一种天麻素或乙酰天麻素在改善tau蛋白的病理损伤中应用的制作方法

本发明属于改善蛋白的病理损伤技术领域，具体涉及一种改善tau蛋白的病理损伤的分子领域。

背景技术：

微管系统是细胞骨架成分，可参与多种细胞功能。微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白。正常tau蛋白的细胞功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管；与形成的微管结合，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束。tau蛋白基因位于17染色体长臂。正常人中由于tau蛋白mrna剪辑方式不同，可表达出6种同功异构体。tau蛋白为含磷酸基蛋白，正常tau蛋白分子含2～3个磷酸基。tau蛋白异常折叠和过度磷酸化，可以导致蛋白质丧失正常生物功能，从而导致与之相关的病理改变，甚至是疾病的发生。

天麻素英文为gastrodin，为一种植物提取物，具有多种药理作用,对血压、血小板聚集、自由基以及免疫功能等均有影响。乙酰天麻素英文为acetylgastrodin，简称ag，为天麻素一种重要衍生物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种改善tau蛋白的病理损伤的物质。

本发明的目的是这样实现的，包括天麻素或乙酰天麻素，用于改善tau蛋白的病理损伤，特别是改善人类tau蛋白的病理损伤，其通过抑制tau蛋白聚集特别是抑制humantau311蛋白聚集，以及抑制humantau441蛋白聚集的途径实现；或者通过抑制tau蛋白磷酸化的水平，抑制位点是tau蛋白396位点和tau蛋白231位点和tau蛋白199位点。

本发明（优点）天麻素是天麻中众多成分的一种，毒性低，可以长时间服用，天麻素易于大规模生产，其可以减轻tau蛋白的病理损伤，通过抑制tau蛋白聚集和磷酸化实现。

附图说明

图1为天麻素对humantauac-306vqivyk311的干扰实验，即天麻素对humantau311的干扰实验。

图2为天麻素对humantau441（abcam公司）的干扰实验。

图3天麻素减轻转基因小鼠大脑中的tau蛋白磷酸化水平。

图4wb实验证实，天麻素治疗后的转基因小鼠大脑中的tau磷酸化在病理位点396,231，199明显减轻。

图5为乙酰天麻素对humantauac-306vqivyk311的干扰实验，即乙酰天麻素对humantau311的干扰实验。

图6为乙酰天麻素对humantau441（abcam公司）的干扰实验。

图7为乙酰天麻素减轻转基因小鼠大脑中的tau蛋白磷酸化水平。

图8为wb实验证实，乙酰天麻素治疗后的转基因小鼠大脑中的tau磷酸化在病理位点396,231，199明显减轻。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

天麻素对tau蛋白聚集的抑制

本部分的方法和对结果的判断使用了文献1和2和3的方法。

在体外研究中，我们采用负染透射电镜实验观察天麻素，其中天麻素来源于昆明制药集团股份有限公司，天麻素对tau聚集后的螺旋丝状物的干扰。tau331蛋白来源于成都凯捷生物医药科技发展有限公司。

图1为天麻素对humantauac-306vqivyk311的干扰实验，即天麻素对humantau311的干扰实验，图片g-h说明:tau331(100μm)孵育4天后的电镜图片，tau为螺旋丝状；i-j：天麻素（20μm）与humantau331蛋白相互作用4天后的电镜图片，tau331蛋白的螺旋丝结构被破坏，比例尺为200纳米（scalebar=200nm）。

图2天麻素对humantau441的干扰实验材料，来源于abcam公司，图片说明k-l:humantau441(4μm)孵育4天后的电镜图片，tau为螺旋丝状；i-j：天麻素（2.5μm）与tau蛋白共同孵育4天后的电镜图片，比例尺为200纳米（scalebar=200nm）,tau纤维化被天麻素干扰变形。

实施例1结论：天麻素与tau蛋白共同孵育后能够破坏tau蛋白的结构，对tau蛋白的聚集有抑制效果。

实施例2

天麻素减轻转基因小鼠大脑中的tau蛋白磷酸化水平。

我们将人类tau蛋白转基因进入到小鼠中，其实验方案我们按照文献[4]的方法进行。图3中a:control(tg)为转基因小鼠大脑的免疫组织化学的切片，图3中b:gastrodin(tg)为给予了天麻素的转基因小鼠大脑的免疫组织化学的切片，图3中c:wt为野生型小鼠大脑的免疫组织化学的切片，免疫组化试验结果表明：与未治疗组相比，天麻素明显减轻了转基因小鼠的tau磷酸化水平约56%（p<0.05），与wt正常组相比无显著性差异（p>0.05）。图4中a:control(tg)为转基因小鼠大脑的tau蛋白磷酸化，图4中b:gastrodin(tg)为给予了天麻素的转基因小鼠大脑tau蛋白磷酸化。wb实验进一步证实，天麻素治疗后的转基因小鼠大脑中的tau磷酸化在病理位点396,231，199明显减轻。

转基因小鼠为p301ltau小鼠，其构建和鉴定方法如下：

p301ltau转基因小鼠的构建方法为参考文献5和6中的方法，简要概述如下：以c57bl⁄6xdba2f1为背景，与c57bl⁄6背景的小鼠回交。在控制神经元特异性mthy1.2启动子的条件下，通过pcr介导的途径，人病理的p301l突变被插入到cdna编码最长的人脑tau亚型，小鼠可以表达最长的人tau亚型ftdp-17p301l突变，转基因tau的亚型包括外显子2和3以及4个微管结合重叠(htau402+3+4r).p301l转基因小鼠的鉴定：转基因小鼠的鉴定用寡核苷酸：tau-i(o-100,59-ggagttcgaagtgatggaag-39)tau-k(o-101,59-ggtttttgctggaatcctgg-39)，经pcr扩增得到碱基对为500的扩增产物，通过smai证实p301l基因的存在，至少生成10个独立的转基因株系，通过免疫印迹分析七中4个有类似的表达水平。

通过实施例1和2说明天麻素可以减轻小鼠大脑中的tau蛋白磷酸化水平，改善tau蛋白病理。

实施例3

乙酰天麻素(ag)对tau蛋白聚集的抑制。

本部分的方法和对结果的判断使用了文献1和2和3的方法。

在体外研究中，我们采用负染透射电镜实验观察乙酰天麻素（昆明制药集团股份有限公司提供）对tau(成都凯捷生物医药科技发展有限公司提供)聚集后的螺旋丝状物的干扰。

图5为乙酰天麻素对humantauac-306vqivyk311的干扰实验，即乙酰天麻素对humantau311的干扰实验。a-b:humantau331(100μm)孵育4天后的电镜图片，tau为螺旋丝状；c-d：乙酰天麻素（20μm）与tau331蛋白相互作用4天后的电镜图片，tau331蛋白的螺旋丝结构被破坏变形，比例尺为200纳米（scalebar=200nm）。

图6乙酰天麻素对humantau441（abcam公司）的干扰实验。e-f:humantau441(4μm)孵育4天后的电镜图片，tau为螺旋丝状；g-h：乙酰天麻素（2μm）与tau蛋白共同孵育4天后的电镜图片，tau螺旋丝状结构被乙酰天麻素干扰变形，比例尺为200纳米（scalebar=200nm）。

实施例3结论：乙酰天麻素与tau蛋白共同孵育后能够破坏tau蛋白的结构，对tau蛋白的聚集有抑制效果。

实施例4

乙酰天麻素减轻转基因小鼠大脑中的tau蛋白磷酸化水平。

我们将人类tau蛋白转基因进入到小鼠中，其实验方案我们按照文献[4]的方法进行。图7中a:control(tg)为转基因小鼠大脑的免疫组织化学的切片，图7中b:ag(tg)为给予了乙酰天麻素的转基因小鼠大脑的免疫组织化学的切片，图7中c:wt为野生型小鼠大脑的免疫组织化学的切片，免疫组化试验结果表明：与未治疗组相比，乙酰天麻素明显减轻了转基因小鼠的tau磷酸化水平约54%（p<0.05），与wt正常组相比无显著性差异（p>0.05）图8中a:control(tg)为转基因小鼠大脑的tau蛋白磷酸化，图8中b:ag(tg)为给予了乙酰天麻素的转基因小鼠大脑tau蛋白磷酸化,wb实验进一步证实，乙酰天麻素治疗后的转基因小鼠大脑中的tau磷酸化在病理位点396,2631199明显减轻。

通过实施例3和4乙酰天麻素可以减轻小鼠大脑中的tau蛋白磷酸化水平，改善tau蛋白病理。

总结实施例1-4得到结论：天麻素及其衍生物乙酰天麻素可以通过与tau蛋白的相互作用，抑制tau蛋白聚集，降低tau蛋白磷酸化水平，改善tau蛋白病理损伤。

实验方法参考以下文献：

1.li,c.,gotz,j.,2017.tau-basedtherapiesinneurodegeneration:opportunitiesandchallenges.natrevdrugdiscov16,863-883.

2.santa-maria,i.,diaz-ruiz,c.,ksiezak-reding,h.,chen,a.,ho,l.,wang,j.,pasinetti,g.m.,2012.gspeinterfereswithtauaggregationinvivo:implicationfortreatingtauopathy.neurobiolaging33,2072-2081.

3.daccache,a.,lion,c.,sibille,n.,gerard,m.,slomianny,c.,lippens,g.,cotelle,p.,2011.oleuropeinandderivativesfromolivesastauaggregationinhibitors.neurochemint58,700-707.

4.jiao,s.s.,yao,x.q.,liu,y.h.,wang,q.h.,zeng,f.,lu,j.j.,liu,j.,zhu,c.,shen,l.l.,liu,c.h.,wang,y.r.,zeng,g.h.,parikh,a.,chen,j.,liang,c.r.,xiang,y.,bu,x.l.,deng,j.,li,j.,xu,j.,zeng,y.q.,xu,x.,xu,h.w.,zhong,j.h.,zhou,h.d.,zhou,x.f.,wang,y.j.,2015.edaravonealleviatesalzheimer'sdisease-typepathologiesandcognitivedeficits.procnatlacadsciusa112,5225-5230.

5.gotz,j.,chen,f.,barmettler,r.&nitsch,r.m.(2001a)taufilamentformationintransgenicmiceexpressingp301ltau.j.biol.chem.,276,529–534

6ittner,l.m.&gotz,j.(2007)pronuclearinjectionforthegenerationoftransgenicmice.nat.protoc.,2,1206–1215。