一种皂角刺在制备抗氧化剂或一氧化氮释放抑制剂中的应用的制作方法

本发明属于药物化学领域，涉及一种皂角刺在制备抗氧化剂或一氧化氮释放抑制剂中的应用。
背景技术：
：现代研究表明，生命活动的许多过程都涉及到自由基的产生和清除。在正常的生命过程中自由基为维持生命所必需，但自由基也是生物大分子(如蛋白质、酶和dna等)、细胞和生物组织的危险杀手。在正常的生理情况下，生物体内自由基的产生和清除呈平衡状态。一旦平衡失调，过剩的自由基就会攻击靶器官，造成细胞膜脂质过氧化，核酸主链、蛋白质及多肽键断裂，细胞凋亡等，引起机体衰老和器官退行性变化，导致心脑血管疾病、癌症、糖尿病、帕金森氏病及老年性痴呆等多种疾病的发生。皂角刺，中药名。为豆科植物皂荚的干燥棘刺。分布于河北、山东、河南、山西、陕西、甘肃、江苏、安徽、浙江、江西、湖南、湖北、福建、广东、广西、四川、贵州、云南等地。具有消肿托毒，排脓，杀虫之功效。常用于痈疽初起或脓成不溃；外治疥癣麻风。而上述疾病的产生在很大程度上都与体内活性氧的代谢失调有关。为此，采用dpph自由基清除法(dpph法)和氧自由基清除能力法(orac法)两种体外抗氧化活性评价方法。虽然大多数自由基化学性质极为活泼，寿命极短，但也有少数自由基的化学性质十分稳定，dpph(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl即1,1-二苯基-2-苦基苯肼)自由基就是其中之一。它的稳定性主要来自共振稳定作用及三个苯环的空间障碍，而使其夹在中间氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用。dpph·的乙醇溶液呈紫色，在517nm处有强吸收。当有自由基清除剂存在时，dpph·的单电子被配对而使溶液颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此，在此波长处的吸光度可用以检测自由基的清除情况，从而评价试验样品的抗氧化能力。抗氧化剂与其作用模式为ah+dpph·→dpph-h+a·，清除活性与抗氧化剂分子中有效酚羟基的数目及新形成的抗氧化剂自由基(a·)的稳定性有关。1958年blois将其应用于抗氧化剂的筛选研究，此后国内外很多学者用此方法研究了物质清除自由基的性质。荧光物质荧光素二钠在485nm光激发下，可发射527nm荧光。aaph[2,2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride,2,2'-偶氮(二眯基丙烷)二氯化氢]在水溶液中可释放过氧自由基(roo·)，并能将荧光素二钠氧化，使其荧光特性消失。当抗氧化剂存在时，可与荧光素二钠竞争氧化剂，减缓其荧光消退的速度。根据这一特性，可以测定样品的氧自由基清除活性(oxygenradicalabsorbancecapacity,orac)]。orac法是一种测定物质总抗氧能力的方法，以一种α-生育酚的水溶性类似物-trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid,6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)作为标准对照。该方法能够提供稳定可控的自由基来源，适用于亲水性和亲脂性化合物，以荧光定量结果准确并可做到微量和高通量自动化检测。glaz和ghiselli等人利用该方法进行抗氧化活性研究后，经过一系列的改进，这种方法现已被广泛用来评价生物制品和食品的抗氧化能力。一氧化氮(no)是近年来发现的生物体内广泛存在的一种生物活性极强的无机小分子，作为生物体内重要的信使分子和神经递质，参与机体多种生理和病理过程，其对疾病发生和发展的影响是近年来研究的热点。在体内no是由一氧化氮合成酶(nos)在多种辅助因子的参与下催化左旋精氨酸(l-arg)胍基末端的氮原子与分子氧反应而生成的，nos是内源性no生成的限速酶。研究已证实在nos的3个亚型中inos在脂多糖、细胞因子或氧化应激作用下可催化合成持续大量的no，主要参与机体的病理生理过程。高水平的no与感染、炎症和自身免疫过程有关，可介导炎症、休克、哮喘等疾病的发生。no释放抑制剂可用于治疗细胞中由病理浓度的no诱发或加重的各种疾病。cn104926773a公开了一种皂角刺中黄烷酮骨架类化合物的提取方法，包括以下步骤：步骤一、将皂角刺粉末用乙醇热回流提取，得到乙醇浸膏；步骤二、将乙醇浸膏加水溶解，用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏；步骤三、将乙酸乙酯浸膏采用硅胶柱色谱分离，得到馏分1-15；步骤四、将馏分7再次进行硅胶柱色谱法分离，得到化合物1、化合物2、化合物3和化合物4；步骤五、将馏分9进行硅胶柱色谱法分离得到化合物5和化合物6。次发明提取分离的黄烷酮骨架类化合物具有良好的抗肝癌细胞活性，为进一步提升皂角刺的药用价值提供了新的科学依据，但是并未研究皂角刺的抗氧化活性。cn102940672b公开皂角刺总黄酮在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用，尤其是在肿瘤预防、肿瘤化疗增效、组织增生方面的应用，如预防化学致癌、提高肿瘤化疗指数、逆转肿瘤化疗耐药、阻止乳腺增生和前列腺增生等。目前，还没有研究报道关于皂角刺在抗氧化方面的应用，而皂角刺在抗氧化方面的应用，对于拓展皂角刺的功效具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种皂角刺在制备抗氧化剂或一氧化氮释放抑制剂中的应用。为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一种皂角刺在制备抗氧化剂或一氧化氮释放抑制剂中的应用。本发明通过研究发现，经过dpph自由基清除法(dpph法)和氧自由基清除能力法(orac法)两种体外抗氧化活性评价方法及抑制大鼠巨噬细胞no释放的活性测试，结果相比于芦丁、山楂提取物等物质，皂角刺都表现与之相当甚至更高的活性，可作为一种新的抗氧化剂或者一氧化氮释放抑制剂进行应用。本发明中，通过测试发现，皂角刺中花旗松素、黄颜木素等物质的含量较高，这些物质的存在，可促进皂角刺的抗氧化活性的提升。优选地，所述抗氧化剂的dpph自由基清除率为50％～80％，例如可以是50％、51％、55％、56％、58％、59％、60％、67％、70％、73％、75％、78％或80％等。优选地，所述抗氧化剂的orac值为0.70～1.60，例如可以是0.70、0.80、0.85、0.92、1.12、1.35、1.44、1.55或1.60等。本发明所述orac值指在抗氧化剂存在下，荧光衰退曲线上受保护积分面积(即荧光衰退曲线下积分面积扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积)的大小，具体如图1所示。不同抗氧化剂的保护面积统一换算成1μmtrolox的保护面积进行比较。因此，1个orac单位定义为：终浓度为1μm的trolox在荧光衰退曲线上对应的保护积分面积。优选地，所述一氧化氮释放抑制剂的抑制率为50％～75％，例如可以是50％、55％、60％、65％、70％或75％等。本发明测试抑制率的方法为griess法。优选地，所述抗氧化剂作为抗氧化药物。本发明提供的皂角刺还可以常用的药学上可接受的辅料制备成为抗氧化药物，进一步应用到相关疾病的治疗方面。此外，由于皂角刺中含有成分复杂，不同的成分之间对于皂角刺的抗氧化作用也会产生促进。相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明意外的发现，皂角刺具有较高的抗氧化活性和一氧化氮抑制活性，经过dpph自由基清除法(dpph法)和氧自由基清除能力法(orac法)两种体外抗氧化活性评价方法及抑制大鼠巨噬细胞no释放的活性测试，对于dpph自由基清除率为50％～80％，orac值可达到0.70～1.60，对于一氧化氮释放的抑制率可达到50％～75％，结果相比于芦丁、山楂提取物等，皂角刺都表现与之相当甚至更高的活性，可作为一种新的抗氧化剂或者一氧化氮释放抑制剂进行应用。附图说明图1是发明中荧光衰退曲线上受保护积分面积的示意图。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。本发明以下实施例中，采用的样品如下表1所列举，其序号与实施例中的序号相对应。表1上述样品在进行测试之前，均通过以下方法提取制备，得到供试品。样品粉末(过3号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％乙醇溶液10ml，密塞超声处理(功率250w，频率：40khz)2次，每次30min，过滤，合并滤液，置蒸发皿中50℃水浴挥至溶液体积1～2ml，残渣加70％乙醇溶液溶解至5ml量瓶中，用70％乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。实施例1本实施例通过以下方法测定dpph自由基清除活性(1)dpph·溶液和供试品溶液的配制dpph·用无水乙醇配成2×10-4m的溶液，置于4℃避光保存。各单体化合物和阳性药均用无水乙醇配成1mg/ml的原液，测试前用无水乙醇稀释成所需浓度。(2)活性的测定参照文献实验方法并加以改进，将不同浓度的供试品溶液100μl和2×10-4mdpph·溶液100μl加入96孔板各孔中，同时以不加dpph·(以100μl无水乙醇代替dpph·)的供试品溶液各浓度作为对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰，并设dpph·阴性对照(以100μl无水乙醇代替供试品)，每组平行设4个复孔。将96孔板放入酶标仪中，震荡1min，并于此条件下保存(室温、避光)，30min后测试其在517nm处的吸光度od值，按如下公式计算供试品的自由基清除率。自由基清除率＝[oddpph·control-(odsample-odsamplecontrol)]/oddpph·control×100％其中：oddpph·control为dpph·阴性对照组od值的平均值；dsample为样品组od值的平均值；odsamplecontrol为样品乙醇对照组od值的平均值。(3)自由基清除能力的初步测试结果采用上述实验方法对各提取物在50μg/ml浓度下清除dpph自由基的能力进行了测试，同时使用黄酮类化合物芦丁(浓度为10μg/ml)和山楂提取物(浓度为40μg/ml)作为阳性对照，以自由基清除率高于50％认为具有活性。实验结果如表2所示(其中样品编号与表1中样品编号所代表的样品相对应)：表2样品编号清除率样品清除率358.8％1579.6％453.6％1670.4％560.5％1770.0％657.1％1873.4％757.7％1977.3％857.2％2077.3％1274.0％2158.5％1375.0％山楂提取物52.7％1476.3％芦丁63.2％实施例2本实施例通过以下方法测定氧自由基清除能力(1)反应试剂和供试品溶液的配制荧光素二钠用75mm的磷酸钾缓冲液(75mmkh2po4、75mmk2hpo4)配成63μm的储备液，置于4℃避光保存，测试前用该缓冲液稀释100倍。aaph于实验前用75mm的磷酸钾缓冲液配成18.3mm的溶液。trolox用75mm的磷酸钾缓冲液配成10μm的原液，测试前用该缓冲液稀释成所需浓度。各单体化合物和阳性药vc均用75mm的磷酸钾缓冲液配成100mm的原液，测试前用该缓冲液稀释成所需浓度。(2)活性的测定本实验采用的orac测定参照ronaldl.prior的方法并加以改进。实验96孔板每个孔中加入不同浓度的待测样品溶液20μl，再加入75mm磷酸钾缓冲液20μl和aaph140μl(终浓度12.8mm)，最后加入荧光素二钠20μl(终浓度63nm)启动反应，迅速将96孔板置于荧光酶标仪(预置温度37℃)中开始测定，每组平行设3个复孔。采用动力学方式，每2min测定一个点，至荧光强度衰减为零为止。(3)实验结果以抗氧化能力指数表示，它是指在抗氧化剂存在下，荧光衰退曲线上受保护积分面积(即荧光衰退曲线下积分面积扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积)的大小，如图1所示，仅为示意图。不同抗氧化剂的保护面积统一换算成1μmtrolox的保护面积进行比较。因此，1个orac单位定义为：终浓度为1μm的trolox在荧光衰退曲线上对应的保护积分面积。采用上述实验方法对各提取物在50μg/ml浓度下氧自由基清除能力进行了测试，同时使用黄酮类化合物芦丁(浓度为30μg/ml)作为阳性对照，以抗氧化能力指数相当于或优于芦丁的认为具有活性。具体结果如表3所示(其中样品编号与表1中样品编号所代表的样品相对应)：表3实施例3本实施例通过以下方法测定抑制大鼠巨噬细胞no释放活性由于no极不稳定，很快就被氧化成性质稳定，故可通过测定间接反映no的生成量。本文采用griess法测定溶液中的含量，其原理为酸性条件下，与对氨基苯磺酰胺(sulfanilamide)重氮化，再与盐酸n-1-萘基-乙二胺(n-1-naphthylethylene-diaminedihydrochloride)发生偶合反应,生成紫红色的偶氮染料，其在570nm处有最大吸收光谱，可用酶联免疫检测仪测定其吸光度。griess法测定具有高灵敏性、高准确度和再现性的特点，且方法简单有效，是目前最常用的测定含量、衡量no水平的方法。(1)细胞的培养和供试品、反应试剂的配制raw264.7大鼠巨噬细胞(abelsonleukemiavirustransformed)源于美国atcc(americatissueculturecollection)。在37℃，5％co2的湿热培养箱中，用含有10％fbs的ham’sf12培养基培养。ham’sf12培养基(sigma,n4888)：500ml中加入谷氨酸(sigma)以及50ml胎牛血清。ifn-γ：genzyme/techne公司。sulfanilamide,n-1-naphthylethylene-diaminedihydrochloride,mtt：wako公司。griess试剂：盐酸n-1-萘基-乙二胺(n-1-naphthylethylene-diaminedihydrochloride)5mg用注射用水5ml溶解；对氨基苯磺酰胺(sulfanilamide)50mg加入250μl磷酸后用注射用水稀释到5ml。酶联免疫检测仪：model3550microplatereader,bio-rad。各单体化合物用dmso配成浓度分别为100mm，30mm，10mm和3mm的供试液，低温避光保存。(2)活性的测定raw264.7细胞(源于美国atcc)，调整细胞浓度到1.2×106个/ml，以每孔200μl加入于96孔培养板中，5％co2，37℃，培养2小时。加入脂多糖(lps,10μg/ml)2μl，干扰素-γ(ifn-γ,33ng/ml)2μl，样品dmso溶液0.4μl(使lps终浓度为100ng/ml，ifn-γ终浓度为0.33ng/ml，溶解样品的dmso相对于培养基的含量为0.2％)，培养16小时。随后取上清液100μl，加入事先调好的griess试药各50μl，用酶联免疫检测仪在550nm测定吸光度。并以未加样品和诱导剂脂多糖、干扰素-γ的细胞液作为空白对照，以未加样品的细胞液作为阴性对照。同时用mtt法测试各单体化合物的细胞毒作用。按如下公式计算巨噬细胞no释放抑制率和细胞存活率：细胞存活率＝样品组od平均值÷阴性对照组od组平均值×100％(3)实验结果采用上述实验方法对各提取物物在100μg/ml浓度下一氧化氮抑制的能力进行了测试，同时选择白藜芦醇作为阳性对照药，文献报道其具有较好的抑制inos诱导的no释放活性，在50μg/ml时no释放抑制率为62.3％，以no释放抑制率高于50％认为具有活性。得到的结果如表4所示(其中样品编号与表1中样品编号所代表的样品相对应)：表4样品编号抑制率(％)样品编号抑制率(％)351.31570.1452.91669.3550.11771.3650.91870.2750.71970.3851.12069.71263.92168.21365.6白藜芦醇62.31468.3结果表明，经过采用dpph自由基清除法(dpph法)和氧自由基清除能力法(orac法)两种体外抗氧化活性评价方法及抑制大鼠巨噬细胞no释放的活性测试，都表现出了较强的活性结果，并且活性还与温度、湿度以及阳光强度有关，还与采收期和土壤类型有关。此外，各产地之间的皂角刺活性也存在一定的差异。实施例4本实施例通过液相色谱法测定表1中样品编号为1-32的皂角刺的各成分含量采用agilentzorbaxsb-aqc18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱，流动相为甲醇-0.1％乙酸溶液梯度洗脱，检测波长为254nm，柱温35℃，流速为1.0ml/min，进样量为10μl时所得色谱图分离度和峰型均较好，色谱峰数目较多，分布均匀。记录色谱图至2倍保留时间(180min)，90min后无色谱峰出现，故分析时间为90min，记录峰面积。结果如表5所示(其中样品编号与表1中样品编号所代表的样品相对应)：表5由表5可知，皂角刺中花旗松素、黄颜木素等含量较高，这些物质的存在，大大促进皂角刺的抗氧化活性。此外，由实施例1-4的测试也可发现，不同产地的皂角刺其抗氧化活性也有一定的差异，样品编号为12-15以及18-20的皂角刺，其活性相对于其他地区的皂角刺，抗氧化活性更高。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的皂角刺在制备抗氧化剂或一氧化氮释放抑制剂中的应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12