曲札茋苷或其衍生物在制备防治脑水肿药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及曲札茋苷或其衍生物在制备防治脑水肿药物中的应用。

背景技术：

脑水肿是指脑内水分增加、导致脑容积增大的病理现象，是脑组织对各种致病因素的反应。是继发于多种脑疾病的最终病理现象，是形成脑疝而致死的主要因素，多年来一直是脑科学研究的热点[1](1涂悦，杨细平，商崇智.醒脑静对颅脑创伤的保护作用[j].中国应用生理学杂志，2014，30(3)：230-232.)。临床上常见于神经系统疾病，多种因素均可引起脑水肿，如缺血、缺氧、出血、颅内损伤、炎症、脑代谢障碍、脑肿瘤以及中毒等。脑水肿起病急、发病快，其不仅可以导致脑组织细胞(神经元、神经胶质细胞)内环境破坏，引起神经功能障碍，而且可造成颅内高压，影响脑的血液灌流，进一步加重脑组织水肿，形成脑疝甚至导致患者死亡。目前，对脑水肿的治疗多采用脱水疗法，然而却不能获得满意的效果。究其原因，是因为迄今为止人们对中枢神经系统水、电解质运输平衡的机制尚不清楚。因此，围绕这一问题进行研究具有十分重要的意义。

目前对脑水肿形成的分子机制仍不十分清楚，根据其发病机制一般将脑水肿分为两类，即细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿。细胞毒性脑水肿主要表现为水分在细胞内滞留，细胞肿胀，但血脑屏障(blood-brainbarrier，bbb)仍保持完整；血管源性水肿则主要由bbb受损引起的毛细血管通透性增加，水分渗出增多，积存于血管周围及细胞间质所致。目前临床上治疗脑水肿仅仅是对症治疗，没有特效治疗药物，易造内环境紊乱，故需进一步研究脑水肿的发病机制，并为进一步的药物研发提供理论依据。许多临床和实验研究表明，脑缺血、缺氧、出血等损伤均可引起能量耗竭、自由基生成、钙超载、炎症反应以及神经内分泌改变如兴奋性氨基酸、缓激肤等活性物质释放增加，神经元凋亡等诸多因子参与，促进脑水肿。临床上常用药物有脱水剂、利尿剂和糖皮质激素三大类，但均有较多的毒副作用。近年来，出现了钙离子阻滞剂、自由基清除剂、细胞因子拮抗剂、血脑屏障保护剂、no合酶抑制剂、等，但目前尚无一种特效药物能很好地逆转脑水肿病理过程，并从根本上解决其病理变化，达到治疗目的。因此，探索疗效好而副作用小的治疗脑水肿的药物是研究的热点。

曲札茋苷((e)-1-(3，5-二羟苯基)-2-(3-羟基-4-o-β-d-吡喃葡萄糖苯基)乙烯或3，5，3'，4'-四羟基茋-3'-o-β-葡萄糖苷)，其植物来源为拉萨大黄根茎，白皮杉醇为曲札茋苷的苷元。中国专利(申请号：2011110371198.0)《一种测定拉萨大黄中曲札茋苷含量的高效液相色谱方法》；中国专利(申请号：201110253242.8)《一种制备白皮杉醇的方法》公开了曲札茋苷的提取工艺、检测方法及制备曲札茋苷的苷元白皮杉醇的方法。现有技术中未见曲札茋苷在治疗和/或预防脑水肿药物中的用途报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供曲札茋苷或其衍生物在制备防治脑水肿药物中的应用，研究表明，曲札茋苷或其衍生物能够用于防治多种因素导致的脑水肿。

本发明提供了曲札茋苷或其衍生物在制备防治脑水肿的药物中的应用。

本发明通过实验发现曲札茋苷能明显降低小鼠局灶永久性脑缺血模型、全脑缺血再灌注模型、脂多糖致感染模型、大鼠脑出血模型四种模型小鼠的脑含水量，提示注射用曲札茋苷对上述多种原因引起的脑水肿均具有潜在的治疗作用。

本发明中，所述脑水肿为卒中性脑水肿和/或感染性脑水肿。一些具体实施例中，所述卒中性脑水肿包括：出血性脑水肿或缺血性脑水肿。

所述出血性脑水肿指脑出血后继发的脑水肿。所述缺血性脑水肿包括局灶永久性脑缺血继发的脑水肿和/或全脑缺血再灌注继发的脑水肿。一些具体实施例中，所述感染性脑水肿为脂多糖致感染的脑水肿。

本发明中，所述防治包括对脑水肿的预防和/或治疗。在本发明实施例中，所述防治的作用包括：降低脑含水量、抑制血管与细胞周围间隙增宽、抑制神经细胞水肿、抑制细胞空泡化和/或抑制神经元固缩。

对实验动物进行组织病理学检查显示：假手术组脑组织形态未见明显病理改变；模型组小鼠脑组织可见血管和细胞周围间隙增宽，神经细胞水肿，大量细胞明显空泡化(气球样变)，可见嗜酸性神经元及其固缩核等病理改变；各给药组与模型组相比，脑组织病理形态均有不同程度的改善。

对实验动物进行脑含水量的检测，试验结果显示：模型组小鼠脑含水量显著高于假手术组(p<0.01)，表明造模动物脑水肿明显；而各给药组均能不同程度降低模型小鼠的脑含水量。

本发明还提供了，曲札茋苷或其衍生物在制备防治脑血肿药物中的应用。脑出血动物造模后，模型组动物脑内血肿，即hb水平在术后均明显增高，造模同时静脉给予注射用曲札茋苷，与模型组比，三个剂量组对造模24h后的hb水平均有显著降低(p<0.01或p<0.05)；在造模后72h，各组大鼠的hb水平均有所下降，与模型组比，给予注射用曲札茋苷后hb水平均有降低趋势，但无统计学差异。

本发明中，所述曲札茋苷衍生物为白皮杉醇。

本发明还提供了一种防治脑水肿的药物，含有曲札茋苷或其衍生物。

本发明中，所述药物还包括其他用于治疗脑水肿的药物。

一些具体实施例中，所述其他用于治疗脑水肿的药物选自依达拉奉、丁苯酞、尼莫地平、甘露醇。

本发明所述药物的剂型为注射液剂或粉针剂。

本发明实施例中，采用的药物剂型为注射剂。其中，曲札茋苷在处方中质量分数为9％～20％

本发明还提供了一种防治脑水肿的方法，其为给予含有曲札茋苷或其衍生物的药物。

所述防治包括预防和/或治疗。所述预防作用是指在脑水肿发生前给予本发明所述的药物。本发明实施例中，在脑水肿发生前3天，连续3天给予本发明所述的药物。所述给予的方式为腹腔注射或静脉注射。所述治疗是指在脑水肿发生后给予本发明所述的药物。在本发明实施例中，在脑水肿发生后1h给予本发明所述的药物，所述给予的方式为腹腔注射或静脉注射。本发明中，所述给予的剂量为5～20mg·kg^-1·d^-1。

本发明通过实验发现曲札茋苷能明显降低小鼠局灶永久性脑缺血模型、全脑缺血再灌注模型、脂多糖致感染模型、大鼠脑出血模型四种模型小鼠的脑含水量，提示注射用曲札茋苷对上述多种原因引起的脑水肿均具有潜在的治疗作用。本发明的有效成分可以从植物中提取，所用药物价格便宜、容易获得，市场前景好。

附图说明

图1对局灶永久性脑缺血小鼠脑脑组织病理形态学的影响(×100)；其中，图1-a示假手术(给予氯化钠注射液)组，未见明显病理改变；图1-b示模型(给予氯化钠注射液)组血管和细胞周围间隙增宽明显，神经细胞水肿明显，大量细胞明显空泡化(气球样变)，大量神经元固缩；图1-c示给予依达拉奉10mg/kg的实验组，血管和细胞周围间隙增宽，神经细胞水肿，部分细胞空泡化(气球样变)，少量神经元固缩；图1-d示给予丁苯酞8.3mg/kg的实验组，血管和细胞周围间隙增宽，神经细胞水肿，少量神经元固缩；图1-e示给予甘露醇2.0g/kg的实验组，血管和细胞周围间隙增宽，神经细胞水肿，个别空泡化，少量神经元固缩；图1-f示给予曲札茋苷16mg/kg的实验组，血管和细胞周围间隙增宽，神经细胞水肿，少量空泡化，少量神经元固缩；图1-g示给予曲札茋苷8mg/kg的实验组，血管和细胞周围间隙增宽，神经细胞水肿，少量空泡化，个别神经元固缩；图1-h示给予曲札茋苷4mg/kg的实验组，血管和细胞周围间隙增宽，神经细胞水肿，少量空泡化，少量神经元固缩；

图2示对全脑缺血/再灌注小鼠脑含水量的影响，其中，与假手术组相比，a:p<0.05，b:p<0.01；与模型组相比，c:p<0.05，d:p<0.01；

图3示对lps致感染性小鼠脑含水量的影响，其中，与假手术组相比，a:p<0.05，b:p<0.01；与模型组相比，c:p<0.05，d:p<0.01。

具体实施方式

本发明提供了曲札茋苷或其衍生物在制备防治脑水肿药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例：

1.试验材料

1.1动物spf级icr小鼠(体重20～30g)、sd大鼠(体重：200-250克)全雄，由昆药集团股份有限公司实验动物室提供，生产许可证：scxk(滇)k2014-0001；饲养于ivc动物实验室，温度20～26℃，湿度40％～70％，照明12h：12h明暗交替，照度150～300lx，噪音≤60db，实验动物使用许可证：syxk(滇)k2014-0001，发证单位：昆明市科学技术局。

1.2药物与试剂注射用曲札茋苷(批号：170101，规格：20mg/支，由昆药集团药物研究院提供)：依达拉奉注射液(批号：170406，昆明积大制药股份有限公司)；甘露醇注射液(批号：s1704007，上海百特医疗用品有限公司)；丁苯酞氯化钠注射液(批号：20170109，石药集团恩必普药业有限公司)；蛋白酶抑制剂，sigma，批号：031m7030v；水合氯醛(批号：119957，cas号：302-17-0，山东西亚化学工业有限公司出品)；脂多糖(lps)(exp2019/04，sigma公司)；氯化钠注射液(批号：a160301d1，科伦药业浙江国镜药业有限公司)；

1.3仪器ar224型电子天平(称量试药及脑重)，奥豪斯仪器(上海)有限公司；bl-2000型电子天平(称量动物)，厦门拜伦斯电子科技有限公司；hg-9245a型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；牙科钻：strong90saeshinprecisionind.co.sxp-1b；手术显微镜，上海医用光学仪器厂生产；电泳仪：北京百晶生物技术有限公司；varioskanflash全波长多功能酶标仪：thermofisherscientific；离心机：上海医疗器械有限公司；成像仪：cellbiosciences；容量瓶、剪刀、弯镊、止血钳、动脉夹、秒表，国产；直径0.128mm尼龙线，日本。

1.4统计学处理采用spss17.0软件，实验数据用平均数±标准差表示，方差齐时组间比较采用lsd检验，方差不齐时组间比较采用dunnett’st3检验。p<0.05有统计学意义，p<0.01有显著统计学意义。

2.试验方法

2.1对局灶永久性脑缺血小鼠脑含水量的影响参考huang等的线栓法，选择26～30g雄性icr小鼠，以4％的水合氯醛腹腔注射麻醉(400mg·kg^-1.bw)后，切开右侧颈部皮肤，分离、结扎右侧颈总动脉近心端及颈外动脉，在颈总动脉分叉处的近端2～3mm处切口，插入直径为0.125mm的尼龙线8～10mm，线栓进入ica、穿过大脑中动脉(mca)起始端至大脑前动脉近端，阻断mca的所有血流来源，结扎备线并缝合皮肤，假手术组除不插线外其余均同模型组。模型动物循环分为8组：假手术组；模型对照组；阳性对照依达拉奉10mg·kg^-1、丁苯酞组8.3mg·kg^-1及甘露醇2.0g·kg^-1组；曲札茋苷高、中、低剂量(16、8、4mg·kg^-1)组。于造模后1h，各组动物分别按20ml·kg^-1体重尾静脉注射给药，模型组和假手术组给予等体积氯化钠注射液。保证每组纳入合格动物数为14只，给药后24h，每组1-11号动物取脑称重，并于80℃干燥恒重，按干湿质量法计算脑含水率；每组12-14号动物快速取脑，置于10％甲醛溶液中固定后进行组织病理学检查。为减小试验的系统误差，造模、分组、给药、取脑及称量均平行操作。

脑含水率＝(湿脑重－干脑恒重)/脑湿重×100％

2.2对全脑缺血/再灌注小鼠脑含水量的影响选择24～28g雄性小鼠96只，按体重随机分为8组：假手术组；模型组；阳性对照依达拉奉12mg·kg^-1、丁苯酞10mg·kg^-1组及甘露醇2.0g·kg^-1组；曲札茋苷20、10、5mg·kg^-1组；每组12只。各组动物每日按20ml·kg^-1体重腹腔注射给药1次，连续3d；对照组和模型组给予等体积氯化钠注射液。末次给药前，小鼠以400mg·kg^-1水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰位固定，行颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，用微型动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉阻断血流5min，松开动脉夹使血流复灌10min，然后再阻断5min，如此反复3次；假手术组只分离双侧颈总动脉，不阻断血流。造模完成，缝合伤口，将小鼠回笼饲养。于造模后1h每组按剂量腹腔注射行末次给药，24h后脱颈椎处死小鼠，取脑称重，按2.1试验方法测定脑含水量。为减小系统误差，造模、给药、取脑及称量均平行操作。

2.3对脂多糖致感染性小鼠脑含水量的影响参考alexander等方法并加以改良。选20-24g雄性小鼠96只，按体重随机分为8组：空白对照组；模型组；阳性对照依达拉奉12mg·kg^-1、丁苯酞10mg·kg^-1组及甘露醇2.0g·kg^-1组；曲札茋苷20、10、5mg·kg^-1组；每组12只。各组动物每日按20ml·kg^-1体重腹腔注射给药1次，连续3d；空白对照组和模型组给予等体积氯化钠注射液。末次给药前1h，除空白对照组腹腔注射氯化钠注射液外，其余各组均按10ml·kg^-1体重腹腔注射lps；造模1h后行末次给药。于造模后6h，脱颈椎处死小鼠，取脑称重，按2.1试验方法测定脑含水率。为减小系统误差，造模、末次给药、取脑、干燥及称量均平行操作。

2.4对脑出血大鼠脑含水量的影响

选择200-250g健康雄性sd大鼠，用10％水合氯醛腹腔注射进行麻醉，头部备皮并应用碘伏常规消毒后，俯卧位固定于定向仪上，前囟抬高1mm，取长度约为2cm正中纵形切口，小型扩皮器牵开切口，取前囟点中线右侧旁开3.0mm，沿矢状面向后1.5mm，牙钻钻透颅骨，深及骨膜。消毒后在鼠尾腹侧正中做一纵行切口，抽取尾动脉不加抗凝剂的动脉血液约60～70μl。将针头垂直于颅骨骨孔的方向，进针约6mm，缓慢注入50μl自体动脉血液，时间以两分钟为宜；为防止鼠血反流，将针留置10min。缓慢退针，骨蜡封闭颅骨骨孔，缝合手术创口。模型动物按体重随机分为7组：空白对照组(24h、72h)；模型组(24h、72h)；阳性对照尼莫地平0.5mg/kg组(24h、72h)及甘露醇2.0g·kg^-1组(24h、72h)；曲札茋苷20、10、5mg·kg^-1组(24h、72h)；各组动物分别按20ml·kg^-1体重尾静脉注射给药，模型组和假手术组给予等体积氯化钠注射液。保证每组纳入合格动物数为12只，分别于给药后24h、72h，脱颈椎处死大鼠，6只取脑称重，按2.1试验方法测定脑含水率；另6只通过hb量反应评价病侧区域血肿大小。

3.试验结果

3.1对局灶永久性脑缺血小鼠脑含水量的影响试验结果显示：模型组小鼠脑含水量显著高于假手术组(p<0.01)，表明大脑中动脉阻塞后25h小鼠脑水肿明显；各给药组于脑梗后1h单次静脉注射给药，均能不同程度降低模型小鼠的脑含水量，除曲札茋苷低剂量组作用接近统计学差异(p＝0.0541)外，其余所有给药组与模型组相比均具有统计学差异(p<0.05/0.01)；结果见表1。

组织病理学检查显示：假手术组脑组织形态未见明显病理改变；模型组小鼠脑组织可见血管和细胞周围间隙增宽，神经细胞水肿，大量细胞明显空泡化(气球样变)，可见嗜酸性神经元及其固缩核等病理改变；各给药组与模型组相比，脑组织病理形态均有不同程度的改善。结果见图1。

表1对局灶永久性脑缺血小鼠脑含水量的影响

注：与假手术组相比，a:p<0.05，b:p<0.01；

与模型组相比，c:p<0.05，d:p<0.01

3.2对全脑缺血/再灌注小鼠脑含水量的影响试验结果显示：模型组小鼠脑含水量显著高于假手术组(p<0.01)，表明全脑缺血/再灌注小鼠脑水肿明显；各给药组连续腹腔注射给药3天，均能明显降低模型小鼠的脑含水量，与模型组相比均具有统计学差异(p<0.05)。结果见图2。

3.3对脂多糖致感染性小鼠脑含水量的影响试验结果显示：模型组小鼠脑含水量显著高于假手术组(p<0.01)，表明lps致感染模型小鼠脑水肿明显；各给药组连续腹腔注射给药3天，均能明显降低模型小鼠的脑含水量，与模型组相比均具有统计学差异(p<0.05/0.01)。结果见图3。

3.4对脑出血大鼠脑含水量的影响

脑出血模型建立后后24h，与假手术组比，模型组大鼠脑组织含水量升高明显，有统计学意义(p<0.01)。与模型组比，阳性对照组、曲札茋苷高、中剂量组大鼠脑组织含水量明显降低，有统计学意义(p<0.05)。脑出血模型建立后72h，各组大鼠脑组织含水量均有所降低，与模型组比，治疗组大鼠脑组织含水量于均有不同程度的下降。见表2。

脑出血模型建立后24h，模型组大鼠脑组织含水量达高峰，72h后就有所降低。24h与模型组比，治疗组大鼠hb下降有显著性差异；72h因模型组hb也有一定下降，治疗组大鼠hb均有不同程度的下降，但无显著性差异，这与时间有关。

表2对脑出血大鼠脑含水量的影响

注：与假手术组比##p<0.01；

与模型组比**p<0.01，*p<0.05。

表3曲札茋苷对脑出血大鼠病侧区hb的影响

与假手术组比##p<0.01；与模型组比**p<0.01，*p<0.05。

综上，曲札茋苷对小鼠局灶永久性脑缺血模型、全脑缺血再灌注模型、脂多糖致感染模型、大鼠脑出血模型四种模型小鼠的脑含水量，提示注射用曲札茋苷对上述多种原因引发的脑水肿均具有潜在的治疗作用，具有很好的临床应用前景。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。