专利名称：增加一氧化氮合成的方法
本申请要求美国临时申请60/018,071(1996年5月21日申请)的权益。
本发明范围本发明涉及有机化学和药理学领域并提供化合物及增加内皮一氧化氮(NO)，特别是增加血管内皮细胞中一氧化氮的合成方法。
本发明背景一氧化氮是在心血管、肠、中枢神经和免疫系统的正常生理中起极其重要作用的调节分子。一氧化氮是由称为NO合成酶(NOS)的酶族从L-精氨酸合成的。特别对本发明有密切关系的是在血管内皮细胞中产生钙依赖的NOS，称为eNOS。最近，有大量的研究把eNOS基因的调节与雌激素联系起来。已表面雌激素可上行调节eNOS m-RNA的产生以及随之发生的内皮细胞中的eNOS合成。这种eNOS数量上的增加使内皮细胞产生更多的NO以对应血管系统的适当刺激。
在脉管系统中，内皮衍生的NO有几种作用，可抑制血小板聚集，炎症细胞粘附，和平滑肌细胞的增殖。内皮衍生的NO是血管紧张(tone)状况的重要调节器。依赖流量的膨胀(内皮功能常用的指数)大部分是由NO进行调节的。
由NO调节血管紧张状况的机理是由在内皮，衬细胞(lining cell)上的刺激如乙酰胆碱、血管缓激肽、剪切应力(shear stress)等引发的。内皮细胞通过eNOS由L-精氨酸产生NO作出反应。产生的NO离开内皮细胞并在邻近的平滑肌细胞中刺激活性的鸟苷酸酯环化酶(guanylate cyclase)。鸟苷酸酯环化酶的活化增加cGMP的水平并引起平滑肌细胞的松弛，结果使血管膨胀，血流量增加。进一步的资料参见Moncada等，New Eng.J.Med.,329,pp.2002-2012(1993)和Vallance等，J.Royl.Coll.Physician London,28,pp 209-219(1994)。
减少内皮NO生成可导致血管舒张不能，异常血管痉挛。增加血小板聚集和增加炎症细胞的粘附和浸润。内皮NO减少和内皮功能损伤与冠状动脉疾病危险因素有关，包括吸烟，血胆固醇过多，高半胱氨酸尿(homocycteinuria)和糖尿病。在冠状动脉中NO调节活性的改变可诱发急性冠状综合症，引起心肌梗塞。内皮NO系统受损及其引起的血管收缩与大脑局部缺血如中风时加重对神经元的损害有关。另外，最近研究表明内皮NO可调解血管对胰岛素的敏感性，这样增加NO的产生可用于治疗糖尿病的血管作用。
总之，在实验和临床上有大量证据表明在脉管系统中增加NO水平对许多病理性疾病如糖尿病、中风、动脉粥样硬化和高血压是有益的。
目前增加脉管系统中NO水平的疗法或是给予高剂量的L-精氨酸(eNOS的底物)或是给予化合物如硝酸甘油或硝普钠(代谢释放NO)。虽然这些治疗是有效的，但每种都显示出不希望的副作用。另外，由于NO迅速从体内清除，使这样疗法无法保持NO的缓慢释放。
如果新的疗法在脉管系统中可增加NO的浓度，这将具有极大的益处。
本发明概述本发明提供增加内皮衍生NO的方法，它包括对其需要的人给予的有效量式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物
其中R是氢，-OH、-O(C1-C4烷基)、-OCO(C1-C4烷基)或-OCOAr，其中Ar是苯基或任选取代的苯基；R1是R、-Cl或-F；R2是1-吡咯烷基、1-哌啶基，或1-六亚甲基亚氨基。
本发明详细论述本发明涉及发现化合物式(Ⅰ),2-芳基苯并[b]噻吩的选择基团用于增加eNOS和内皮衍生NO的浓度。
在此描述化合物中所用的一般性术语具有其通用意义。例如，“C1-C4烷基”指1-4个碳原子的直链或支链脂族链包括甲基、乙基、丙基、异-丙基、正-丁基等。
术语“取代的苯基”指具有选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羟基、硝基、氯、氟或三(氯或氟)甲基的一个或二个取代基的苯基。“O(C1-C4烷基)”指通过氧桥连接的C1-C4烷基如甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、异-丙氧基等。
术语“药学上可接受的盐”指已知无毒性和在药学文献中常使用的或酸或碱的加成盐。常用酸加成盐包括由硫酸、硝酸、盐酸、氢溴酸、磷酸和亚磷酸等加成形成的无机盐；或由乙酸、甲酸、苯甲酸、柠檬酸、甲磺酸等加成形成的有机盐。常用碱加成盐包括由碱金属或碱土金属氢氧化物、氢氧化铵、烷基或芳族胺等形成的盐。本发明优选盐是盐酸盐。
短语“抑制与缺乏或需要一氧化氮(NO)有关的生理状况”包括阻止、预防、抑制和减缓、停止或逆转所述生理状况的进展，严重性或产生的症状或作用。这样的生理状况包括在本申请中提及的，如病理性血小板聚集、病理性血管收缩、糖尿病的血管作用、中风、动脉粥样硬化和异常血管痉挛。
术语“溶剂化物”代表一种聚集，包括一个或多个溶质分子如式Ⅰ化合物与一个或多个适当的溶剂分子构成。
本发明优选的实施例Raloxifene盐酸盐是式Ⅰ化合物，其中R和R1各自是羟基；R2是1-哌啶基，和它的盐酸盐。Raloxifene名称为[2-(4-羟苯基)-6-羟苯并[b]噻吩-3-基][4-[2-(1-哌啶基(piperidenyl))乙氧基]苯基]甲酮盐酸盐。
一般讲，至少一种式Ⅰ化合物与常用的赋形剂、稀释剂或载体构成配方并压成片剂或配成便于口服给药的酏剂或溶液或经肌肉或静脉途径给药。也可以配制成缓释剂型等经透皮给予所述的化合物。
本发明方法中所使用的化合物是根据已建立的方法来制备的，如美国专利4133814、4418068、4380635和5393763中介绍的。在此全部结合本发明作具体参考。一般而言，所述方法起始于具有6-羟基和2-(4-羟苯基)基团的苯并噻吩。保护、酰化、脱保护起始化合物形成式Ⅰ化合物。在上述讨论的美国专利中提供制备这样化合物的实施例。
在本发明方法中所用的化合物与各种有机和无机酸和碱形成药学上可接受的酸和碱加成盐和包括在药物化学中所常用的药学上可接受的盐。这些盐也是本发明的一部分。形成这样盐所使用的典型的无机酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、连二磷酸等。也可以使用有机酸衍生成盐，如脂族单和双羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸和羟基链烷二酸、芳族酸，脂族和芳族磺酸。这样，药学上可接受的盐包括乙酸盐，苯基乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、抗坏血酸、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、O-乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、溴化物、异丁酸盐、苯基丁酸盐、β-羟基丁酸盐、丁炔1,4-二酸盐、己炔-1,4-二酸盐、癸酸盐、辛酸盐、氯化物、肉桂酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、富马酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、偏桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、异烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、水杨酸盐、癸二酸盐、丁二酸盐、辛二酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、焦硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磺酸盐、苯磺酸盐、对-溴苯基磺酸盐、氯苯磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟乙磺酸盐、甲磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、酒石酸盐等。优选盐是盐酸盐。
使式Ⅰ化合物与等量或过量的酸反应一般可形成药学上可接受的酸加成盐。通常在乙醚或苯的互溶剂中结合反应物。在约1小时至10天内盐从溶液中沉淀出来，经过滤分离出沉淀或用常规手段汽提溶剂。
如在此所使用的，术语“有效量”意思是能够增加需要治疗的患者中内皮衍生NO浓度的式Ⅰ化合物的用量。需要此种治疗的患者包括(但不限于此)患有血管收缩或不适当的血小板聚集，原因是由冠状疾病危险因素，糖尿病等引起内皮NO调节通道的损害。如本发明所预见的，式Ⅰ化合物可用于抑制、改善、减少、限制或预防由于内皮NO调节通道的损害引起的病理性后遗症。
当然，通过围绕病例的特定情况包括如所给予的化合物、给药途径、患者的状况和所治疗的病理症状将决定根据本发明给予化合物的特定剂量。一般每日剂量将含有非毒性剂量水平从约0.1mg-约1000mg/天的本发明化合物和更优选为约15mg-约80mg/天，每日1-3次或更多次以维持所需要的作用。
另外，式Ⅰ化合物可以同时或依次与内皮NO通道相互作用的其它药物，如，硝酸甘油、硝普钠、L-精氨酸等进行使用。
“药学上可接受的制剂”意思为载体、稀释剂、赋形剂和盐必须与制剂中的活性成分(式Ⅰ化合物)相配伍并对其接受者不产生损害。
通过本领域熟知的方法可制备药用制剂。例如，本发明化合物可与常用的赋形剂、稀释剂或载体进行配制并形成片剂、胶囊等。适合这样制剂的赋形剂、稀释剂和载体的实例包括如下填充剂和膨胀剂如淀粉、糖、甘露醇和硅衍生物；粘合剂如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；延缓溶解剂如石蜡；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇、硬脂酸单甘油酯；吸附载体如白陶土和皂粘土和润滑剂如滑石、硬脂酸钙和镁和固体聚乙二醇(polyethylglycols)。最终的药用形式可以是丸剂、片剂、粉剂、锭剂、糖浆剂、气溶胶、小囊、扁胶囊、酏剂、悬浮剂、乳剂、软膏剂、栓剂、无菌注射液或无菌包装的粉剂、取决于所使用赋形剂的类型。
另外，本发明化合物很适合配制成缓释剂型。也可以构成制剂仅释放活性成分或优选在肠道的特定部分中释放，并可能超时。这样的制剂包括包衣、包层或由聚合物质或蜡构成的保护部分的基质。
下列给出的制剂是说明目的并非受任何方式的限制。在这样的制剂中活性成分总量为制剂的0.1％-99.9％(重量)。术语“活性成分”意思为式Ⅰ化合物或其盐或溶剂化物。
制剂制剂1明胶胶囊根据下列制备硬明胶胶囊
混合以上成分，过45目美国筛并填充到硬明胶胶囊。
符合所提供的合理的变化，可以改变上述制剂。
使用下列成分制备片剂制剂2片剂
混合所述成分并压成片剂。
另外可制备每片含2.5-1000mg的活性成分的片剂如下制剂3片剂
将活性成分，淀粉和纤维素过45目美国筛并充分混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液与得到的粉末混合，然后过14目美国筛。所产生的颗粒在50℃-60℃干燥并过18目美国筛。将羧甲基淀粉钠，硬脂酸镁和滑石预先过60目美国筛，然后加到颗粒中，混合后，在压片机上压成片剂。
制备每5ml剂量含0.1-1000mg药物的悬浮液如下制剂4悬浮液
<p>将药物过45目美国筛并与羧甲基纤维素钠和糖浆混合形式均匀浆糊。用部分水稀释苯甲酸溶液、调味剂和着色剂。然后加入足量水产生所需的体积。
制备含有下列成分的气溶胶溶液制剂5气溶胶
将活性成分与乙醇混合，将混合物加入部分的抛射剂22中，冷却至30℃，并转移至灌充装置中。然后将需要量灌入不锈钢罐内并用余下的抛射剂稀释。然后将阀安装罐上。栓剂制备如下制剂6栓剂
活性成分过60目美国筛并悬浮于预先稍加热融熔的饱和脂肪酸甘油酯中。然后将混合物倾入2g(公秤)容量的栓模中并冷却。
制备静脉制剂如下制剂7静脉注射液
以约每分钟1ml速度将上述成分溶液静脉给予患者。
试验万法作为应用本发明化合物提高内皮组织中NO浓度的证据，使用下列试验系统。
细胞培养从Clonetics Corporation,San Diego CA，购得冷藏单供体人脐-静脉内皮细胞(HUVEC)。Clonetics定义这些细胞为1°(第一代细胞)。将细胞贮存液氮中，每次实验取新鲜整份量。解冻细胞并置于有75ml介质的T-75烧瓶中。对全部HUVEC的培养，用0.2％明胶(SigmaChemical Co.)在M 199介质中(Gibco)于37℃对Labware(制成粒)包衣20分钟。在酚红游离M199中，具有10％胎牛血清(Gibco)、50μg/ml内皮细胞生长补充物(Collaborative Biochemical Products.Bedford MA),100μg/ml的猪肝素(Gibco),10单位/ml的青霉素，10μg/ml的链霉素和0.2mM的L-谷氨酰胺在37℃和5％CO2下使细胞生长。当2°培养细胞达到70-90％融合时，使其分离成1∶3到明胶包衣的具有15ml介质的T-75烧瓶中产生3°培养细胞。该培养达到70-90％融合之后，一般3-4天，将4°培养细胞分离成1∶3到在1ml介质中的包衣的12孔平板中。所有实验均用这些第四代细胞进行。72小时后，细胞融合并引入药物处理。抽吸掉原介质并加入1ml具有药物的药物试验介质(15％阉割马血清(Gemini Bioproducts Calabasas CA,10单位/ml的青霉素，10μg/ml的链霉素和0.2mM的L-谷氨酰胺)。在10mM的DMSO中制备试验式Ⅰ化合物或17-β-雌二醇的储备溶液。用药物在37℃处理细胞48小时。
取决cGMP的一氧化氮的诱导从培养器中取出3个平板(一次实验)并置于纸巾中，防止冷却。一次一平板上除去介质并加入1ml温热的HBSS(Gibco)。除去之并用0.5ml的平衡缓冲液+/-200μl的L-NAME(N-硝基-L-精氨酸甲基酯，Sigma)置换。平衡缓冲液组成为HBSS、10mM HEPES 1.2mM CaCl2、0.6mM MgSO4和0.5mM异丁基甲基磺嘌呤(IBMX)和10μM L-精氨酸，新鲜加入份储备溶液中。在37℃在DMSO中将IBMX制为200mM储备溶液。使细胞在37℃5％CO2中平衡30分钟。培养后，加入具有刺激剂的0.5ml“刺激”缓冲液10分钟。刺激缓冲液对照品组成为平衡缓冲液加指定刺激剂。其中为1)阴性对照。2)阳性对照，1mM硝普钠(Sigma)。3)1μM的A-23187(钙离子载体)(Sigma)。4)1μM的A-23187和200μM的L-NAME(本对照显示在测定中所见的作用(cGMP增加)仅是由于内皮细胞产生NO.)。用1μM的A-23187刺激经式Ⅰ化合物处理的试验细胞。10分钟后，除去缓冲液并加入200μl的0.01N HCl，在4℃经轻摇细胞30分钟提取cGMP。将每200μl一份置于含2μl的1N NaOH试验中。于-20℃冷冻样品并贮存。向平板的每孔加入250μl的0.1N NaOH中的0.5％SOS，使粘附细胞溶解。用塑料包装包缠平板并在-20℃冷冻，为随后经BCA方法(PierceChemical Co)的蛋白分析之用。(对实验中所有孔测定每mg中平均蛋白总量并使其标准化成cGMP含量)。按乙酰化操作记录每条生产指示，经酶免疫分析(Amersham Co,RPN,226)测定cGMP含量。除200μl样品用20μl试剂乙酰化代替100μl对1ml样品外，按每条指示进行分析。在最大热分光光度仪于450nM进行定量分析。
17-β-雌二醇的阳性对照表明在取决cGMP的NO数量上有预期的增加。发现式Ⅰ化合物可增加NO的浓度和在内皮细胞中诱导cGMP。在表1中，显示了raloxifene盐酸盐取决于cGMP的NO的增加。
表1化合物 浓度acGMP水平b对照品 ----- 1.30Raloxifene0.1 2.55*apM/ml1.0 2.65*bpM/mg的蛋白*p＞0.
权利要求
1．在其需要的人中增加血管内皮细胞中一氧化氮(NO)合成的方法，包括对所述人给予式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物
其中R是氢，-OH、-O(C1-C4烷基)、-OCO(C1-C4烷基)或-OCOAr，其中Ar是苯基或任选取代的苯基；R1是R、-Cl或-F；R2是1-吡咯烷基、1-哌啶基，或1-六亚甲基亚氨基。
2．根据权利要求1的方法，其中所述式Ⅰ化合物是[2-(4-羟基苯基)-6-羟基苯并[b]噻吩-3-基][4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]甲酮盐酸盐。
3．抑制与缺乏或需要一氧化氮(NO)有关的生理状况的方法，包括对其需要的人给予式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
其中R是氢，-OH、-O(C1-C4烷基)、-OCO(C1-C4烷基)或-OCOAr，其中Ar是苯基或任选取代的苯基；R1是R、-Cl或-F；R2是1-吡咯烷基、1-哌啶基，或1-六亚甲基亚氨基。
4．根据权利要求3的方法，其中所述式(Ⅰ)化合物是[2-(4-羟基苯基)-6-羟基苯并[b]噻吩-3-基][4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]甲酮盐酸盐。
全文摘要
本发明提供在血管内皮细胞增加一氧化氮(NO)浓度的方法,包括给予式Ⅰ化合物。其中:R是氢,－OH、－O(C
文档编号A61K31/4535GK1219128SQ97194727
公开日1999年6月9日 申请日期1997年5月16日 优先权日1996年5月21日
发明者J·P·辛格, D·L·乌德 申请人:伊莱利利公司