本发明属于玛咖成分提取
技术领域：
，具体本发明涉及一种玛咖酰胺和芥子油苷的提取方法。本发明还涉及该玛咖酰胺和芥子油苷制备的组合物。
背景技术：
：当总是感到疲劳，且经充足睡眠后仍不能消除这种疲劳时，一种被称为慢性疲劳综合征的现代病可能已悄然发生。这种现代病在当今快节奏高效率的生活中是较常见的，以慢性持久或反复发作的脑力和体力疲劳为主要特征。有关资料显示，慢性疲劳综合征的发病率在全世界范围内都呈逐年上升的趋势。英国、美国分别有20％、14％的男性和25％、20％的女性总感到疲劳；在我国，40岁以上的白领阶层中，身体超重者的慢性疲劳情况尤其突出。长期处于疲劳状态，会损害人体的体力、体能，身体失衡，使人难以从事或完成某些消耗体力较大或动作细腻、精巧的工作，从而使工作效率下降；另一方面，长期疲劳还会使人皮肤松弛，面色无华，呈现出未老先衰的征兆；长期疲劳得不到恢复，使人体免疫系统功能失调，甚至造成免疫低下，机体抵抗疾病的屏障被打破，使患者患病的几率增加。疲劳有其病因病机，是临床上常见病、多发病，是必须重视的新病种，归于亚健康范畴，涉及五脏六腑，主要以脾、肝、肾为主。可以通过中医辨证组方调治，以达到预防、治疗、控制的目的。经研究发现，玛咖中玛咖酰胺和芥子油苷均有抗疲劳的功效。但由于两者的提取过程复杂，提取产物不纯净，限制了玛咖酰胺和芥子油苷的应用。发明专利申请cn105795479a公开了一种玛咖提取物的制备方法。在玛咖提取物的制备方法中，玛咖洗净后干燥，粉碎成粉末；将所述粉末进行超声波提取，提取得到的上清液进行真空浓缩处理，得到玛咖提取物。但是经过此方法得到的提取物组分种类多，组分复杂，提取物不纯净。发明专利申请cn105920074a公开了一种玛咖提取物及其制备方法和应用。提取物按质量分数主要包括28％-50％的总玛咖酰胺、25％-40％的芳香族芥子油苷、4％-12％的总皂苷、1％-8％的腺苷，其中总玛咖酰胺中n-苄基亚油酰胺含量占总玛咖酰胺含量的35％-60％。经此种方法得到的提取物，组分复杂不纯净，无法将玛咖酰胺和芥子油苷分别分离出来。发明专利申请cn106376799a公开了一种功能型玛咖饮料及其制备方法，主要是由下述重量配比的原料制成的制剂：玛咖5-40份，淡竹叶3-20份。此发明在中医药理论指导下科学配方，有效地解决了玛咖上火问题，增加了使用过程中的依从性，从而提高了玛咖抗疲劳，改善睡眠，补肾壮阳的功能，适宜高节奏社会透支人群使用。但此发明申请的制备方法复杂繁琐，过程中用了大量的有机溶剂进行萃取，使得得到的萃取物不纯净，混入的有机溶剂对身体有害，有潜在的危险。发明专利申请cn105833156a公开了一种减少透支和不上火的玛咖中药或食品及其制备方法和用途。此发明申请的含玛咖中药主要是由下述重量配比的原料制成的制剂：玛咖5-40份，枸杞子3-15份，牡蛎3-40份，淡竹叶3-15份，砂仁1-15份，甘草0.5-5份。此发明借鉴中医药理论，本发明以玛咖佐以枸杞子等可有效解决玛咖引起的虚火上浮问题，增加玛咖产品的依从性，适宜高节奏社会透支人群的使用，是玛咖应用上的一个新创造。但是其制备方法中，使用食用酒精对中药成分进行提取，这会导致活性组分提取不充分，并含有大量酒精成分，在一定程度上限制了适用人群。发明专利申请cn104983021a公开了一种补肾壮阳玛卡海洋保健饮料及其制备方法，该玛卡海洋保健饮料具有平肝固肾、滋阴壮阳、增强免疫力、抗疲劳、延年益寿等功效。饮料原料组成及质量配比为玛卡20-30份、海狗肾3-5份、枸杞6-8份、淫羊藿8-10份、淮山药4-6份、甘草3-5份、菟丝子2-4份、肉苁蓉4-6份、甜叶菊3-5份，其优势在于科学配伍玛卡、海狗肾和多种植物中草药，通过玛卡、海狗肾和中草药之间的协同作用能有效起到“1+1>2”的功效，安全无副作用，食用方便，满足消费者对补肾壮阳营养保健品的市场需求，具有较好的市场应用前景。然而，此种方法制得的饮料中含有的玛咖活性成分会根据玛咖产地、来源、干燥程度及操作条件的不同而不同，从而影响产品的效果。所以需要把玛咖提取液中的活性物质单独提取、分离出来，以精确控制产品均一性。目前，我国还没有一种提取玛咖酰胺和芥子油苷过程简单、提取得到的有效组分种类少且纯度高的制备方法，也没有一种制备方法简单、改善疲劳疗效好的抗疲劳组合物。现有技术部分步骤还需要进一步改进，以达到疗效稳定、抗疲劳等目的。技术实现要素：一种玛咖酰胺和芥子油苷的提取方法，包括以下步骤：(1)预处理：将玛咖洗净后干燥，粉碎过筛；(2)浸提：采用微波辅助、浸泡提取的方式，用无水乙醇-石油醚溶剂对玛咖进行浸提，调节ph，过滤得到滤液a1和滤渣b1；(3)超声乳化：将滤渣b1与丙醇混合后加入超声乳化机中进行超声乳化，过滤得到滤液a2和滤渣b2；(4)除杂：将滤液a1与滤液a2混合进行减压浓缩，然后采用微孔滤膜过滤杂质得到滤液a3；(5)柱层析得玛咖酰胺：将滤液a3进行柱层析，洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪浓缩，干燥，得提取物玛咖酰胺；(6)柱层析得芥子油苷：将滤渣b2，灭酶处理，加入50％-80％的乙醇溶液进行浸提得到滤液a4，将滤液a4进行柱层析分离，洗脱剂洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪浓缩，干燥，得提取物芥子油苷。进一步地，步骤(1)中，干燥的温度为20-40℃。进一步地，步骤(1)中，粉碎后过800-1300目筛。进一步地，步骤(2)中，浸泡时间为1-3h。进一步地，步骤(2)中，按重量计，无水乙醇：石油醚＝1:2-6。进一步地，步骤(2)中，按重量计，玛咖：无水乙醇-石油醚溶剂＝1:10-25。进一步地，步骤(2)中，所述ph＝5.5-7进一步地，步骤(3)中，按重量计，b1：丙醇＝1:12-20。进一步地，步骤(3)中，超声乳化温度为15-25℃。进一步地，步骤(3)中，超声乳化时间为1-2h。进一步地，步骤(3)中，超声功率为400w，频率30khz，搅拌电机功率为50w，转速100-200r/min。进一步地，步骤(4)中，微孔滤膜孔径为1-5μm。进一步地，步骤(5)中，洗脱剂为正丙醇、乙醚、四氯化碳或石油醚中的一种或多种。进一步地，步骤(5)中，所述柱层析采用硅胶柱或中性氧化铝柱。进一步地，步骤(5)中，干燥温度为20-30℃。进一步地，步骤(5)中，旋蒸仪温度为15-30℃。进一步地，步骤(6)中，所述洗脱剂为水-乙酸-氯化钠、水-乙酸-硫酸钠、水-无水乙醇-碳酸、水-无水乙醇-氯化钙中的一种或多种。进一步地，步骤(6)中，所述柱层析采用酸性氧化铝柱、d101型大孔树脂柱、hpd-100型大孔树脂柱或hpd-400a型大孔树脂柱中的一种。进一步地，步骤(6)中，干燥温度为10-20℃。进一步地，步骤(6)中，旋蒸仪温度为20-35℃。一种抗疲劳组合物，包括以上所述方法提取得到的玛咖酰胺和芥子油苷。进一步地，所述组合物还包括黄精、桃仁、当归。进一步地，按重量份计，玛咖酰胺和芥子油苷提取于30-100份玛咖，还包括黄精5-35份、桃仁5-15份、当归10-40份。一种抗疲劳组合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将黄精、桃仁和当归干燥、粉碎过筛；(2)将粉碎后的黄精、桃仁、当归用水浸泡至无干心，水为溶媒煎煮黄精和桃仁的混合物3-5次，水为溶媒煎煮当归2-3次，合并提取液，减压浓缩得到提取液；(3)将玛咖提取物加入提取液中，混合均匀，干燥成粉末，包装密封。进一步地，步骤(1)中，粉碎后过300-600目筛。进一步地，步骤(2)中，水的质量为黄精、桃仁总质量的25-40倍。进一步地，步骤(2)中，水的质量为当归总质量的10-15倍。进一步地，步骤(2)中，浸泡温度为10-30℃。进一步地，步骤(2)中，减压温度为35-50℃，浓缩至相对密度1.5-2.5。进一步地，上述制备步骤制得的终产物可进一步制成片剂、丸剂、胶囊、糖浆的任一种。本发明还提供了所述提取方法得到的提取物、所述的抗疲劳组合物、所述的制备方法得到的组合物及制剂在制备抗疲劳药物中的应用。本申请与现有技术比，玛咖酰胺和芥子油苷的提取方法的优势在于：(1)在浸提时选择了合适的酸碱度和溶剂，使得有效组分浸出更多，得到的有效组分含量、纯度更高。(2)柱层析分离选择了合适的层析柱类型及合适的洗脱剂，使得有效成分纯度更高。(3)本申请每一步操作都选择了合适的温度，在适宜的温度下，可以更好地提高有效组分的含量和纯度。与现有技术相比，抗疲劳组合物及其制备方法的优势在于：(1)本申请组合物的配方组成及各组成的重量比例可以更有效的发挥组合物抗疲劳的治疗效果。(2)本申请将黄精和桃仁共同提取的方法，可以有效提高组合物抗疲劳的疗效。(3)该组合物制备工艺较简单，对设备要求不高，且成本较低，因而具有较好的应用与开发前景。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例11.玛咖酰胺和芥子油苷的提取(1)预处理：将玛咖洗净后20℃干燥，粉碎过800目筛；(2)浸提：采用微波辅助、浸泡提取的方式，用无水乙醇-石油醚溶剂对玛咖进行浸提，调节ph，过滤得到滤液a1和滤渣b1；浸泡时间为1h，按重量份计，无水乙醇：石油醚＝1:2，玛咖：无水乙醇-石油醚＝1:10，调节ph＝5.5。(3)超声乳化：将滤渣b1与丙醇混合后加入超声乳化机中进行超声乳化1h，过滤得到滤液a2和滤渣b2；按重量份计，b1：丙醇＝1:12，超声乳化温度为15℃，超声功率为400w，频率30khz，搅拌电机功率为50w，转速100r/min。(4)除杂：将滤液a1与滤液a2混合进行减压浓缩，然后采用孔径为1μm的微孔滤膜过滤杂质得到滤液a3；(5)柱层析得玛咖酰胺：将滤液a3进行柱层析，正丙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪15℃浓缩，20℃干燥，得提取物玛咖酰胺；层析柱选择硅胶柱。(6)柱层析得芥子油苷：将滤渣b2，灭酶处理，加入50％的乙醇溶液进行浸提得到滤液a4，将滤液a4进行柱层析分离，水-乙酸-氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪20℃浓缩，10℃干燥，得提取物芥子油苷；层析柱选择酸性氧化铝柱。2.组合物的制备(1)将5份黄精、5份桃仁和10份当归干燥、粉碎过300目筛；(2)将粉碎后的黄精、桃仁、当归用10℃水浸泡至无干心，水为溶媒煎煮黄精和桃仁的混合物3次，水为溶媒煎煮当归2次，合并提取液，减压浓缩得到提取液；按重量份计，水：(黄精+桃仁)＝25:1，水：当归＝10:1，减压温度为35℃，浓缩至相对密度为1.5。(3)将30份玛咖制备得到的玛咖提取物加入提取液中，混合均匀，干燥成粉末，包装密封。实施例21.玛咖酰胺和芥子油苷的提取(1)预处理：将玛咖洗净后40℃干燥，粉碎过1300目筛；(2)浸提：采用微波辅助、浸泡提取的方式，用无水乙醇-石油醚溶剂对玛咖进行浸提，调节ph，过滤得到滤液a1和滤渣b1；浸泡时间为3h，按重量份计，无水乙醇：石油醚＝1:6，玛咖：无水乙醇-石油醚＝1:25，调节ph＝7。(3)超声乳化：将滤渣b1与丙醇混合后加入超声乳化机中进行超声乳化2h，过滤得到滤液a2和滤渣b2；按重量份计，b1：丙醇＝1:20，超声乳化温度为25℃，超声功率为400w，频率30khz，搅拌电机功率为50w，转速200r/min。(4)除杂：将滤液a1与滤液a2混合进行减压浓缩，然后采用孔径为5μm的微孔滤膜过滤杂质得到滤液a3；(5)柱层析得玛咖酰胺：将滤液a3进行柱层析，乙醚洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪30℃浓缩，30℃干燥，得提取物玛咖酰胺；层析柱选择中性氧化铝柱。(6)柱层析得芥子油苷：将滤渣b2，灭酶处理，加入80％的乙醇溶液进行浸提得到滤液a4，将滤液a4进行柱层析分离，水-乙醇-氯化钙溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪35℃浓缩，20℃干燥，得提取物芥子油苷；层析柱选择hpd-400a型大孔树脂柱。2.组合物的制备(1)将35份黄精、15份桃仁和40份当归干燥、粉碎过600目筛；(2)将粉碎后的黄精、桃仁、当归用30℃水浸泡至无干心，水为溶媒煎煮黄精和桃仁的混合物5次，水为溶媒煎煮当归3次，合并提取液，减压浓缩得到提取液；按重量份计，水：(黄精+桃仁)＝40:1，水：当归＝15:1，减压温度为50℃，浓缩至相对密度为2.5。(3)将100份玛咖制备得到的玛咖提取物加入提取液中，混合均匀，干燥成粉末，包装密封。实施例31.玛咖酰胺和芥子油苷的提取(1)预处理：将玛咖洗净后30℃干燥，粉碎过1100目筛；(2)浸提：采用微波辅助、浸泡提取的方式，用无水乙醇-石油醚溶剂对玛咖进行浸提，调节ph，过滤得到滤液a1和滤渣b1；浸泡时间为3h，按重量份计，无水乙醇：石油醚＝1:4，玛咖：无水乙醇-石油醚＝1:15，调节ph＝6.5。(3)超声乳化：将滤渣b1与丙醇混合后加入超声乳化机中进行超声乳化2h，过滤得到滤液a2和滤渣b2；按重量份计，b1：丙醇＝1:15，超声乳化温度为20℃，超声功率为400w，频率30khz，搅拌电机功率为50w，转速200r/min。(4)除杂：将滤液a1与滤液a2混合进行减压浓缩，然后采用孔径为5μm的微孔滤膜过滤杂质得到滤液a3；(5)柱层析得玛咖酰胺：将滤液a3进行柱层析，四氯化碳洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪20℃浓缩，20℃干燥，得提取物玛咖酰胺；层析柱选择中性氧化铝柱。(6)柱层析得芥子油苷：将滤渣b2，灭酶处理，加入60％的乙醇溶液进行浸提得到滤液a4，将滤液a4进行柱层析分离，水-乙酸-硫酸钠溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪30℃浓缩，15℃干燥，得提取物芥子油苷；层析柱选择d101型大孔树脂柱。2.组合物的制备(1)将20份黄精、10份桃仁和25份当归干燥、粉碎过400目筛；(2)将粉碎后的黄精、桃仁、当归用30℃水浸泡至无干心，水为溶媒煎煮黄精和桃仁的混合物4次，水为溶媒煎煮当归3次，合并提取液，减压浓缩得到提取液；按重量份计，水：(黄精+桃仁)＝30:1，水：当归＝12:1，减压温度为40℃，浓缩至相对密度为2.0。(3)将50份玛咖制备得到的玛咖提取物加入提取液中，混合均匀，干燥成粉末，包装密封。对比例1与实施例1相比，玛咖酰胺和芥子油苷的提取过程的步骤(2)的ph、溶剂不同1.玛咖酰胺和芥子油苷的提取(1)预处理：将玛咖洗净后20℃干燥，粉碎过800目筛；(2)浸提：采用微波辅助、浸泡提取的方式，用去离子水对玛咖进行浸提，调节ph，过滤得到滤液a1和滤渣b1；浸泡时间为1h，按重量份计，无水乙醇：石油醚＝1:2，玛咖：无水乙醇-石油醚＝1:10，调节ph＝5。(3)超声乳化：将滤渣b1与丙醇混合后加入超声乳化机中进行超声乳化1h，过滤得到滤液a2和滤渣b2；按重量份计，b1：丙醇＝1:12，超声乳化温度为15℃，超声功率为400w，频率30khz，搅拌电机功率为50w，转速100r/min。(4)除杂：将滤液a1与滤液a2混合进行减压浓缩，然后采用孔径为1μm的微孔滤膜过滤杂质得到滤液a3；(5)柱层析得玛咖酰胺：将滤液a3进行柱层析，正丙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪15℃浓缩，20℃干燥，得提取物玛咖酰胺；层析柱选择硅胶柱。(6)柱层析得芥子油苷：将滤渣b2，灭酶处理，加入50％的乙醇溶液进行浸提得到滤液a4，将滤液a4进行柱层析分离，水-乙酸-氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪20℃浓缩，10℃干燥，得提取物芥子油苷；层析柱选择酸性氧化铝柱。2.组合物的制备(1)将5份黄精、5份桃仁和10份当归干燥、粉碎过300目筛；(2)将粉碎后的黄精、桃仁、当归用10℃水浸泡至无干心，水为溶媒煎煮黄精和桃仁的混合物3次，水为溶媒煎煮当归2次，合并提取液，减压浓缩得到提取液；按重量份计，水：(黄精+桃仁)＝25:1，水：当归＝10:1，减压温度为35℃，浓缩至相对密度为1.5。(3)将30份玛咖制备得到的玛咖提取物加入提取液中，混合均匀，干燥成粉末，包装密封。对比例2与实施例1相比，玛咖酰胺和芥子油苷的提取过程的步骤(5)(6)的柱层析洗脱剂种类不同。1.玛咖酰胺和芥子油苷的提取(1)预处理：将玛咖洗净后20℃干燥，粉碎过800目筛；(2)浸提：采用微波辅助、浸泡提取的方式，用无水乙醇-石油醚溶剂对玛咖进行浸提，调节ph，过滤得到滤液a1和滤渣b1；浸泡时间为1h，按重量份计，无水乙醇：石油醚＝1:2，玛咖：无水乙醇-石油醚＝1:10，调节ph＝5.5。(3)超声乳化：将滤渣b1与丙醇混合后加入超声乳化机中进行超声乳化1h，过滤得到滤液a2和滤渣b2；按重量份计，b1：丙醇＝1:12，超声乳化温度为15℃，超声功率为400w，频率30khz，搅拌电机功率为50w，转速100r/min。(4)除杂：将滤液a1与滤液a2混合进行减压浓缩，然后采用孔径为1μm的微孔滤膜过滤杂质得到滤液a3；(5)柱层析得玛咖酰胺：将滤液a3进行柱层析，无水乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪15℃浓缩，20℃干燥，得提取物玛咖酰胺；层析柱选择硅胶柱。(6)柱层析得芥子油苷：将滤渣b2，灭酶处理，加入50％的乙醇溶液进行浸提得到滤液a4，将滤液a4进行柱层析分离，水-乙醇-氢氧化钠溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪20℃浓缩，10℃干燥，得提取物芥子油苷；层析柱选择酸性氧化铝柱。2.组合物的制备(1)将5份黄精、5份桃仁和10份当归干燥、粉碎过300目筛；(2)将粉碎后的黄精、桃仁、当归用10℃水浸泡至无干心，水为溶媒煎煮黄精和桃仁的混合物3次，水为溶媒煎煮当归2次，合并提取液，减压浓缩得到提取液；按重量份计，水：(黄精+桃仁)＝25:1，水：当归＝10:1，减压温度为35℃，浓缩至相对密度为1.5。(3)将30份玛咖制备得到的玛咖提取物加入提取液中，混合均匀，干燥成粉末，包装密封。对比例3与实施例1相比，玛咖酰胺和芥子油苷的提取过程的步骤(3)b1与丙醇的比例不同。1.玛咖酰胺和芥子油苷的提取(1)预处理：将玛咖洗净后20℃干燥，粉碎过800目筛；(2)浸提：采用微波辅助、浸泡提取的方式，用无水乙醇-石油醚溶剂对玛咖进行浸提，调节ph，过滤得到滤液a1和滤渣b1；浸泡时间为1h，按重量份计，无水乙醇：石油醚＝1:2，玛咖：无水乙醇-石油醚＝1:10，调节ph＝5.5。(3)超声乳化：将滤渣b1与丙醇混合后加入超声乳化机中进行超声乳化1h，过滤得到滤液a2和滤渣b2；按重量份计，b1：丙醇＝1:25，超声乳化温度为15℃，超声功率为400w，频率30khz，搅拌电机功率为50w，转速100r/min。(4)除杂：将滤液a1与滤液a2混合进行减压浓缩，然后采用孔径为1μm的微孔滤膜过滤杂质得到滤液a3；(5)柱层析得玛咖酰胺：将滤液a3进行柱层析，正丙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪15℃浓缩，20℃干燥，得提取物玛咖酰胺；层析柱选择硅胶柱。(6)柱层析得芥子油苷：将滤渣b2，灭酶处理，加入50％的乙醇溶液进行浸提得到滤液a4，将滤液a4进行柱层析分离，水-乙酸-氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪20℃浓缩，10℃干燥，得提取物芥子油苷；层析柱选择酸性氧化铝柱。2.组合物的制备(1)将5份黄精、5份桃仁和10份当归干燥、粉碎过300目筛；(2)将粉碎后的黄精、桃仁、当归用10℃水浸泡至无干心，水为溶媒煎煮黄精和桃仁的混合物3次，水为溶媒煎煮当归2次，合并提取液，减压浓缩得到提取液；按重量份计，水：(黄精+桃仁)＝25:1，水：当归＝10:1，减压温度为35℃，浓缩至相对密度为1.5。(3)将30份玛咖制备得到的玛咖提取物加入提取液中，混合均匀，干燥成粉末，包装密封。对比例4与实施例1相比，不包含玛咖酰胺和芥子油苷的提取过程的步骤(3)。1.玛咖酰胺和芥子油苷的提取(1)预处理：将玛咖洗净后20℃干燥，粉碎过800目筛；(2)浸提：采用微波辅助、浸泡提取的方式，用无水乙醇-石油醚溶剂对玛咖进行浸提，调节ph，过滤得到滤液a1和滤渣b1；浸泡时间为1h，按重量份计，无水乙醇：石油醚＝1:2，玛咖：无水乙醇-石油醚＝1:10，调节ph＝5.5。(3)除杂：将滤液a1进行减压浓缩，然后采用孔径为1μm的微孔滤膜过滤杂质得到滤液a2；(4)柱层析得玛咖酰胺：将滤液a2进行柱层析，正丙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪15℃浓缩，20℃干燥，得提取物玛咖酰胺；层析柱选择硅胶柱。(5)柱层析得芥子油苷：将滤渣b1，灭酶处理，加入50％的乙醇溶液进行浸提得到滤液a3，将滤液a3进行柱层析分离，水-乙酸-氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪20℃浓缩，10℃干燥，得提取物芥子油苷；层析柱选择酸性氧化铝柱。2.组合物的制备(1)将5份黄精、5份桃仁和10份当归干燥、粉碎过300目筛；(2)将粉碎后的黄精、桃仁、当归用10℃水浸泡至无干心，水为溶媒煎煮黄精和桃仁的混合物3次，水为溶媒煎煮当归2次，合并提取液，减压浓缩得到提取液；按重量份计，水：(黄精+桃仁)＝25:1，水：当归＝10:1，减压温度为35℃，浓缩至相对密度为1.5。(3)将30份玛咖制备得到的玛咖提取物加入提取液中，混合均匀，干燥成粉末，包装密封。对比例5与实施例1相比，制备组合物时，组合物重量份数不同。1.玛咖酰胺和芥子油苷的提取(1)预处理：将玛咖洗净后20℃干燥，粉碎过800目筛；(2)浸提：采用微波辅助、浸泡提取的方式，用无水乙醇-石油醚溶剂对玛咖进行浸提，调节ph，过滤得到滤液a1和滤渣b1；浸泡时间为1h，按重量份计，无水乙醇：石油醚＝1:2，玛咖：无水乙醇-石油醚＝1:10，调节ph＝5.5。(3)超声乳化：将滤渣b1与丙醇混合后加入超声乳化机中进行超声乳化1h，过滤得到滤液a2和滤渣b2；按重量份计，b1：丙醇＝1:12，超声乳化温度为15℃，超声功率为400w，频率30khz，搅拌电机功率为50w，转速100r/min。(4)除杂：将滤液a1与滤液a2混合进行减压浓缩，然后采用孔径为1μm的微孔滤膜过滤杂质得到滤液a3；(5)柱层析得玛咖酰胺：将滤液a3进行柱层析，正丙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪15℃浓缩，20℃干燥，得提取物玛咖酰胺；层析柱选择硅胶柱。(6)柱层析得芥子油苷：将滤渣b2，灭酶处理，加入50％的乙醇溶液进行浸提得到滤液a4，将滤液a4进行柱层析分离，水-乙酸-氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪20℃浓缩，10℃干燥，得提取物芥子油苷；层析柱选择酸性氧化铝柱。2.组合物的制备(1)将5份黄精、25份桃仁和5份当归干燥、粉碎过300目筛；(2)将粉碎后的黄精、桃仁、当归用10℃水浸泡至无干心，水为溶媒煎煮黄精和桃仁的混合物3次，水为溶媒煎煮当归2次，合并提取液，减压浓缩得到提取液；按重量份计，水：(黄精+桃仁)＝25:1，水：当归＝10:1，减压温度为35℃，浓缩至相对密度为1.5。(3)将30份玛咖制备得到的玛咖提取物加入提取液中，混合均匀，干燥成粉末，包装密封。对比例6与实施例1相比，黄精、桃仁和当归一起提取。1.玛咖酰胺和芥子油苷的提取(1)预处理：将玛咖洗净后20℃干燥，粉碎过800目筛；(2)浸提：采用微波辅助、浸泡提取的方式，用无水乙醇-石油醚溶剂对玛咖进行浸提，调节ph，过滤得到滤液a1和滤渣b1；浸泡时间为1h，按重量份计，无水乙醇：石油醚＝1:2，玛咖：无水乙醇-石油醚＝1:10，调节ph＝5.5。(3)超声乳化：将滤渣b1与丙醇混合后加入超声乳化机中进行超声乳化1h，过滤得到滤液a2和滤渣b2；按重量份计，b1：丙醇＝1:12，超声乳化温度为15℃，超声功率为400w，频率30khz，搅拌电机功率为50w，转速100r/min。(4)除杂：将滤液a1与滤液a2混合进行减压浓缩，然后采用孔径为1μm的微孔滤膜过滤杂质得到滤液a3；(5)柱层析得玛咖酰胺：将滤液a3进行柱层析，正丙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪15℃浓缩，20℃干燥，得提取物玛咖酰胺；层析柱选择硅胶柱。(6)柱层析得芥子油苷：将滤渣b2，灭酶处理，加入50％的乙醇溶液进行浸提得到滤液a4，将滤液a4进行柱层析分离，水-乙酸-氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪20℃浓缩，10℃干燥，得提取物芥子油苷；层析柱选择酸性氧化铝柱。2.组合物的制备(1)将5份黄精、5份桃仁和10份当归干燥、粉碎过300目筛；(2)将粉碎后的黄精、桃仁、当归用10℃水浸泡至无干心，水为溶媒煎煮黄精、桃仁、当归的混合物3次，减压浓缩得到提取液；按重量份计，水：(黄精+桃仁+当归)＝25:1，减压温度为35℃，浓缩至相对密度为1.5。(3)将30份玛咖制备得到的玛咖提取物加入提取液中，混合均匀，干燥成粉末，包装密封。对比例7与实施例1相比，制备组合物时，步骤(2)水与药的比例不同。1.玛咖酰胺和芥子油苷的提取(1)预处理：将玛咖洗净后20℃干燥，粉碎过800目筛；(2)浸提：采用微波辅助、浸泡提取的方式，用无水乙醇-石油醚溶剂对玛咖进行浸提，调节ph，过滤得到滤液a1和滤渣b1；浸泡时间为1h，按重量份计，无水乙醇：石油醚＝1:2，玛咖：无水乙醇-石油醚＝1:10，调节ph＝5.5。(3)超声乳化：将滤渣b1与丙醇混合后加入超声乳化机中进行超声乳化1h，过滤得到滤液a2和滤渣b2；按重量份计，b1：丙醇＝1:12，超声乳化温度为15℃，超声功率为400w，频率30khz，搅拌电机功率为50w，转速100r/min。(4)除杂：将滤液a1与滤液a2混合进行减压浓缩，然后采用孔径为1μm的微孔滤膜过滤杂质得到滤液a3；(5)柱层析得玛咖酰胺：将滤液a3进行柱层析，正丙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪15℃浓缩，20℃干燥，得提取物玛咖酰胺；层析柱选择硅胶柱。(6)柱层析得芥子油苷：将滤渣b2，灭酶处理，加入50％的乙醇溶液进行浸提得到滤液a4，将滤液a4进行柱层析分离，水-乙酸-氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液通过旋蒸仪20℃浓缩，10℃干燥，得提取物芥子油苷；层析柱选择酸性氧化铝柱。2.组合物的制备(1)将5份黄精、5份桃仁和10份当归干燥、粉碎过300目筛；(2)将粉碎后的黄精、桃仁、当归用10℃水浸泡至无干心，水为溶媒煎煮黄精和桃仁的混合物3次，水为溶媒煎煮当归2次，合并提取液，减压浓缩得到提取液；按重量份计，水：(黄精+桃仁)＝50:1，水：当归＝5:1，减压温度为35℃，浓缩至相对密度为1.5。(3)将30份玛咖制备得到的玛咖提取物加入提取液中，混合均匀，干燥成粉末，包装密封。实验例1玛咖酰胺和芥子油苷纯度的测定采用hplc法测定玛咖酰胺和芥子油苷的纯度：测试条件：采用waters高效液相色谱仪；色谱柱：symmetryc18(3.0×150mm，3.5μm)；流动相：甲醇-水(30:70)；流速：1ml/min。线性范围的确定：吸取对照品溶液1、2、5、10、12.5、15μl，注入高效液相仪，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程y＝4553.1x+4.3874,r2＝0.9995，结果表明，进样量在0-20μl线性关系良好。经测试，结果如表1：表1玛咖酰胺和芥子油苷纯度测试结果组别实施例1实施例2对比例1对比例2对比例3对比例4玛咖酰胺纯度(％)62.161.552.251.654.750.8芥子油苷纯度(％)34.434.628.828.129.127.6实验例2组合物对小鼠抗疲劳的功效研究实验动物：五月龄中年icr小鼠450只，雌雄各半。仪器与试剂：游泳箱、铅丝、恒温水浴箱、离心机、肝糖原检测试剂盒(南京建成，货号a043)、乳酸检测试剂盒(南京建成，货号a019-1)、尿素氮试剂盒(南京建成，货号c013-1)等。实验方法：将五月龄中年icr小鼠随机分为9组，每组50只，9组分别命名为对照组、实施例1组、对比例1-7组。实施例1组、对比例1-7组的小鼠腹腔注射给药200mg/kg的组合物，对照组给予同体积的生理盐水。于每天上午午饭后给药一次，连续给药15天。负重游泳实验：末次给予药物30min后，给小鼠尾部负其体重的4％质量的铅丝。将小鼠放入水深为35cm，水温为21±1℃的游泳箱内游泳，直到力竭。力竭的判定标准为小鼠头部沉入水中10s内不浮出水面，记录力竭时间。实验结果见表2。表2小鼠负重游泳测试结果各小组之间，p<0.05，具有统计学意义。肝糖原测定：小鼠负重游泳后，休息10分钟，在摘眼球采血后将小鼠处死。取出肝脏，用生理盐水漂洗后再用滤纸吸干，精确称取50mg肝脏。按照试剂盒说明书进行肝脏肝糖原的测定。实验结果见表3.表3小鼠肝糖原测试结果各小组之间，p<0.05，具有统计学意义。全血乳酸测定：小鼠负重游泳后，休息10分钟，摘除眼球取血，按照试剂盒说明进行全血乳酸的测定。实验结果见表4.表4小鼠全血乳酸测试结果各小组之间，p<0.05，具有统计学意义。血浆尿素氮测定：小鼠负重游泳后，休息10分钟，眼球采血，用edta钠抗凝后3500转离心10分钟后分离出血浆，按照试剂盒说明书进行血浆尿素氮的测定。实验结果见表5。表5小鼠血浆尿素氮测试结果各小组之间，p<0.05，具有统计学意义。综合上述实验结果，本发明提供的玛咖酰胺和芥子油苷的提取方法得到的提取物浓度纯度较高，应用到抗疲劳组合物中，得到的组合物抗疲劳疗效较好，明显延长小鼠负重游泳时间，提高小鼠肝糖原储备、降低小鼠乳酸和尿素氮含量，提示本发明具有明显的抗疲劳作用。本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若该改进和修饰，这些也将视为本发明的保护范围。当前第1页12