沙枣树叶提取物及其提取方法和应用与流程

本发明涉及沙枣树叶提取和用途
技术领域：
，是一种沙枣树叶提取物及其提取方法和应用；本发明所述沙枣树叶提取物包括沙枣树叶提取物a和沙枣树叶提取物b，因此本发明包括沙枣树叶提取物a及其提取方法，以及沙枣树叶提取物a在制备清除超氧阴离子自由基或/和治疗机械性皮肤损伤或/和治疗人乳腺癌或/和治疗人慢性髓原白血病或/和治疗人肝癌或/和治疗腹水瘤药物中的应用；还包括沙枣树叶提取物b及其提取方法，以及沙枣树叶提取物b在制备清除超氧阴离子自由基或/和治疗机械性皮肤损伤或/和治疗人乳腺癌或/和治疗人慢性髓原白血病或/和治疗人肝癌或/和治疗人前列腺癌药物中的应用。
背景技术：
：沙枣(elaeagnusangustifolial.)属胡颓子科，又名银柳、桂香柳，七里香等。灌木或小乔木，高5-8米。树皮褐色，受伤后有胶汁流出，凝固为褐色胶。单叶，广披针形至卵圆形，长2厘米至8厘米，宽0.5厘米至4厘米，全缘，基部楔形，顶端钝或尖，正面绿色，有稀疏的鳞片，背面具银白色鳞片，叶柄短具鳞毛片。2006年，《中草药大典》记载沙枣叶为胡颓子科植物沙枣的叶，味辛涩，性凉。有清热解毒，抗菌消炎，活血止血的功能。用于细菌性痢疾，肠炎腹泻，慢性支气管炎，冠心病等。用量15克至30克。主要应用有：1.烧烫伤：沙枣叶120克，黄柏30克，水煎，用药液喷洒或湿敷创面。2.白带：沙枣叶15克，水煎服。3.外伤出血：沙枣叶适量，研粉外敷。1999年版《维吾尔药志》记载胡颓子科(elaeagnaceae)植物沙枣(elaeagnusangustifolial.)。维药名为吉嘎旦，具有健脾胃、止泻涩肠的作用，用于脾胃虚弱、消化不良、肠炎腹泻、肺热咳嗽等疾病的治疗。其果实和树叶均可入药。而沙枣叶提取物在清除超氧阴离子自由基、治疗机械性皮肤损伤、人乳腺癌、人慢性髓原白血病、人肝癌、人前列腺癌药物和腹水瘤方面，未见报道。技术实现要素：本发明提供了一种沙枣树叶提取物及其提取方法和应用，克服了上述现有技术之不足，本发明首次公开沙枣树叶提取物a及其提取方法和其在清除超氧阴离子自由基，治疗机械性皮肤损伤、人乳腺癌、人慢性髓原白血病、人肝癌和腹水瘤药物中的应用；并首次公开沙枣树叶提取物b及其提取方法和其在清除超氧阴离子自由基，治疗机械性皮肤损伤、人乳腺癌、人慢性髓原白血病、人肝癌和人前列腺药物中的应用。本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种沙枣树叶提取物a的提取方法，按下述方法进行：第一步，将沙枣树叶采用石油醚浸泡；第二步，将浸泡过后的沙枣树叶晾干；第三步，用乙酸乙酯对第二步得到的沙枣树叶回流提取5小时至6小时后得到乙酸乙酯提取液，将乙酸乙酯提取液浓缩和干燥后得到沙枣树叶提取物a。下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：上述第三步中，将乙酸乙酯提取液浓缩至粘稠状后，再将粘稠状的乙酸乙酯提取液干燥至呈固体状后得到沙枣树叶提取物a。上述第一步中，浸泡时间为8小时至10小时。本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种沙枣树叶提取物a，按下述方法得到：第一步，将沙枣树叶采用石油醚浸泡；第二步，将浸泡过后的沙枣树叶晾干；第三步，用乙酸乙酯对第二步得到的沙枣树叶回流提取5小时至6小时后得到乙酸乙酯提取液，将乙酸乙酯提取液浓缩和干燥后得到沙枣树叶提取物a。下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：上述第三步中，将乙酸乙酯提取液浓缩至粘稠状后，再将粘稠状的乙酸乙酯提取液干燥至呈固体状后得到沙枣树叶提取物a。上述第一步中，浸泡时间为8小时至10小时。本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种技术方案之二所述沙枣树叶提取物a在制备清除超氧阴离子自由基或/和治疗机械性皮肤损伤或/和治疗人乳腺癌或/和治疗人慢性髓原白血病或/和治疗人肝癌或/和治疗腹水瘤药物中的应用。本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种沙枣树叶提取物b的提取方法，按下述方法进行：第一步，将沙枣树叶采用石油醚浸泡；第二步，将浸泡过后的沙枣树叶晾干；第三步，用乙酸乙酯对第二步得到的沙枣树叶回流提取5小时至6小时，将经过回流提取后的沙枣树叶晾干；第四步，将第三步得到的晾干沙枣树叶采用水回流提取得到水提取液，将水提取液浓缩并干燥后得到沙枣树叶提取物b。下面是对上述发明技术方案之四的进一步优化或/和改进：上述第四步中，回流提取次数为两次；第一次回流提取时，水与沙枣树叶的质量比为11至12:1，第一次回流提取时间为2小时至2.5小时；第二次回流提取时，水与沙枣树叶的质量比为19至10:1，第一次回流提取时间为1小时至1.5小时，将两次得到的提取液合并得到水提取液。上述第四步中，将水提取液浓缩至密度为1.3g/ml至1.4g/ml后，再在60℃至62℃下干燥至呈固体状后得到沙枣树叶提取物b；或/和，第一步中，浸泡时间为8小时至10小时。本发明的技术方案之五是通过以下措施来实现的：一种沙枣树叶提取物b，按下述方法得到：第一步，将沙枣树叶采用石油醚浸泡；第二步，将浸泡过后的沙枣树叶晾干；第三步，用乙酸乙酯对第二步得到的沙枣树叶回流提取5小时至6小时，将经过回流提取后的沙枣树叶晾干；第四步，将第三步得到的晾干沙枣树叶采用水回流提取得到水提取液，将水提取液浓缩并干燥后得到沙枣树叶提取物b。下面是对上述发明技术方案之五的进一步优化或/和改进：上述第四步中，回流提取次数为两次；第一次回流提取时，水与沙枣树叶的质量比为11至12:1，第一次回流提取时间为2小时至2.5小时；第二次回流提取时，水与沙枣树叶的质量比为19至10:1，第一次回流提取时间为1小时至1.5小时，将两次得到的提取液合并得到水提取液。上述第四步中，将水提取液浓缩至密度为1.3g/ml至1.4g/ml后，再在60℃至62℃下干燥至呈固体状后得到沙枣树叶提取物b；或/和，第一步中，浸泡时间为8小时至10小时。本发明的技术方案之六是通过以下措施来实现的：一种技术方案之五所述沙枣树叶提取物b在制备清除超氧阴离子自由基或/和治疗机械性皮肤损伤或/和治疗人乳腺癌或/和治疗人慢性髓原白血病或/和治疗人肝癌或/和治疗人前列腺癌药物中的应用。本发明首次公开沙枣树叶提取物a及其提取方法和其在清除超氧阴离子自由基，治疗机械性皮肤损伤、人乳腺癌、人慢性髓原白血病、人肝癌和腹水瘤药物中的应用；并首次公开沙枣树叶提取物b及其提取方法和其在清除超氧阴离子自由基，治疗机械性皮肤损伤、人乳腺癌、人慢性髓原白血病、人肝癌和人前列腺药物中的应用；为所述疾病的治疗药物开发提供了新途径。附图说明附图1-a为模型组术后7d创面图片(he，×400)。附图1-b为云南白药组术后7d创面图片(he，×400)。附图1-c为沙枣树叶水提取部位组术后7d创面图片(he，×400)。附图2-a为沙枣树叶水提取物(沙枣树叶水提取部位)的抗氧化活性。附图2-b为维生素c的抗氧化活性。附图2-c为沙枣树叶乙酸乙酯提取物(沙枣树叶乙酸乙酯部位)的抗氧化活性。具体实施方式本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。本发明中，所述沙枣树叶水提取部位代表枣树叶提取物a，沙枣树叶乙酸乙酯提取部位代表枣树叶提取物b。下面结合实施例对本发明作进一步描述：实施例1：沙枣树叶提取物a，按下述提取方法得到：第一步，将沙枣树叶采用石油醚浸泡；第二步，将浸泡过后的沙枣树叶晾干；第三步，用乙酸乙酯对第二步得到的沙枣树叶回流提取5小时至6小时后得到乙酸乙酯提取液，将乙酸乙酯提取液浓缩和干燥后得到沙枣树叶提取物a。实施例2：沙枣树叶提取物a，按下述提取方法得到：第一步，将沙枣树叶采用石油醚浸泡；第二步，将浸泡过后的沙枣树叶晾干；第三步，用乙酸乙酯对第二步得到的沙枣树叶回流提取5小时或6小时后得到乙酸乙酯提取液，将乙酸乙酯提取液浓缩和干燥后得到沙枣树叶提取物a。实施例3：作为上述实施例的优化，第三步中，将乙酸乙酯提取液浓缩至粘稠状后，再将粘稠状的乙酸乙酯提取液干燥至呈固体状后得到沙枣树叶提取物a。实施例4：作为上述实施例的优化，第一步中，浸泡时间为8小时至10小时。实施例5：上述实施例所述沙枣树叶提取物a在制备清除超氧阴离子自由基或/和治疗机械性皮肤损伤或/和治疗人乳腺癌或/和治疗人慢性髓原白血病或/和治疗人肝癌或/和治疗腹水瘤药物中的应用。实施例6：沙枣树叶提取物b，按下述提取方法得到：第一步，将沙枣树叶采用石油醚浸泡；第二步，将浸泡过后的沙枣树叶晾干；第三步，用乙酸乙酯对第二步得到的沙枣树叶回流提取5小时至6小时，将经过回流提取后的沙枣树叶晾干；第四步，将第三步得到的晾干沙枣树叶采用水回流提取得到水提取液，将水提取液浓缩并干燥后得到沙枣树叶提取物b。实施例7：沙枣树叶提取物b，按下述提取方法得到：第一步，将沙枣树叶采用石油醚浸泡；第二步，将浸泡过后的沙枣树叶晾干；第三步，用乙酸乙酯对第二步得到的沙枣树叶回流提取5小时或6小时，将经过回流提取后的沙枣树叶晾干；第四步，将第三步得到的晾干沙枣树叶采用水回流提取得到水提取液，将水提取液浓缩并干燥后得到沙枣树叶提取物b。实施例8：作为实施例6至7的优化，第四步中，回流提取次数为两次；第一次回流提取时，水与沙枣树叶的质量比为11至12:1，第一次回流提取时间为2小时至2.5小时；第二次回流提取时，水与沙枣树叶的质量比为19至10:1，第一次回流提取时间为1小时至1.5小时，将两次得到的提取液合并得到水提取液。实施例9：作为实施例6至8的优化，第四步中，将水提取液浓缩至密度为1.3g/ml至1.4g/ml后，再在60℃至62℃下干燥至呈固体状后得到沙枣树叶提取物b；或/和，第一步中，浸泡时间为8小时至10小时。实施例10：上述实施例所述沙枣树叶提取物b在制备清除超氧阴离子自由基或/和治疗机械性皮肤损伤或/和治疗人乳腺癌或/和治疗人慢性髓原白血病或/和治疗人肝癌或/和治疗人前列腺癌药物中的应用。实施例11：沙枣树叶提取物b，按下述提取方法得到：称取干燥的沙枣树叶100g，沙枣树叶用石油醚浸泡过夜，进行脱脂。然后晾干树叶，再用乙酸乙酯连续回流提取6小时，之后晾干树叶。最后用水回流提取两次，第一次12倍量(质量)水2小时，第二次10倍量(质量)水1.5小时，合并滤液，减压浓缩至密度约1.30g/ml，60℃干燥，得到沙枣树叶水提取部位，即沙枣树叶提取物b。实施例12：沙枣树叶提取物a，按下述提取方法得到：称取干燥的沙枣树叶100g，沙枣树叶用石油醚浸泡过夜，进行脱脂。然后晾干树叶，再用乙酸乙酯连续回流提取6小时，将乙酸乙酯提取液减压浓缩至粘稠状，即浓缩至密度约1.25g/ml至1.30g/ml，然后转移至蒸发皿，水浴浓缩至干，得到沙枣树叶乙酸乙酯提取部位，即沙枣树叶提取物a。本发明所述沙枣树叶提取物a、沙枣树叶提取物b的药理试验如下：1.沙枣树叶提取物b对伤口愈合的影响。1.1实验方法选用18只雄性icr小鼠的背部创建全层皮肤伤口后，随机分为模型组、治疗组和阳性对照组(云南白药)。腹腔注射10％水合氯醛(4mg/kg)麻醉，背部剪毛，皮肤经消毒后，在背部开一个(10mm×10mm)正方形切口，切口深至筋膜层。暴露小鼠的伤口，单笼饲养。模型组未接受任何治疗。治疗组给予沙枣树叶提取物b0.1g，阳性对照组给予云南白药0.1g，每天给药2次，连续给药7天。连续三天对伤口的变化进行拍照。在伤后第1、3、5天，测量模型组、治疗组和阳性对照组的伤口大小，按照公式计算愈合率。在第7天，处死各组小鼠，取创面皮肤约1/2置于中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，he染色，光镜下观察组织生长情况。愈合率(％)＝(造模创面面积－愈合创面面积)/造模创面面积×100％。1.2统计分析采用microsoftexcel2003软件进行分析，计量资料以x±s表示，组间差异显著性采用方差分析，以p＜0.05为有显著性差异。1.3实验结果通过表1和表2可知，与模型组相比，沙枣树叶提取物b组和云南白药组伤口在第三天有明显的收缩，愈合率是模型组的近三倍，并且止血效果明显，没有出现溃脓现象。通过图1-a、图1-b、图1-c可知，沙枣提取物b新生肉芽组织较好，组织坏死少，有炎性肌纤维。结果表明，沙枣树叶提取物b可促进皮肤伤口愈合，可作为伤口愈合的治疗剂。以上所获得研究结果为后续开展沙枣树叶促进伤口愈合的有效部位和作用机理研究奠定了良好的实验基础。2.新疆沙枣树叶提取物对超氧阴离子自由基(o·)的清除作用。采用邻苯三酚自氧法，结果见表3至表5、以及图2-a、图2-b、图2-c。结果表明：超氧阴离子清除率越大，提取物抗氧化效果越好，从图上可以看出，在新疆沙枣树叶提取物中，沙枣树叶提取物b抗氧化作用最强。vc的ic50＝21.52mg/l。3.体外抗癌细胞活性实验3.1细胞株人非小细胞肺癌细胞a549、人乳腺癌细胞mcf-7、人肝癌细胞mhcc97-h、人胃癌细胞mgc80-3、人卵巢癌细胞sk-ov-3、人胃腺癌细胞(低分化)bgc-823、人结肠癌细胞lovo、人慢性髓原白血病细胞k562、人肝癌细胞hepg2、小鼠腹水瘤细胞s180、人食管癌细胞eca-109、人组织细胞淋巴瘤细胞u937、人恶性黑色素瘤细胞a375、人小细胞肺癌细胞nci-h446、人大细胞肺癌细胞nci-h460、人非小细胞肺癌细胞nci-h1299、人前列腺癌细胞pc3，均购自于中科院细胞库。3.2供试品沙枣树叶提取物b，沙枣树叶提取物a。保存条件：密封，置阴凉处保存。3.3阳性对照品顺铂(ddp)，由东京化成工业株式会社生产，批号：d3371，100mg/瓶。5-氟尿嘧啶，由amresco公司提供，批号：hfbm160120325008，1g/瓶。3.4主要试剂：高糖dmem培养基，hyclone公司，批号aam210569，500ml/瓶；胎牛血清，sciencell公司，批号m048-6，500ml/瓶；噻唑蓝，sigma公司，批号mkbh7489v，1g/瓶；二甲亚砜，国药集团化学试剂有限公司，批号20140612，500ml/瓶；胰蛋白酶，北京鼎国昌盛生物技术有限公司，批号04d10151，25g/瓶。3.5主要仪器：cj-1f型医用净化工作台(苏州冯氏实验动物设备有限公司)；台式低速离心机(湖南省凯达实业发展有限公司)；dmil型倒置显微镜(leica)；3111型co2培养箱(thermo)；mr-96a酶标仪(深圳迈瑞)；无菌针式过滤器(millipore)。3.6试验方法3.6.1细胞培养与接种肿瘤细胞株在37℃、5％co2的饱和湿度环境下，含10％胎牛血清的高糖dmem完全培养基中培养、传代。接种时用0.25％胰蛋白酶-edta消化液消化，加细胞培养基吹打成均匀细胞悬液，将细胞制成2×104/ml的细胞悬液，每孔100μl接种于96孔板中。3.6.2供试品配制与细胞生长抑制测定称取一定量供试品，用含10％胎牛血清的dmem完全培养基配制成2000μg/ml的母液，然后取适量，用含10％胎牛血清的dmem完全培养基配制成600、200、60、20、6μg/ml的工作液。ddp(癌症治疗的常用化学药物)和5-fu用dmem完全培养基配制成浓度为100、30、10、3、1、0.3μm的工作液。待细胞贴壁后每孔含不同浓度供试品和ddp的工作液100μl，每个浓度设3个复孔。分别于加药后48小时后，每孔加mtt溶液(培养基配成5mg/ml，过滤后避光保存)20μl，4小时后将上清液吸出，每孔加mtt溶解液dmso150μl，震荡待formazan完全溶解，酶标仪492nm测定od值。实验结果见表6，表6中，水提部位代表沙枣树叶提取物b，乙酸乙酯部位代表沙枣树叶提取物a。3.7实验结果通过表6可知，沙枣树叶提取物a对人乳腺癌细胞、人慢性髓原白血病细胞、人肝癌细胞以及腹水瘤细胞活性具有一定的抑制作用；沙枣树叶提取物b对人乳腺癌细胞、人慢性髓原白血病细胞、人肝癌细胞、人前列腺细胞活性具有一定的抑制作用；说明沙枣树叶提取物a和沙枣树叶提取物b具有较好的开发前景。综上所述，本发明首次公开沙枣树叶提取物a及其提取方法和其在清除超氧阴离子自由基，治疗机械性皮肤损伤、人乳腺癌、人慢性髓原白血病、人肝癌和腹水瘤药物中的应用；并首次公开沙枣树叶提取物b及其提取方法和其在清除超氧阴离子自由基，治疗机械性皮肤损伤、人乳腺癌、人慢性髓原白血病、人肝癌和人前列腺药物中的应用；为所述疾病的治疗药物开发提供了新途径。以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。表1.不同时间大鼠皮肤伤口面积变化表2.不同时间大鼠皮肤伤口面积愈合率变化表3vc抗氧化实验浓度(g/l)1/1621/541/181/61/2清除率(％)24.5829.9967.4195.1699.90表4沙枣树叶提取物b抗氧化实验浓度(mg/l)1.252.551020清除率％3.68212.6253.3181.4999.02表5沙枣树叶提取物a部位抗氧化实验浓度(mg/l)2550100200400清除率％14.8517.9824.1736.4154.78当前第1页12