，将动物放置在平台上使其适应10s，然后将大鼠放入水中，观察90s内的运动情况。记录大鼠找到平台所需要的时间，若动物90s内未找到平台，将其轻轻放置于平台上并持续15s，再放回笼中。每天训练动物三次，连续3天，然后开始正式实验。观察大鼠自放入水池中至找到平台所需要的时间，超过90s，则时间计为90s，每天一次，连续5天。实验结束后，各动物休息一天，再进行记忆实验。将平台撤出，大鼠从第三象限放入水池，观察并记录120s内各大鼠在第一象限所在的时间以及经过平台所在位置的次数。

结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠在5天实验中，找到平台的时间明显增加(潜伏期)，穿过第一象限次数及在第一象限所待的时间明显下降。与模型组比较，金银花总黄酮200mg/kg、400mg/kg剂量组可明显降低大鼠的潜伏期，增加通过第一象限的次数及延长在第一象限所待的时间，差异有显著性(p＜0.01)。其效果与多哌奈齐组相似。实验结果如图4、5和6所示。