本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及组合物、制备方法及其应用。
背景技术：
癌症是一种严重危害人体健康的常见多发病，攻克癌细胞一直是国内外研究的热点问题。化学治疗是一种主要的用于全身治疗的抗恶性肿瘤的方法，但其在抗击肿瘤细胞的同时，也会损害其他的细胞。因此，寻求一种低毒高效的抗肿瘤药物对于抗肿瘤的治疗是迫在眉睫的。
铂类抗肿瘤化合物已成为癌症化疗中的不可或缺且应用范围最广的药物。自1978年顺铂作为第一代抗肿瘤药物，经美国foodanddrugadministration(fda)首次批准上市后，铂类抗肿瘤药物开始进入人们的视野并被迅速地应用于各种恶性肿瘤的临床治疗当中，先后有卡铂、奈达铂、奥沙利铂、乐铂、庚铂、洛铂、米铂等铂类抗肿瘤化合物在各国上市。国内外研究表明，当铂类化合物进入人体的细胞后，大部分的与细胞内物质结合而产生的结合物能够具有细胞毒性，从而起到抗肿瘤的作用。铂类抗肿瘤化合物与癌细胞的作用机制可由以下步骤进行概括：铂类抗肿瘤化合物经注射进入细胞后，在细胞质内发生水解，与水反应从而形成带正电的水合物，在静电引力作用下进入细胞核，与dna形成配合物，阻碍dna的复制和转录，从而导致细胞的凋亡。
本发明中的组合物是将顺铂与透明质酸钠进行联用，并测定其对不同的癌细胞的抑瘤效果。该组合物可降低顺铂的用药剂量，并且联用后的抗肿瘤效果更好。
技术实现要素：
为解决现有抗肿瘤药物铂类化合物的毒副作用大的问题，本发明的目的在于，提供一种顺铂和透明质酸钠的组合物，并将其应用于抗肿瘤药物的制备中。
本发明是通过以下技术方法来实现的：
细胞增殖检测(mtt法)：
(1)取对数生长期的癌症细胞制成2×104个细胞/ml的悬液，每孔100μl加入96孔培养板中。
(2)设试剂对照组，肿瘤细胞对照组和各种不同浓度组合物的实验组。实验前先在肿瘤细胞中加入顺铂单药(本发明也尝试了除这顺铂之外的其他铂类化合物：如卡铂、奈达铂、米铂、乐铂和庚铂等，选取了顺铂进行后续研究)，得到顺铂的终浓度，以此得知组合物的ic50浓度。加入不同浓度的透明质酸钠进行联合给药。继而开始下面的联合实验。实验组分单药组和联合用药组。
(3)试剂对照组加等量培养基，肿瘤细胞对照组加等量相同不含药物的培养基。先在co2孵箱中培养，然后每孔中加0.5％mtt10μl继续培养，最后加入100μl三联溶解液，过夜脱色至mtt完全溶解，于自动酶标读数仪570nm和630nm处测定各孔吸光度(a)，计抑制率及ic50。
优选地，步骤(1)中顺铂的终浓度为5、50、500、5000、50000ng/ml。
优选地，步骤(2)中在在co2孵箱中培养时间为12～36h，加mtt后继续培养的时间为2～6h。
优选地，顺铂和透明质酸钠的组合物，透明质酸钠与顺铂的组合物的摩尔比范围为0.0001～0.1250。
本发明的有益效果为：
顺铂和透明质酸钠联用对癌细胞株的抑制作用的q值评价显示，本发明组合物对癌细胞株表现出良好的抑瘤效果，组合物对癌细胞株的抑制作用与顺铂和透明质酸钠联用的剂量范围相关。组合物联合给药的使用量明显低于临床使用剂量，安全性好。可用于制备治疗抗肿瘤的药物，本发明可提供本发明组合物在医学中的新用途，具体地说是涉及本发明组合物在制备抗肿瘤新药物中的应用。
以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。
具体实施方式
本专利还尝试了将顺铂与除了透明质酸钠之外的多糖类聚合物进行联用，组合物也产生了不错的抑瘤效果，但本发明选取了效果比较好的透明质酸钠进行联用给药的研究。
实施例1
细胞系及培养：肝癌细胞2株(bel-7402、hep-g2)，胰腺癌细胞5株(bxpc-3、capan-1、colo357、miapaca-2、panc-1)，肺癌细胞6株(a427、a549、nci-h1299、nci-h2170、nci-h358、nci-h460)，结直肠癌细胞3株(colo205、lovo、rko)，乳腺癌细胞6株(hcc-1806、mcf-7、mda-mb-231、mda-mb-361、mda-mb-436、td-47)，宫颈癌细胞1株(hela)，这些细胞由南京大学惠赠，用含10％胎牛血清的dmem/rpmi1640/mccoy’5a培养基，于37℃、5％co2培养箱中培养，2～3天换液一次，取对数生长期细胞用于实验。
细胞增殖检测(mtt法)：取对数生长期的癌症细胞制成2×104个细胞/ml的悬液，每孔100μl加入96孔培养板中。设试剂对照组，肿瘤细胞对照组和各种不同浓度药物的实验组。实验前先在肿瘤细胞中分别加入顺铂单药，使得顺铂的终浓度为5、50、500、5000、50000ng/ml，以此得知组合物的ic50浓度，加入不同浓度的透明质酸钠进行联合给药。继而开始下面的联合实验。实验组分单药组和联合用药组。试剂对照组加等量培养基，肿瘤细胞对照组加等量相同不含药物的培养基。在co2孵箱中培养24h后，每孔中加0.5％mtt10μl继续培养4h，加入100μl三联溶解液，过夜脱色至mtt完全溶解，于自动酶标读数仪570nm和630nm处测定各孔吸光度(a)，计抑制率及ic50。
结果分析：
(1)顺铂和透明质酸钠联合给药：
将顺铂和透明质酸钠进行联合给药，结果如表1。通过分析可见，对于肺癌细胞nci-h129，当组合物中透明质酸钠与顺铂的摩尔比为0.0026～0.0053时，其对肿瘤的抑制率增长了138％～157％；对于宫颈癌细胞hela，当组合物中透明质酸钠与顺铂的摩尔比为0.125时，其对肿瘤的抑制率增长了118％；对于结直肠癌细胞hf29，当组合物中透明质酸钠与顺铂的摩尔比为0.0001～0.0063时，其对肿瘤的抑制率增长了164％～214％。在测定的浓度范围内，透明质酸钠几乎对所有的肿瘤细胞都未表现出细胞毒作用。
表1
本专利除考察顺铂和透明质酸钠联合用药的抑制率外，还研究了顺铂单独给药对肿瘤的抑制率，以及透明质酸钠单独给药对肿瘤的抑制率。由于单独给药抑制率显著不如联合用药，所以，本发明方法中不对单独给药的抑制率做过多描述。
(2)铂类化合物单独给药：
表2
(3)透明质酸钠单独给药：
表3
本发明将顺铂与透明质酸钠联用，并将其应用于制备抗肿瘤药物中。二者联合使用可降低顺铂的用药剂量，并且联用后的抗肿瘤效果更好；二者联用可提高肿瘤细胞对顺铂的敏感性；顺铂与透明质酸钠二者联用存在一定的剂量关系。
本发明还尝试了除说明书中所提到的肝癌细胞株、胰腺癌细胞株、肺癌细胞株、结直肠癌细胞株、乳腺癌细胞株、宫颈癌细胞株外，其他细胞株的类别及具体种类，也都产生了一定的抑制肿瘤的效果；本发明还尝试了除顺铂以外的铂类化合物，与透明质酸钠进行组合联用，产生了一定的增强抑制肿瘤的效果；本发明还尝试了将除透明质酸钠之外的多糖化合物，与顺铂进行联合给药，能够增强抗肿瘤效果；本发明还尝试将顺铂与透明质酸钠的组合物与常规抗肿瘤化合物联用，能够进一步提高抗肿瘤效果。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。