用于治疗肠易激综合征或炎性肠病的微生物溶菌酶的制作方法

文档序号：18742233发布日期：2019-09-21 01:54阅读：600来源：国知局

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技术领域

本发明涉及微生物溶菌酶和包含微生物溶菌酶的组合物，其用于稳定健康的微生物群并抑制胃肠(GI)道中细菌病原体的生长和/或肠道定殖，以及用于预防、减轻或治疗肠易激综合征(IBS)或炎性肠病(IBD)。

背景技术：

人的肠道菌群含有大量的细菌，这些细菌在人的肠道健康中起着重要作用。回肠末端含有10e7至10e8个主要为厌氧细菌/克管腔内容物，而结肠具有10e11至10e12个细菌菌落/克，其中以拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)物种为主。慢性肠道炎症是在遗传易感的宿主中对共生(正常内源性)肠道细菌的过度攻击性的细胞介导免疫应答的结果。

炎性肠病(IBD)是一种使人衰弱的疾病，其特征在于慢性肠道炎症，通常表现为间歇性病程，伴有急性发作和随后的缓解期。急性发作期间的临床症状包括腹泻、出血、腹痛、发烧、关节疼痛和体重减轻。IBD可以以多种形式表现出来，其中最通常的是克罗恩病(肠的慢性透壁炎症，其可以影响整个胃肠道)和溃疡性结肠炎(影响结肠的慢性炎性肠病)。溃疡性结肠炎和克罗恩病发生在具有最高浓度的管腔细菌的胃肠道区域。

溶菌酶是一种由许多生物作为对抗细菌的防御性机制而产生的O-糖基水解酶。该酶通过裂解肽聚糖的糖苷键来水解细菌的细胞壁。在细菌的细胞壁被溶菌酶作用弱化后，由不平衡的渗透压导致细菌细胞溶解。此外，溶菌酶可以将细胞外肽聚糖降解成可溶性片段，这似乎限制了炎症。

已经将溶菌酶分类为五种不同的糖苷水解酶(GH)家族(CAZy，www.cazy.org)：鸡蛋清溶菌酶(GH22)，鹅蛋清溶菌酶(GH23)，噬菌体T4溶菌酶(GH24)，鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)鞭毛蛋白(GH73)以及拟鞘孢属(Chalaropsis)溶菌酶(GH25)。来自家族GH23和GH24的溶菌酶主要从噬菌体中已知并且近来仅在真菌中得以鉴定。已经发现溶菌酶家族GH25与其他溶菌酶家族在结构上是不相关的。

传统上由于其天然丰富而从鸡蛋清中提取溶菌酶。从鸡蛋清提取的溶菌酶是在商业市场可获得的主要产品，但不裂解例如金黄色葡萄球菌细胞壁中的N,6-O-二乙酰胞壁酸并且因此尤其不能溶解这一重要的人类病原体(Masschalck B,Deckers D,Michiels CW(2002),“Lytic and nonlytic mechanism of inactivation of gram-positive bacteria by lysozyme under atmospheric and high hydrostatic pressure[在大气压和高流体静力压下由溶菌酶灭活革兰氏阳性细菌的溶解和非溶解机制]”,J Food Prot.[食品保护杂志]65(12):1916-23)。

WO 2000/21381、GB 2379166和WO 2004/026334各公开了包含来自鸡蛋清的GH22溶菌酶的组合物。WO 2013/076253中公开了来自嗜碱枝顶孢(Acremonium alcalophilum)的野生型GH25溶菌酶的成熟氨基酸序列。

需要以下组合物，其在施用时将微生物群改变为使具有不想要的微生物群的人(例如患有如IBD和/或IBS的患者)受益。本发明提供了一种获得此类改变的方法。

技术实现要素：

本发明提供了微生物溶菌酶和包含微生物溶菌酶的组合物用于多种用途。

在一个方面，本发明提供微生物溶菌酶和包含微生物溶菌酶的组合物用于预防、减轻或治疗肠易激综合征(IBS)或炎性肠病(IBD)的方法中。

在一个方面，所述微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物稳定胃肠(GI)道中的健康微生物群并抑制细菌病原体的生长和/或肠道定殖。在另一个方面，所述微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物预防、减轻或治疗炎症，且在又一个方面，所述微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物减少与肥胖如例如饮食诱发的肥胖有关的异位脂质沉积。

还在本文中描述的是一种预防、减轻或治疗肠易激综合征(IBS)或炎性肠病(IBD)的方法。

此外还描述了一种改善人的肠道健康的方法，其中该方法包括减少消化道中死亡的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)细胞的量，包括向所述人提供分离的多肽，该多肽具有针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性。

序列表综述

SEQ ID NO:1是如在WO 2013/076253中描述的来自嗜碱枝顶孢的野生型GH25溶菌酶的成熟氨基酸序列。

SEQ ID NO:2是如分离自褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)的GH24溶菌酶的基因序列。

SEQ ID NO:3是如从SEQ ID NO:2推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4是来自褐孢长毛盘菌的野生型GH24溶菌酶的成熟氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是来自原鸡(Gallus gallus)的野生型GH22溶菌酶的成熟氨基酸序列(鸡蛋清溶菌酶)。

SEQ ID NO:6是引物F-80470。

SEQ ID NO:7是引物R-80470。

SEQ ID NO:8是引物8643。

SEQ ID NO:9是引物8654。

SEQ ID NO:10是正向引物27F。

SEQ ID NO:11是反向引物534R。

SEQ ID NO:12是代表归类为普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)的16S rRNA基因的序列，如Duncan,S.H等人,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.[国际系统与进化微生物学杂志]52(PT 6),2141-2146(2002)中描述和Hold G.L.于2001年9月19日向Gut Microbiology and Immunology[消化道微生物学和免疫学]提交的。

SEQ ID NO:13是如分离自弗格斯毁丝霉(Myceliophthora fergusii)的GH25溶菌酶的基因组DNA序列。

SEQ ID NO:14是如从SEQ ID NO:13推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15是来自弗格斯毁丝霉的成熟GH25溶菌酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16是如分离自蜡蚧菌属(Lecanicillium)物种WMM742的GH25溶菌酶的cDNA序列。

SEQ ID NO:17是如从SEQ ID NO:16推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:18是来自蜡蚧菌属物种WMM742的成熟GH25溶菌酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19是如分离自接合菌(Zygomycetes)物种XZ2655的GH25溶菌酶的cDNA序列。

SEQ ID NO:20是如从SEQ ID NO:19推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21是来自接合菌物种XZ2655的成熟GH25溶菌酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:22是如分离自Malbranchea flava的GH25溶菌酶的cDNA序列。

SEQ ID NO:23是如从SEQ ID NO:22推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:24是来自Malbranchea flava的成熟GH25溶菌酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:25是如分离自Hypholoma polytrichi的GH25溶菌酶的密码子优化的DNA。

SEQ ID NO:26是如从SEQ ID NO:25推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:27是来自Hypholoma polytrichi的成熟GH25溶菌酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:28是如分离自白色侧齿霉(Engyodontium album)的GH25溶菌酶的cDNA序列。

SEQ ID NO:29是如从SEQ ID NO:28推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:30是来自白色侧齿霉的成熟GH25溶菌酶的氨基酸序列。

附图说明

图1显示实例6的相比于媒介物对照、无DSS的SEQ ID NO:1处理和疾病对照(没有溶菌酶处理的DSS处理)，用高、中或低剂量的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.5然后是葡聚糖硫酸钠(DSS，3％)处理治疗的小鼠的原始结肠损伤评分(A)、结肠长度(B)和结肠湿重(C)。每列代表n＝10-12的均值。

图2显示实例6的用高剂量的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.5治疗之后与对照相比的体重发展的比较。线图代表每组的平均体重相对于第-3天(预防性处理开始时)的体重的变化。DSS激发在第0天开始。每条线对应于实验过程中的每种指示的处理(n＝10-12)。

图3显示了实例6的与对照相比，用高、中和低剂量的SEQ ID NO.1(A)、SEQ ID NO.15(B)或SEQ ID NO.5(C)处理后的体重发展的比较。线图代表每组的平均体重相对于第3天的体重的变化。每条线对应于实验过程中的每种指示的处理(n＝10-12)。

图4显示了实例6的在DSS激发开始后第5天SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.5对结肠组织中细胞因子水平的影响。显示了相比于对照，响应以高、中或低浓度给药的每种测试化合物的TNFα(A)、IL-1β(B)、IL-6(C)、IL-10(D)、IL-12(E)、IL-17a(F)和IL-25(G)的浓度pr.mg结肠组织。每列代表n＝10-12只小鼠的均值。

图5显示了实例6的在DSS激发开始后第5天SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.5对结肠组织中细胞因子水平的影响。显示了响应以mol/天给药的每种测试化合物，TNFα(A)、IL-1β(B)、IL-6(C)、IL-10(D)、IL-12(E)、IL-17a(F)和IL-25(G)的浓度pr.mg结肠组织。每个点代表n＝10-12的均值。

图6显示来自实例7的小鼠从饮食开始前一周和贯穿整个研究的体重发展(A)，在指定时间点分析的脂肪量(B)和终止时的组织重量(C)。每列/点代表n＝10-12的均值。

图7显示了如实例7中所述处理的小鼠：5h禁食的血糖(A)，5h禁食的胰岛素(B)，用2克葡萄糖每千克瘦质量口服激发后在指定时间点的血糖水平(C)，响应葡萄糖激发的内源性胰岛素的血浆水平(D)和消化道通透性(E)。所有测量在高脂肪饮食(HFD)喂养和每日强饲处理10周后进行。每列/点代表n＝10-12的均值。

定义

饮食诱发的肥胖：饮食诱发的肥胖(DIO)是由进食(人类)或被喂食(动物模型)高脂肪和/或高密度饮食引起的肥胖。

异位脂质沉积：术语“脂质沉积”用于体脂肪的沉积。异位脂肪是通常只含有少量脂肪的非脂肪组织(如肝脏，骨骼肌，心脏和胰腺)的细胞内甘油三酯的储存。因此，术语“异位脂质沉积”是指储存在组织例如肝脏、骨骼肌、心脏和胰腺中的脂肪。

栖粪杆菌属(Faecalibacterium)：已知(Větrovsky T,Baldrian P(2013)The Variability of the 16S rRNA Gene in Bacterial Genomes and Its Consequences for Bacterial Community Analyses[细菌基因组中16S rRNA基因的可变性及其对于细菌群落分析的后果].PLoS ONE 8(2):e57923.doi:10.1371/journal.pone.0057923)16S rRNA基因序列同一性在属内变化。已经表明，同一性均值是95.56，标准偏差是3.68。还发现12.2％的属包含具有低于90％的16S rRNA基因均值配对相似性的物种。

SEQ ID NO:12含有归类为普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)属的16S rRNA基因序列，如Duncan,S.H等人,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.[国际系统与进化微生物学杂志]52(PT 6),2141-2146(2002)中描述和Hold G.L.于2001年9月19日向Gut Microbiology and Immunology[消化道微生物学和免疫学]提交的。因此，在此将菌株定义为栖粪杆菌属，其中所述菌株的16S rRNA基因的V1-V3区与SEQ ID NO:12具有至少90％，例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。

食物组合物：“食物组合物”是可作为食物对人施用的任何组合物。如本文中使用的，食物组合物与“饮食组合物”相同。

片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽或催化结构域；其中该片段具有溶菌酶。在一个方面，片段包括SEQ ID NO:1的至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸、至少177个氨基酸、至少180个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸或至少200个氨基酸，并且具有溶菌酶活性。

在另一方面，片段包括SEQ ID NO:4的至少210个氨基酸，例如至少215个氨基酸、至少220个氨基酸、至少225个氨基酸、至少230个氨基酸、至少235个氨基酸或至少240个氨基酸，并且具有溶菌酶活性。

在另一个方面，片段包括SEQ ID NO:15的至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸、至少177个氨基酸、至少180个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸或至少200个氨基酸，并且具有溶菌酶活性。

葡萄糖失调：术语“葡萄糖失调”是血糖水平的代谢和调节中的障碍。主要由葡萄糖失调引起的病症的实例包括低血糖症、高血糖症、胰岛素抗性、高胰岛素血症、X综合征、代谢综合征和糖尿病。

增加胃肠道微生物群中x细菌的比例：术语“增加胃肠道微生物群中x细菌的比例”是指与对照样品相比，特定分类学等级(例如，目或属)的细菌的量。可从消化道(即胃肠道)取出微生物群样品，并通过检查样品中16S rRNA基因的序列(读段)进行分析。可以基于序列同一性将16S rRNA基因的读段聚簇在一起，并且可以将每个簇与16S rRNA基因的已知序列的数据库进行比较以鉴定该簇中的细菌类型。可以将簇在不同的分类水平(门、纲、目、科、属或种)合并，以对整个样品中每个分类学水平内的细菌量进行定量分析。

通过比较从对照人到施用本发明溶菌酶的人的簇，可以确定微生物群的差异。这类确定的实例包括，例如与未施用溶菌酶的对照相比，取自施用溶菌酶的动物或人的微生物群中的栖粪杆菌属细菌的比例中的差异，或者与对照相比，取自施用溶菌酶的动物或人的微生物群中的梭菌目(Clostridiales)的细菌比例中的差异。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

溶菌酶活性：术语“溶菌酶活性”意指肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间或壳糊精中N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1,4-β-键的酶促水解，由于渗透压导致溶菌作用。溶菌酶属于EC 3.2.1.17酶类。通常通过比浊测定来测量溶菌酶活性。该方法是基于由溶菌酶溶菌作用诱导的藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 4698悬浮液的浊度变化。在适当的实验条件下，这些变化与培养基中溶菌酶的量成比例(参见Combined Compendium of Food Additive Specifications of the Food and Agriculture Organisation of the UN[联合国粮食及农业组织联合食品添加剂规格综合纲要]的INS 1105(www.fao.org))。出于本发明的目的，根据描述于实例5中的浊度测定(“溶菌酶活性的确定”)确定溶菌酶活性。在一个方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:1的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:4的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。在一个方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:15的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。

医疗设备：医疗设备在本文中理解为，符合美国联邦食品药品和化妆品(FD&C)法案(US Federal Food Drug&Cosmetic Act)的第201(h)部分中的医疗设备的定义的产品，包括仪器、装置、器具、机器、工具、植入物、体外试剂、或其他类似或相关的物品，包括在美国官方国家处方集(official National Formulary)或美国药典(United States Pharmacopoeia)中承认的组成部分或附件，或其任何补充物，用于在人或其他动物中治愈、减轻、治疗或预防疾病，或旨在影响人或其他动物体的结构或任何功能，并且不能通过人或其他动物身体内或身体上的化学作用达到其主要意图的目的且不依赖于代谢来实现其任何主要意图的目的。

微生物溶菌酶：术语“微生物溶菌酶”是指具有溶菌酶活性的多肽，其获得自或可获得自微生物来源。微生物来源的实例是真菌；即，溶菌酶获得自或可获得自真菌界，其中术语界是分类等级。具体地，所述微生物溶菌酶获得自或可获得自子囊菌门(Ascomycota)，如盘菌亚门(Pezizomycotina)，其中术语门和亚门是分类等级。

如果多肽的分类等级未知，则它可以容易地由本领域普通技术人员通过进行多肽的BLASTP检索(使用例如国家生物技术信息中心(NCIB)网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)并将其与最接近的同系物进行比较来确定。作为已知多肽的片段的未知多肽被认为是属于相同的分类物种。包括在多达10个位置中的取代、缺失和/或插入的未知天然多肽或人工变体被认为来自与已知多肽相同的分类物种。

获得自或可获得自：术语“获得自或可获得自”是指多肽可以在来自特定分类等级的生物体中发现。在一个实施例中，该多肽获得自或可获得自真菌界，其中术语界是分类等级。在一个优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自子囊菌门，其中术语门是分类等级。在另一个优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自盘菌亚门，其中亚门是分类等级。在另一个优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自散囊菌纲(Eurotiomycetes)，其中术语纲是分类等级。

操作分类单元(OTU)：术语“操作分类单元”意指具有一定程度的相似性的序列的簇。在这种情况下，选择97％作为将16S rRNA基因的序列分配给不同OTU的阈值，这意味着单个OTU内的所有序列具有至少97％的序列同一性。在这个同一性水平上，通常认为(或假定)每个OTU代表单一的细菌物种。

术后发作(flare up)：意指手术后疾病或病症的加剧。由此，表述“预防、减轻或治疗IBS和/或IBD的术后发作”是指预防、减轻或治疗在手术后出现IBS和/或IBD的风险。

预防：意指通过某种行动阻止或阻碍疾病、障碍、或疾病或病症的症状。

(病症的)缓解：意指症状变得不那么严重的疾病过程中的一段时间。由此，表述“维持IBS和/或IBD的缓解”意指预防或减轻IBS和/或IBD再次出现的风险。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指含有按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％和至多0.5％的与其天然或重组地相关的其他多肽材料的制剂。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该多肽来实现。

治疗组合物：“治疗组合物”是包含用于施用于人的药物活性成分的任何非食物组合物，其用于预防、减轻或治疗疾病。治疗组合物的实例包括但不限于，粉末，片剂，例如锭剂或泡腾片剂，胶囊，乳液或糊剂的组分，单独的小袋，口香糖，或更一般的组合物例如油滴剂，或本领域技术人员确定为微生物的有效载体的任何其它适合的载体。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括一个或多个(若干个)氨基酸残基的改变(即，取代、插入、和/或缺失)的具有溶菌酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据该位置的氨基酸之后添加1、2、或3个氨基酸。

在一个方面，根据本发明的溶菌酶变体可包含1至5；1至10；1至15；1至20；1至25；1至30；1至35；1至40；1至45；或1至50，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个改变，并且具有亲本溶菌酶例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:15的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的溶菌酶活性。

具体实施方式

已经发现，当提供给人时，包含微生物溶菌酶的组合物(如食物或药物组合物或医疗设备)导致微生物群的变化，这可能有益于改善人的健康。

在一个实施例中，本文中描述了一种用于预防、减轻或治疗肠易激综合征(IBS)和/或炎性肠病(IBD)的方法。在一个实施例中，所述方法包括提供和施用包含一种或多种微生物溶菌酶的组合物(如食物或药物组合物或医疗设备)。在一个实施例中，所述微生物溶菌酶获得自或可获得自真菌界。

由此，诸位发明人已发现微生物溶菌酶适合施用给患有肠易激综合征(IBS)和/或炎性肠病(IBD)的患者。

在一个实施例中，该方法用于在缓解期间预防、减轻或治疗患有肠易激综合征(IBS)和/或炎性肠病(IBD)的患者，其中所述缓解期是IBS和/或IBD症状的严重性暂时减少的时期。在一个实施例中，该方法用于在缓解期间预防、减轻或治疗患有克罗恩病或溃疡性结肠炎的患者，其中所述缓解期是IBS和/或IBD症状的严重性暂时减少的时期。

还可以施用本文中描述的微生物溶菌酶以获得例如人，如住院的老年人的体重增加。在一个实施例中，该方法包括在手术后向患者施用一种或多种微生物溶菌酶。在一个实施例中，该方法用于体重管理，如例如用于将体重保持在期望的水平。在一个实施例中，该方法用于对手术后或住院期间一般有体重减少风险的住院患者进行体重管理。

在一个实施例中，本发明涉及包含微生物溶菌酶的组合物用于获得人体重增加的用途，其中食物或食物添加剂包含一种或多种微生物溶菌酶。

在一个实施例中，与未接受包含微生物溶菌酶的组合物的对照相比，体重增加至少1％，例如至少1.5％，至少2.0％，至少2.5％，至少3％，至少3.5％，至少4％或至少5％。在另一个实施例中，与对照相比，体重增加1％至15％，例如1％至12％，1％至10％，1.5％至8％，2.0％至7％，或这些区间的任意组合。

此外，本发明涉及具有针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性的多肽的用途。约氏乳杆菌是人类肠道菌群中的一种重要细菌。不受特定理论的束缚，据信通过酶促裂解部分降解的细菌细胞壁从肠道菌群中去除死亡的约氏乳杆菌细胞是人肠道健康的重要贡献者。

在本发明的一个实施例中，与鸡蛋清溶菌酶(SEQ ID NO:5)的溶菌酶活性相比，本发明的多肽具有改善的溶菌酶活性，如通过用于确定针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性的方法确定。

本发明的一个方面针对一种改善人的肠道健康的方法，包括减少消化道中死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的量，包括向人提供如本发明定义的多肽。

本发明的一个方面针对一种改善人的肠道健康的方法，包括减少消化道中死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的量，包括提供选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的多肽。

本发明的一个方面针对一种促进从消化道中清除死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的方法，包括向人提供选自下组的多肽或多肽来源，该组由以下组成：与SEQ ID NO:15的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:24的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，或选自下组的多肽或多肽来源，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

在过去几年中，越来越多的研究已经清楚地描述了栖粪杆菌作为健康人类微生物群的组分的重要性。例如，普氏栖粪杆菌在许多肠道障碍特别是在IBD患者中具有低流行性(Current Opinion in Microbiology[微生物学当前观点]16(3)，第1-7页，2013年7月)。

在一个实施例中，本发明的组合物、方法和用途在治疗或预防与胃肠道中低丰度的栖粪杆菌有关的病症方面是高度有效的。在另一个实施例中，本发明的组合物、方法和用途提供胃肠道中的栖粪杆菌的增加。

在一个方面，本发明涉及一种或多种具有溶菌酶活性的多肽或包含微生物溶菌酶的组合物(如例如食物或药物组合物)或包含一种或多种具有溶菌酶活性的多肽的医疗设备，其中所述多肽来自糖基水解酶家族24(GH24)或糖基水解酶家族25(GH25)，并且获得自或可获得自真菌界。

在一个方面，用于本发明方法的具有溶菌酶活性的多肽是微生物溶菌酶。在一个实施例中，本发明中使用的包含一种或多种微生物溶菌酶的组合物(如例如食物或药物组合物或医疗设备)可以例如，用于稳定人的健康微生物群，其通过抑制细菌病原体如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大肠杆菌(Escherichia coli)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、耶尔森氏菌属(Yersinia)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、和沙门氏菌属物种如肠沙门氏菌(Salmonella enterica)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、肠球菌属(Enterococcus)物种和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的生长/肠道定殖。在另一个实施例中，本发明的溶菌酶对消化道的微生物平衡提供积极作用。

在一个实施例中，本发明中使用的组合物增加胃肠道微生物群中梭菌目细菌的比例。在一个实施例中，该梭菌目细菌的比例增加至少1％，例如至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少5％或至少7.5％。在一个备选的实施例中，该梭菌目细菌的比例增加至少1.25倍，例如至少1.50倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.5倍或至少3.0倍。

在一个实施例中，所述微生物溶菌酶是真菌来源的。在一个实施例中，所述微生物溶菌酶获得自或可获得自真菌界。在一个实施例中，所述微生物溶菌酶获得自或可获得自子囊菌门，例如盘菌亚门。在一个实施例中，所述微生物溶菌酶获得自或可获得自散囊菌纲。在又一个实施例中，所述微生物溶菌酶获得自或可获得自散囊菌目(Eurotiales)。在再一个实施例中，所述微生物溶菌酶获得自或可获得自曲霉科(Aspergillaceae)。在又一个实施例中，微生物溶菌酶获得自或可获得自曲霉属(Aspergillus)。

在一个实施例中，所述微生物溶菌酶包含选自由GH24和GH25组成的列表的一个或多个结构域。在一个实施例中，所述微生物溶菌酶包含来自GH24的一个或多个结构域。在一个实施例中，所述微生物溶菌酶包含来自GH25的一个或多个结构域。

在一个实施例中，本发明涉及一种增加胃肠道微生物群中栖粪杆菌属细菌的比例的方法，其中所述方法包括施用包含微生物溶菌酶的组合物(如食物或药物组合物或医疗设备)。在一个实施例中，以每kg组合物8至250ppm酶蛋白的水平施用所述微生物溶菌酶。在一个实施例中，该栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。在可替代的实施例中，该栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1.25倍，例如至少1.50倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.5倍或至少3.0倍。

在一个实施例中，该方法增加胃肠道微生物群中栖粪杆菌属细菌的比例，其中该栖粪杆菌属细菌包括与SEQ ID NO:12具有至少90％，例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的16S rRNA。在一个实施例中，该栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、或至少5％。在可替代的实施例中，该栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1.25倍，例如至少1.50倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.5倍或至少3.0倍。

在一个优选的实施例中，本发明涉及一种预防、减轻或治疗肠易激综合征(IBS)和/或炎性肠病(IBD)的方法，包括对患者施用包含一种或多种微生物溶菌酶的组合物(如例如食物或药物组合物或医疗设备)，其中：

(a)所述微生物溶菌酶是包含选自由GH24和GH25组成的列表的一个或多个结构域的微生物溶菌酶；和

(b)任选地，所述微生物溶菌酶在每日基础上施用达至少5天。

在另一个优选的实施例中，本发明涉及一种预防、减轻或治疗肠易激综合征(IBS)和/或炎性肠病(IBD)的方法，包括对患者施用包含一种或多种微生物溶菌酶的组合物(如例如食物或药物组合物或医疗设备)，其中：

(a)所述微生物溶菌酶是包含选自由GH24和GH25组成的列表的一个或多个结构域的微生物溶菌酶；和

(b)所述微生物溶菌酶在缓解期间内施用；

(c)任选地，所述微生物溶菌酶在每日基础上施用达至少5天，

其中所述缓解期是IBS和/或IBD症状的严重性暂时减少的时期。

在再一个优选的实施例中，本发明涉及一种增加胃肠道微生物组中栖粪杆菌属细菌的比例的方法，包括施用包含一种或多种微生物溶菌酶的组合物(如例如食物或药物组合物或医疗设备)，其中：

(a)所述微生物溶菌酶是获得自或可获得自子囊菌门，优选盘菌亚门的GH24溶菌酶；和

(b)动物的胃肠道微生物群中栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1％。

在另一个优选的实施例中，本发明涉及一种增加胃肠道微生物组中栖粪杆菌属细菌的比例的方法，包括施用包含一种或多种微生物溶菌酶的组合物(如例如食物或药物组合物或医疗设备)，其中：

(a)所述微生物溶菌酶是获得自或可获得自子囊菌门，优选盘菌亚门的GH25溶菌酶；

(b)动物的胃肠道微生物群中栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1％。

(a)所述微生物溶菌酶是获得自或可获得自子囊菌门，优选盘菌亚门的GH24溶菌酶；

(b)动物的胃肠道微生物群中栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1％；和(c)该栖粪杆菌属细菌包括与SEQ ID NO:12具有至少90％，例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的16S rRNA。

(a)所述微生物溶菌酶是获得自或可获得自子囊菌门，优选盘菌亚门的GH25溶菌酶；

在一个实施例中，本发明中使用的微生物溶菌酶以0.1至1000ppm酶蛋白每kg食物的水平给药，例如1至1000ppm或0.1至500ppm，1至500ppm，10至500ppm，10至300ppm或10至200ppm酶蛋白每kg食物，或这些区间的任何组合。在一个实施例中，所述微生物溶菌酶以11至125ppm酶蛋白每kg食物的水平给药，例如12至100ppm，13至75ppm，15至50ppm，17.5至40ppm，25至75ppm或30至60ppm酶蛋白每kg食物，或这些区间的任何组合。

在一个实施例中，所述微生物溶菌酶是真菌来源的。在一个实施例中，所述微生物溶菌酶获得自或可获得自子囊菌门，例如盘菌亚门。

在一个实施例中，所述微生物溶菌酶与SEQ ID NO:1具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

在一个实施例中，所述微生物溶菌酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为其具有溶菌酶活性的片段，其中该片段包括至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸、至少177个氨基酸、至少180个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸或至少200个氨基酸。在另一个实施例中，所述微生物溶菌酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其等位基因变体和N末端和/或C末端His标签和/或HQ标签，或由其组成。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1至208或由其组成。

在另一个实施例中，所述微生物溶菌酶是SEQ ID NO:1的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包括一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:1中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目是在1与45之间，如1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，在SEQ ID NO:1中包含一个或多个氨基酸取代和/或一个或多个氨基酸缺失和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:1中的取代、缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:1中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个另外的实施例中，在SEQ ID NO:1中的保守取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质]，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。保守取代的其他实例是G至A；A至G、S；V至I、L、A、T、S；I至V、L、M；L至I、M、V；M至L、I、V；P至A、S、N；F至Y、W、H；Y至F、W、H；W至Y、F、H；R至K、E、D；K至R、E、D；H至Q、N、S；D至N、E、K、R、Q；E至Q、D、K、R、N；S至T、A；T至S、V、A；C至S、T、A；N至D、Q、H、S；Q至E、N、H、K、R。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单一丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的溶菌酶活性以识别对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。

嗜碱枝顶孢CBS114.92溶菌酶的晶体结构是以的解析度解析，如在WO 2013/076253中所披露。这些原子坐标可以用来生成描绘嗜碱枝顶孢CBS114.92溶菌酶的结构或同源结构(例如本发明的变体)的三维模型。使用x射线结构，将氨基酸残基D95和E97(使用SEQ ID NO:1用于编号)鉴定为催化性残基。

在一个实施例中，所述微生物溶菌酶与SEQ ID NO:4具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

在一个实施例中，本发明中使用的微生物溶菌酶包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为其具有溶菌酶活性的片段，其中该片段包括至少210个氨基酸，例如至少215个氨基酸、至少220个氨基酸、至少225个氨基酸、至少230个氨基酸、至少235个氨基酸或至少240个氨基酸。在另一个实施例中，所述微生物溶菌酶包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位基因变体和N末端和/或C末端His标签和/或HQ标签，或由其组成。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸1至245或由其组成。

在另一个实施例中，所述微生物溶菌酶是SEQ ID NO:4的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包括一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:4中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目是在1与45之间，如1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，在SEQ ID NO:4中包含一个或多个氨基酸取代和/或一个或多个氨基酸缺失和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:4中的取代、缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:4中取代(优选保守取代)的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个另外的实施例中，在SEQ ID NO:4中的保守取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一个实施例中，具有溶菌酶活性的多肽与SEQ ID NO:15具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

在一个实施例中，具有溶菌酶活性的多肽与SEQ ID NO:18具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

在一个实施例中，具有溶菌酶活性的多肽与SEQ ID NO:21具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

在一个实施例中，具有溶菌酶活性的多肽与SEQ ID NO:24具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

在一个实施例中，具有溶菌酶活性的多肽与SEQ ID NO:27具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

在一个实施例中，具有溶菌酶活性的多肽与SEQ ID NO:30具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

上文描述了氨基酸变化、保守取代和N和/或C末端接头的实例。

由世界卫生组织定义为“当以适当的量施用时赋予宿主益处的活生物体”的益生菌的施用，是对普通健康群体的一种安全的营养干预。益生菌见于人的肠道中并且通常存在于酸奶和其他饮食和/或食品类(例如，饮料、谷物和巧克力糖果条)中。

组合物：

根据本发明制备的组合物可以以食物或饮食补充物的形式施用，并且可以是任何液体、固体或半固体形式。例如，它们可以是乳制品，如例如发酵的乳制品，其至少包含所述微生物溶菌酶，任选与其他细菌组合，例如与酸奶发酵物或奶酪，或其他食物产品如小吃棒、巧克力，或饮料如果汁一起。食物组合物的非限制性实例包括全脂乳、脱脂乳、改性乳、调味乳，酸奶包括天然、调味、冷冻或饮用的酸奶，滋补品和运动饮料，其他乳制品如蛋奶(custard)，奶酪和卡特基奶酪(cottage cheese)配制品和冰淇淋。半固体食物组合物可选自糊和涂抹物。固体组合物可包括食物棒、饼干、谷物、食物纤维或任何其他食物。

微生物溶菌酶还可以作为饮食补充物以粉末、片剂(例如锭剂或泡腾片剂)、胶囊形式、作为乳液或糊剂的组分、或本领域技术人员确定为活微生物的有效载体的任何其它适合的载体的形式提供。包含微生物溶菌酶的组合物可以是在单独的小袋、胶囊、口香糖、或更一般性的组合物例如油滴中。

在一个实施例中，所述食物组合物是最终产品，其已准备好供消费者食用。因此，它可以由消费者购买或以其他方式获得。然而，食物组合物也可以是用于生产其他食物的基本组分。

如本文所述的食物组合物可包含载体。术语“载体”表明微生物溶菌酶分布在整个载体中并且是本领域技术人员已知的。用于本发明的载体包括但不限于例如天然面粉，预干粉，淀粉，改性淀粉，植物蛋白，乳蛋白，变性蛋白质和糖醇，如例如甘露醇、山梨醇、肌醇、卫矛醇、木糖醇或阿拉伯糖醇。如此，载体是食物组合物的主要组分。优选地，基于载体和微生物溶菌酶的组合的量，载体中微生物溶菌酶的总量低于5％(w/w)，更优选低于2％(w/w)或低于0.5％(w/w)。在一个具体的实施例中，食物组合物由微生物溶菌酶和载体组成。但是，组合物可包含添加剂。优选地，这类添加剂也分布在整个载体中。

优选实施例

1.一种预防、减轻或治疗肠易激综合征(IBS)或炎性肠病(IBD)的方法，其包括施用微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物。

2.如实施例1所述的方法，其中包含溶菌酶的组合物以每kg组合物0.1至1000ppm酶蛋白的水平施用。

3.如实施例1或2所述的方法，其中包含溶菌酶的组合物以每kg体重1至200mg酶蛋白的水平施用，例如每kg体重1至150mg、2至100mg、2至90mg、2至80mg或10至70mg酶蛋白。

4.如实施例1至3中任一项所述的方法，其中包含溶菌酶的组合物以每kg体重0.04至11.0μmol酶蛋白的水平施用，例如每kg体重0.1至6.0μmol、0.2至5.0μmol、0.3至4.0μmol或0.4至3.0μmol酶蛋白。

5.如实施例1至4中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自真菌界。

6.如实施例1至5中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶稳定胃肠道中的健康微生物群并抑制细菌病原体的生长和/或肠道定殖。

7.如实施例1至6中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗炎症。

8.如实施例1至7中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗胃肠道中的炎症。

9.如实施例1至7中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗上部胃肠道中的炎症。

10.如实施例1至7中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗下部胃肠道中的炎症。

11.如实施例1至10中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶维持IBS和/或IBD的缓解。

12.如实施例1至11中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗术后发作。

13.如实施例1至12中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶减少与肥胖如例如饮食诱发的肥胖有关的异位脂质沉积。

14.如实施例13所述的方法，其中所述微生物溶菌酶是与SEQ ID NO:1具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽。

15.如实施例1至14中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶改善与肥胖如例如饮食诱发的肥胖有关的葡萄糖失调。

16.如实施例15所述的方法，其中所述微生物溶菌酶是与SEQ ID NO:1具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽。

17.如实施例1至16中任一项所述的方法，其中所述组合物增加胃肠道微生物群中栖粪杆菌属细菌的比例。

18.如实施例17所述的方法，其中所述栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。

19.如实施例17所述的方法，其中所述栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1.25倍，例如至少1.50倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.5倍或至少3.0倍。

20.如实施例1至19中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自子囊菌门。

21.如实施例1至19中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自盘菌亚门。

22.如实施例1至21中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶包含选自由GH24和GH25组成的列表的一个或多个结构域。

23.如实施例1至21中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶包含来自GH24的一个或多个结构域。

24.如实施例1至21中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶包含来自GH25的一个或多个结构域。

25.如实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：

(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:1具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；

(b)SEQ ID NO:1的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个氨基酸取代和/或一个或多个氨基酸缺失和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；

(c)具有溶菌酶活性的(a)或(b)的多肽的片段，其中该片段包括至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸，至少177个氨基酸，至少180个氨基酸，至少185个氨基酸，至少190个氨基酸，至少195个氨基酸或至少200个氨基酸；

(d)多肽，该多肽与SEQ ID NO:4具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；

(e)SEQ ID NO:4的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个氨基酸取代和/或一个或多个氨基酸缺失和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；

(f)具有溶菌酶活性的(d)或(e)的多肽的片段，其中该片段包括至少210个氨基酸，例如至少215个氨基酸、至少220个氨基酸、至少225个氨基酸、至少230个氨基酸、至少235个氨基酸或至少240个氨基酸；

(g)多肽，该多肽与SEQ ID NO:15具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；

(h)SEQ ID NO:15的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个氨基酸取代和/或一个或多个氨基酸缺失和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；和

(i)具有溶菌酶活性的(g)或(h)的多肽的片段，其中该片段包括至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸，至少177个氨基酸，至少180个氨基酸，至少185个氨基酸，至少190个氨基酸，至少195个氨基酸或至少200个氨基酸。

26.如实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：

(d)多肽，该多肽与SEQ ID NO:15具有至少50％，例如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性；

(e)SEQ ID NO:15的变体，其中该变体具有溶菌酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个氨基酸取代和/或一个或多个氨基酸缺失和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；和

(f)具有溶菌酶活性的(d)或(e)的多肽的片段，其中该片段包括至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸，至少177个氨基酸，至少180个氨基酸，至少185个氨基酸，至少190个氨基酸，至少195个氨基酸或至少200个氨基酸。

27.如实施例1至25中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至208、SEQ ID NO:4的氨基酸1至245和SEQ ID NO:15的氨基酸1至207。

28.如实施例1至26中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至208和SEQ ID NO:15的氨基酸1至207。

29.如实施例1至28中任一项所述的方法，用于治疗人。

30.如实施例1至29中任一项所述的方法，其中所述组合物是液体配制品。

31.如实施例1至29中任一项所述的方法，其中所述组合物是固体配制品。

32.如实施例1至31中任一项所述的方法，其中所述组合物是食物或药物组合物或医疗设备。

33.如实施例1至32中任一项所述的方法，其中所述组合物是食物组合物。

34.如实施例1至32中任一项所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。

35.如实施例1至32中任一项所述的方法，其中所述组合物是医疗设备。

36.如实施例1至35中任一项所述的方法，其中所述组合物的形式为粉末、片剂、锭剂、泡腾片剂、胶囊、乳液、糊剂、单独的小袋、口香糖或油滴。

37.如实施例1至36中任一项所述的方法，其中所述组合物通过口服或直肠施用以可能的程度施用。

38.一种改善人的肠道健康的方法，其包括减少消化道中死亡的约氏乳杆菌细胞的量，包括向所述人提供分离的GH25多肽，该多肽具有针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性，如通过用于确定针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性的方法确定。

39.一种改善人的肠道健康的方法，包括减少消化道中死亡的约氏乳杆菌细胞的量，包括向所述人提供选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:15的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:24的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，优选地选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:15的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，更优选地选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，甚至更优选为与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽或与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽。

40.一种改善人的肠道健康的方法，包括减少消化道中死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的量，包括向所述人提供选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

41.一种改善人的肠道健康的方法，包括减少消化道中死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的量，包括向所述人提供选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

42.一种改善人的肠道健康的方法，包括减少消化道中死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的量，包括向所述人提供选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:27的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

43.一种促进从人的消化道中清除死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的方法，包括向所述人提供分离的GH25多肽，该多肽具有针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性，如通过用于确定针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性的方法确定。

44.一种促进从人的消化道中清除死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的方法，包括向所述人提供选自下组的多肽来源，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:15的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:24的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，优选地选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:15的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，更优选地选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，甚至更优选为与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽或与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽。

45.一种促进从人的消化道中清除死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的方法，包括向所述人提供选自下组的多肽来源，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

46.一种促进从人的消化道中清除死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的方法，包括向所述人提供选自下组的多肽来源，该组由以下组成：与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

47.一种促进从人的消化道中清除死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的方法，包括向所述人提供选自下组的多肽来源，该组由以下组成：与SEQ ID NO:27的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

48.如实施例38至47中任一项所述的方法，其中所述多肽在5ppm具有针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性，该溶菌酶活性在405nm处的光密度(OD)测量增加至少0.20，如通过用于确定针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性的方法确定。

49.如实施例38至48中任一项所述的方法，其中所述具有溶菌酶活性的多肽预防、减轻或治疗炎症。

50.如实施例38至48中任一项所述的方法，其中所述具有溶菌酶活性的多肽预防、减轻和治疗胃肠道中的炎症。

51.如实施例38至48中任一项所述的方法，其中所述具有溶菌酶活性的多肽预防、减轻和治疗上部胃肠道中的炎症。

52.如实施例38至48中任一项所述的方法，其中所述具有溶菌酶活性的多肽预防、减轻和治疗下部胃肠道中的炎症。

53.一种增加胃肠道微生物组中栖粪杆菌属细菌的比例的方法，包括对患者施用微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物。

54.如实施例53所述的方法，其中包含溶菌酶的组合物以每kg组合物0.1至1000ppm酶蛋白的水平施用。

55.如实施例53或54所述的方法，其中包含溶菌酶的组合物以每kg体重1至200mg酶蛋白的水平施用，例如每kg体重1至150mg、2至100mg、2至90mg、2至80mg或10至70mg酶蛋白。

56.如实施例53至55中任一项所述的方法，其中包含溶菌酶的组合物以每kg体重0.04至11.0μmol酶蛋白的水平施用，例如每kg体重0.1至6.0μmol、0.2至5.0μmol、0.3至4.0μmol或0.4至3.0μmol酶蛋白。

57.如实施例53至56中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自真菌界。

58.如实施例53至57中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶稳定胃肠道中的健康微生物群并抑制细菌病原体的生长和/或肠道定殖。

59.如实施例53至58中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗炎症。

60.如实施例53至58中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗胃肠道中的炎症。

61.如实施例53至58中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗上部胃肠道中的炎症。

62.如实施例53至58中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗下部胃肠道中的炎症。

63.如实施例53至62中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶维持IBS和/或IBD的缓解。

64.如实施例53至63中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗术后发作。

65.如实施例53至64中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶减少与肥胖如例如饮食诱发的肥胖有关的异位脂质沉积。

66.如实施例53至65中任一项所述的方法，其中栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1.25倍，例如至少1.50倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.5倍或至少3.0倍。

67.如实施例53至66中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自子囊菌门。

68.如实施例53至66中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自盘菌亚门。

69.如实施例53至68中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶包含选自由GH24和GH25组成的列表的一个或多个结构域。

70.如实施例53至68中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶包含来自GH24的一个或多个结构域。

71.如实施例53至68中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶包含来自GH25的一个或多个结构域。

72.如实施例53至71中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：

73.如实施例53至71中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：

74.如实施例53至72中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至208、SEQ ID NO:4的氨基酸1至245和SEQ ID NO:15的氨基酸1至207。

75.如实施例53至73中任一项所述的方法，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至208和SEQ ID NO:15的氨基酸1至207。

76.如实施例53至75中任一项所述的方法，用于治疗人。

77.如实施例53至76中任一项所述的方法，其中所述组合物是液体配制品。

78.如实施例53至76中任一项所述的方法，其中所述组合物是固体配制品。

79.如实施例53至78中任一项所述的方法，其中所述组合物是食物或药物组合物或医疗设备。

80.如实施例53至79中任一项所述的方法，其中所述组合物是食物组合物。

81.如实施例53至79中任一项所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。

82.如实施例53至79中任一项所述的方法，其中所述组合物是医疗设备。

83.如实施例53至82中任一项所述的方法，其中所述组合物的形式为粉末、片剂、锭剂、泡腾片剂、胶囊、乳液、糊剂、单独的小袋、口香糖或油滴。

84.如实施例53至83中任一项所述的方法，其中所述组合物通过口服或直肠施用以可能的程度施用。

85.如实施例1至84中任一项所述的方法，其中所述方法用于治疗克罗恩病和/或溃疡性结肠炎。

86.微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物在制造用于预防、减轻或治疗肠易激综合征(IBS)或炎性肠病(IBD)的药物中的用途。

87.如实施例86所述的用途，其中包含溶菌酶的组合物以每kg组合物0.1至1000ppm酶蛋白的水平施用。

88.如实施例86或87所述的用途，其中包含溶菌酶的组合物以每kg体重1至200mg酶蛋白的水平施用，例如每kg体重1至150mg、2至100mg、2至90mg、2至80mg或10至70mg酶蛋白。

89.如实施例86至88中任一项所述的用途，其中包含溶菌酶的组合物以每kg体重0.04至11.0μmol酶蛋白的水平施用，例如每kg体重0.1至6.0μmol、0.2至5.0μmol、0.3至4.0μmol或0.4至3.0μmol酶蛋白。

90.如实施例86至89中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自真菌界。

91.如实施例86至90中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶稳定胃肠道中的健康微生物群并抑制细菌病原体的生长和/或肠道定殖。

92.如实施例86至91中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗炎症。

93.如实施例86至92中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗胃肠道中的炎症。

94.如实施例86至92中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗上部胃肠道中的炎症。

95.如实施例86至92中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗下部胃肠道中的炎症。

96.如实施例86至95中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶维持IBS和/或IBD的缓解。

97.如实施例86至96中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗术后发作。

98.如实施例86至97中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶减少与肥胖如例如饮食诱发的肥胖有关的异位脂质沉积。

99.如实施例86至98中任一项所述的用途，其中所述组合物增加胃肠道微生物群中栖粪杆菌属细菌的比例。

100.如实施例99所述的用途，其中所述栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。

101.如实施例99所述的用途，其中所述栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1.25倍，例如至少1.50倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.5倍或至少3.0倍。

102.如实施例86至101中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自子囊菌门。

103.如实施例86至101中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自盘菌亚门。

104.如实施例86至103中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶包含选自由GH24和GH25组成的列表的一个或多个结构域。

105.如实施例86至103中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶包含来自GH24的一个或多个结构域。

106.如实施例86至103中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶包含来自GH25的一个或多个结构域。

107.如实施例86至106中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：

108.如实施例86至106中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：

109.如实施例86至107中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至208、SEQ ID NO:4的氨基酸1至245和SEQ ID NO:15的氨基酸1至207。

110.如实施例86至108中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至208和SEQ ID NO:15的氨基酸1至207。

111.如实施例86至110中任一项所述的用途，用于治疗人。

112.如实施例86至111中任一项所述的用途，其中所述组合物是液体配制品。

113.如实施例86至111中任一项所述的用途，其中所述组合物是固体配制品。

114.如实施例86至113中任一项所述的用途，其中所述组合物是食物或药物组合物或医疗设备。

115.如实施例86至114中任一项所述的用途，其中所述组合物是食物组合物。

116.如实施例86至114中任一项所述的用途，其中所述组合物是药物组合物。

117.如实施例86至114中任一项所述的用途，其中所述组合物是医疗设备。

118.如实施例86至117中任一项所述的用途，其中所述组合物的形式为粉末、片剂、锭剂、泡腾片剂、胶囊、乳液、糊剂、单独的小袋、口香糖或油滴。

119.如实施例86至118中任一项所述的用途，其中所述组合物通过口服或直肠施用以可能的程度施用。

120.微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物在制造用于增加胃肠道微生物组中栖粪杆菌属细菌的比例的药物中的用途。

121.如实施例120中所述的用途，其中包含溶菌酶的组合物以每kg组合物0.1至1000ppm酶蛋白的水平施用。

122.如实施例120或121所述的用途，其中包含溶菌酶的组合物以每kg体重1至200mg酶蛋白的水平施用，例如每kg体重1至150mg、2至100mg、2至90mg、2至80mg或10至70mg酶蛋白。

123.如实施例120至122中任一项所述的用途，其中包含溶菌酶的组合物以每kg体重0.04至11.0μmol酶蛋白的水平施用，例如每kg体重0.1至6.0μmol、0.2至5.0μmol、0.3至4.0μmol或0.4至3.0μmol酶蛋白。

124.如实施例120至123中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自真菌界。

125.如实施例120至124中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶稳定胃肠道中的健康微生物群并抑制细菌病原体的生长和/或肠道定殖。

126.如实施例120至125中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗炎症。

127.如实施例120至126中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗胃肠道中的炎症。

128.如实施例120至126中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗上部胃肠道中的炎症。

129.如实施例120至126中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗下部胃肠道中的炎症。

130.如实施例120至129中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶维持IBS和/或IBD的缓解。

131.如实施例120至130中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗术后发作。

132.如实施例120至131中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶减少与肥胖如例如饮食诱发的肥胖有关的异位脂质沉积。

133.如实施例120至132中任一项所述的用途，其中栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。

134.如实施例120至132中任一项所述的用途，其中栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1.25倍，例如至少1.50倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.5倍或至少3.0倍。

135.如实施例120至134中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自子囊菌门。

136.如实施例120至135中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自盘菌亚门。

137.如实施例120至136中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶包含选自由GH24和GH25组成的列表的一个或多个结构域。

138.如实施例120至136中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶包含来自GH24的一个或多个结构域。

139.如实施例120至136中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶包含来自GH25的一个或多个结构域。

140.如实施例120至139中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：

141.如实施例120至139中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：

142.如实施例120至140中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至208、SEQ ID NO:4的氨基酸1至245和SEQ ID NO:15的氨基酸1至207。

143.如实施例120至141中任一项所述的用途，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至208和SEQ ID NO:15的氨基酸1至207。

144.如实施例120至143中任一项所述的用途，用于治疗人。

145.如实施例120至144中任一项所述的用途，其中所述组合物是液体配制品。

146.如实施例120至144中任一项所述的用途，其中所述组合物是固体配制品。

147.如实施例120至146中任一项所述的用途，其中所述组合物是食物或药物组合物或医疗设备。

148.如实施例120至147中任一项所述的用途，其中所述组合物是食物组合物。

149.如实施例120至147中任一项所述的用途，其中所述组合物是药物组合物。

150.如实施例120至147中任一项所述的用途，其中所述组合物是医疗设备。

151.如实施例120至150中任一项所述的用途，其中所述组合物的形式为粉末、片剂、锭剂、泡腾片剂、胶囊、乳液、糊剂、单独的小袋、口香糖或油滴。

152.如实施例120至151中任一项所述的用途，其中所述组合物通过口服或直肠施用以可能的程度施用。

153.如实施例86至152中任一项所述的用途，其中所述用途用于治疗克罗恩病和/或溃疡性结肠炎。

154.一种微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其用于预防、减轻或治疗肠易激综合征(IBS)或炎性肠病(IBD)的方法中。

155.如实施例154所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中包含溶菌酶的组合物以每kg组合物0.1至1000ppm酶蛋白的水平施用。

156.如实施例154或155所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中包含溶菌酶的组合物以每kg体重1至200mg酶蛋白的水平施用，例如每kg体重1至150mg、2至100mg、2至90mg、2至80mg或10至70mg酶蛋白。

157.如实施例154至156中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中包含溶菌酶的组合物以每kg体重0.04至11.0μmol酶蛋白的水平施用，例如每kg体重0.1至6.0μmol、0.2至5.0μmol、0.3至4.0μmol或0.4至3.0μmol酶蛋白。

158.如实施例154至157中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自真菌界。

159.如实施例154至158中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶稳定胃肠道中的健康微生物群并抑制细菌病原体的生长和/或肠道定殖。

160.如实施例154至159中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗炎症。

161.如实施例154至160中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗胃肠道中的炎症。

162.如实施例154至160中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗上部胃肠道中的炎症。

163.如实施例154至160中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗下部胃肠道中的炎症。

164.如实施例154至163中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶维持IBS和/或IBD的缓解。

165.如实施例154至164中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗术后发作。

166.如实施例154至165中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶减少与肥胖如例如饮食诱发的肥胖有关的异位脂质沉积。

167.如实施例154至166中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物增加胃肠道微生物群中栖粪杆菌属细菌的比例。

168.如实施例167所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。

169.如实施例167所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1.25倍，例如至少1.50倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.5倍或至少3.0倍。

170.如实施例154至169中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自子囊菌门。

171.如实施例154至169中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自盘菌亚门。

172.如实施例154至171中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶包含选自由GH24和GH25组成的列表的一个或多个结构域。

173.如实施例154至172中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶包含来自GH24的一个或多个结构域。

174.如实施例154至172中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶包含来自GH25的一个或多个结构域。

175.如实施例154至174中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：

176.如实施例154至174中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：

177.如实施例154至175中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至208、SEQ ID NO:4的氨基酸1至245和SEQ ID NO:15的氨基酸1至207。

178.如实施例154至176中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至208和SEQ ID NO:15的氨基酸1至207。

179.如实施例154至178中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其用于治疗人。

180.如实施例154至179中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物是液体配制品。

181.如实施例154至179中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物是固体配制品。

182.如实施例154至181中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物是食物或药物组合物或医疗设备。

183.如实施例154至182中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物是食物组合物。

184.如实施例154至182中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

185.如实施例154至182中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物是医疗设备。

186.如实施例154至185中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物的形式为粉末、片剂、锭剂、泡腾片剂、胶囊、乳液、糊剂、单独的小袋、口香糖或油滴。

187.如实施例154至186中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物通过口服或直肠施用以可能的程度施用。

188.微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其用于增加胃肠道微生物组中栖粪杆菌属细菌的比例的方法中。

189.如实施例188所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中包含溶菌酶的组合物以每kg组合物0.1至1000ppm酶蛋白的水平施用。

190.如实施例188或189所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中包含溶菌酶的组合物以每kg体重1至200mg酶蛋白的水平施用，例如每kg体重1至150mg、2至100mg、2至90mg、2至80mg或10至70mg酶蛋白。

191.如实施例188至190中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中包含溶菌酶的组合物以每kg体重0.04至11.0μmol酶蛋白的水平施用，例如每kg体重0.1至6.0μmol、0.2至5.0μmol、0.3至4.0μmol或0.4至3.0μmol酶蛋白。

192.如实施例188至191中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自真菌界。

193.如实施例188至192中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶稳定胃肠道中的健康微生物群并抑制细菌病原体的生长和/或肠道定殖。

194.如实施例188至193中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗炎症。

195.如实施例188至194中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗胃肠道中的炎症。

196.如实施例188至194中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗上部胃肠道中的炎症。

197.如实施例188至194中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗下部胃肠道中的炎症。

198.如实施例188至197中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶维持IBS和/或IBD的缓解。

199.如实施例188至198中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗术后发作。

200.如实施例188至199中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶减少与肥胖如例如饮食诱发的肥胖有关的异位脂质沉积。

201.如实施例188至200中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1％，例如至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。

202.如实施例188至200中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述栖粪杆菌属细菌的比例增加至少1.25倍，例如至少1.50倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.5倍或至少3.0倍。

203.如实施例188至202中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自子囊菌门。

204.如实施例188至203中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶获得自或可获得自盘菌亚门。

205.如实施例188至204中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶包含选自由GH24和GH25组成的列表的一个或多个结构域。

206.如实施例188至205中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶包含来自GH24的一个或多个结构域。

207.如实施例188至205中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶包含来自GH25的一个或多个结构域。

208.如实施例188至207中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：

209.如实施例188至207中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：

210.如实施例188至208中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至208、SEQ ID NO:4的氨基酸1至245和SEQ ID NO:15的氨基酸1至207。

211.如实施例188至209中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1至208和SEQ ID NO:15的氨基酸1至207。

212.如实施例188至211中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其用于治疗人。

213.如实施例188至212中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物是液体配制品。

214.如实施例188至212中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物是固体配制品。

215.如实施例188至214中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物是食物或药物组合物或医疗设备。

216.如实施例188至215中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物是食物组合物和/或补充物。

217.如实施例188至215中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

218.如实施例188至215中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物是医疗设备。

219.如实施例188至218中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物的形式为粉末、片剂、锭剂、泡腾片剂、胶囊、乳液、糊剂、单独的小袋、口香糖或油滴。

220.如实施例188至219中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述组合物通过口服或直肠施用以可能的程度施用。

221.如实施例154至220中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物用于治疗克罗恩病和/或溃疡性结肠炎。

222.如实施例1至153中任一项所述的方法或用途，其中所述微生物溶菌酶减少消化道中死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的量。

223.如实施例1至153中任一项所述的方法或用途，其中所述微生物溶菌酶促进从人的消化道中清除死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片。

224.如实施例1至153或222至223中任一项所述的方法或用途，其中所述微生物溶菌酶具有针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性，如通过用于确定针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性的方法确定。

225.如实施例222至224中任一项所述的方法或用途，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:15的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:24的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，优选地选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:15的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，更优选地选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，甚至更优选为与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽或与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽。

226.如实施例222至224中任一项所述的方法或用途，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

227.如实施例222至224中任一项所述的方法或用途，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

228.如实施例222至224中任一项所述的方法或用途，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：与SEQ ID NO:27的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

229.如实施例222至228中任一项所述的方法或用途，其中所述微生物溶菌酶在5ppm具有针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性，该溶菌酶活性在405nm处的光密度(OD)测量增加至少0.20，如通过用于确定针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性的方法确定。

230.如实施例222至229中任一项所述的方法或用途，其中具有溶菌酶活性的所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗炎症。

231.如实施例222至230中任一项所述的方法或用途，其中具有溶菌酶活性的所述微生物溶菌酶预防、减轻和治疗胃肠道中的炎症。

232.如实施例222至230中任一项所述的方法或用途，其中具有溶菌酶活性的所述微生物溶菌酶预防、减轻和治疗上部胃肠道中的炎症。

233.如实施例222至230中任一项所述的方法或用途，其中具有溶菌酶活性的所述微生物溶菌酶预防、减轻和治疗下部胃肠道中的炎症。

234.如实施例154至221中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶减少消化道中死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片的量。

235.如实施例154至221中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶促进从人的消化道中清除死亡的约氏乳杆菌细胞或其细胞壁碎片。

236.如实施例154至221或234至235中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶具有针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性，如通过用于确定针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性的方法确定。

237.如实施例234至236中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:15的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:24的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，优选地选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:15的多肽具有至少90％的序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，更优选地选自下组的多肽，该组由以下组成：与SEQ ID NO:18的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽、和与SEQ ID NO:30的多肽具有至少90％序列同一性的多肽，甚至更优选为与SEQ ID NO:21的多肽具有至少90％序列同一性的多肽或与SEQ ID NO:27的多肽具有至少90％序列同一性的多肽。

238.如实施例234至236中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

239.如实施例234至236中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：与SEQ ID NO:21的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

240.如实施例234至236中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶选自下组，该组由以下组成：与SEQ ID NO:27的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽。

241.如实施例234至240中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中所述微生物溶菌酶在5ppm具有针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性，该溶菌酶活性在405nm处的光密度(OD)测量增加至少0.20，如通过用于确定针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性的方法确定。

242.如实施例234至241中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中具有溶菌酶活性的所述微生物溶菌酶预防、减轻或治疗炎症。

243.如实施例234至242中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中具有溶菌酶活性的所述微生物溶菌酶预防、减轻和治疗胃肠道中的炎症。

244.如实施例234至242中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中具有溶菌酶活性的所述微生物溶菌酶预防、减轻和治疗上部胃肠道中的炎症。

245.如实施例234至242中任一项所述的微生物溶菌酶或包含微生物溶菌酶的组合物，其中具有溶菌酶活性的所述微生物溶菌酶预防、减轻和治疗下部胃肠道中的炎症。

实例

菌株

褐孢长毛盘菌CBS804.70购自荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures)(乌得勒支(Utrecht),荷兰)。根据荷兰菌种保藏中心，褐孢长毛盘菌CBS804.70于1968年5月从英国斯塔福德郡的煤矸石端土(tip soil)中分离出来。

根据荷兰菌种保藏中心，由A.Yoneda在1984年从日本的津久井湖(Tsukui Lake)附近的猪粪便堆肥的污泥中分离出嗜碱枝顶孢CBS 114.92。

培养基和溶液

YP+2％葡萄糖培养基由1％酵母提取物、2％蛋白胨以及2％葡萄糖构成。

YP+2％麦芽糊精培养基由1％酵母提取物、2％蛋白胨以及2％麦芽糊精构成。

PDA琼脂板是由马铃薯浸出液(马铃薯浸出液是通过将300g切片的(经过洗涤但未削皮)的马铃薯在水中煮沸30分钟，然后将该培养液倾析或滤过粗滤布而制成)构成的。然后添加蒸馏水，直到悬浮液的总体积为一升，随后添加20g的右旋糖和20g的琼脂粉。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual，第8版，修订A，1998)。

LB板由10g的细菌用胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的细菌用琼脂(Bacto-agar)及补足至1升的去离子水构成。

LB培养基由10g的细菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物、10g的氯化钠，以及补足到1升的去离子水组成。

COVE蔗糖板由342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20ml的COVE盐溶液及补足至1升的去离子水构成。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual，第8版，修订A，1998)。将该培养基冷却至60℃并添加10mM的乙酰胺、15mM的CsCl、X-100(50μl/500ml)。

COVE盐溶液是由26g的MgSO4·7H2O、26g的KCL、26g的KH2PO4、50ml的COVE痕量金属溶液及补足到1升的去离子水构成的。

COVE痕量金属溶液是由0.04g的Na2B4O7·10H2O，0.4g的CuSO4·5H2O，1.2g的FeSO4·7H2O，0.7g的MnSO4·H2O，0.8g的Na2MoO4·2H2O，10g的ZnSO4·7H2O，和补足到1升的去离子水构成。

实例1：来自嗜碱枝顶孢CBS 114.92的GH25溶菌酶的克隆、表达和纯化

如WO 2013/076253的实例2中所述，将来自嗜碱枝顶孢CBS 114.92的GH25溶菌酶(SEQ ID NO:1)克隆并表达，并如实例5中所述的进行纯化。

实例2：来自褐孢长毛盘菌的GH24溶菌酶的表达

在20℃，在1000ml锥形摇瓶中的100ml的YP+2％葡萄糖培养基中培养真菌菌株5天。通过由衬有(EMD密理博公司(EMD Millipore)，比勒利卡(Billerica)，马萨诸塞州，美国)的Buchner真空漏斗对培养基进行过滤从这些瓶中收获菌丝体。将菌丝体冷冻于液氮中并在-80℃储存直至进一步使用。根据制造商的说明，使用植物大提试剂盒(Plant Maxi Kit)(QIAGEN GMBH，希尔登(Hilden)，德国)分离基因组DNA。

通过Illumina MySeq(Illumina Inc.，圣迭哥(San Diego)，加利福尼亚州)产生基因组序列信息。根据制造商的说明，将5μg的分离的褐孢长毛盘菌基因组DNA用于文库制备和分析。采用100bp配对端策略，文库插入尺寸为200-500bp。针对总计95,744,298,100bp的所获得的原始读段，使用HiSeq运行的一半。随后将该读段分级为25％，随后修正(提取最长的、具有10或更多Phred-得分的子序列)。使用Idba版本0.19集合这些读段。丢弃短于400bp的叠连群，得到8,954,791,030bp，N-50为10,035。使用GeneMark.hmm ES版本2.3c调用基因，并使用由Pfam提供的“噬菌体溶菌酶PF00959”隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model)进行该催化结构域的鉴定。使用如下描述的引物F-80470和R-80470(分别为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7)通过PCR从褐孢长毛盘菌CBS804.70基因组DNA克隆整个编码区的多肽编码序列。

5’-ACACAACTGGGGATCCACCATGCACGCTCTCACCCTTCT-3’(SEQ ID NO:6)

5’-CTAGATCTCGAGAAGCTTTTAGCACTTGGGAGGGTGGG-3’(SEQ ID NO:7)

粗体字母表示褐孢长毛盘菌酶编码序列。限制位点是加下划线的。限制位点左方的序列与pDau109(WO 2005/042735)的插入位点是同源的。

使用Extensor HIFI PCR混合物，2倍浓度(赛默科技公司(Thermo Scientific)目录号AB-0795)用于实验。

根据制造商说明(赛默科技公司(Thermo Scientific)目录号AB-0795)用以下终浓度进行扩增反应(25μl)：

PCR混合物：

0.5μM引物F-80470

0.5μM引物R-80470

12.5μl Extensor HIFI PCR混合物，2倍浓度

11.0μl H2O

10ng褐孢长毛盘菌CBS804.70基因组DNA。

将PCR反应在编程为如下的双块热循环仪(Dual-Block Thermal Cycler)(伯乐公司(Biorad)，美国)中孵育：在94℃进行30秒的1个循环；30个循环，各在94℃进行30秒钟，在52℃进行30秒钟，在68℃进行60秒钟，然后是在68℃进行6分钟的1个循环。在移出并且进一步加工之前将样品冷却至10℃。

使用40mM Tris碱、20mM乙酸钠、1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液，通过1％琼脂糖凝胶电泳分析3μl的PCR反应。观察到约946bp的主条带。根据制造商的说明，直接用ILLUSTRA^TMGFX^TM PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare,皮斯卡塔韦(Piscataway),新泽西州,美国)纯化剩余的PCR反应。

将2μg的质粒pDau109用Bam HI和Hind III进行消化，并且在1％琼脂糖凝胶上使用50mM Tris碱-50mM硼酸-1mM EDTA二钠(TBE)缓冲液运行该消化的质粒，以从该限制质粒去除填充物片段。通过添加安全DNA凝胶染液(Safe DNA gel stain)(Life Technologies Corporation，格兰德岛(Grand Island)，新泽西州，美国)并且使用470nm波长透照仪将条带可视化。将对应于该限制质粒的条带切下，并且使用ILLUSTRA^TM GFX^TM PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒进行纯化。将该质粒洗脱到10mM Tris pH 8.0中，并将其浓度调节至20ng/μl。使用IN-PCR克隆试剂盒(克罗泰克实验室有限公司(Clontech Laboratories,Inc.)，山景城(Mountain View)，加利福尼亚州，美国)以将该983bp PCR片段克隆到用Bam HI和Hind III(20ng)消化的pDau109中。该总反应体积是10μl。该总反应体积是10μl。根据制造商的方案，将该反应物转化进FUSION-BLUE^TM大肠杆菌细胞(克罗泰克实验室有限公司，山景城，加利福尼亚州，美国)中，并且将其铺板在补充有50μg的氨比西林/ml的LB琼脂板上。在37℃孵育过夜之后，观察到转化菌落在这些补充有50μg氨比西林/ml的LB板上在选择下生长。

选择若干菌落用于通过菌落PCR使用以下所述的pDau109载体引物进行分析。用黄色的接种针(能肯公司(Nunc)A/S，丹麦)从该补充有50μg的氨比西林/ml的LB板上将四个菌落转移到补充有50μg的氨比西林/ml的新的LB板上，并在37℃孵育过夜。

引物8653：5’-GCAAGGGATGCCATGCTTGG-3’(SEQ ID NO:8)

引物8654：5’-CATATAACCAATTGCCCTC-3’(SEQ ID NO:9)

将这三个菌落中的每个直接转移到200μl PCR管中，该PCR管中由5μl的2X Extensor HIFI PCR混合物(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州，美国)、0.5μl的引物8653(10pm/μl)、0.5μl的引物8654(10pm/μl)、以及4μl的去离子水构成。每个菌落PCR在编程为如下的双块热循环仪(Dual-Block Thermal Cycler)中孵育：在94℃进行60秒的1个循环；30个循环，各在95℃进行30秒钟、在60℃进行45秒钟、在72℃进行60秒钟，在68℃进行10分钟，和在10℃进行10分钟。

将3μl的每个完成的PCR反应提交到使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳。所有四个大肠杆菌转化体都显示约980bp的PCR条带。使用QIAprep质粒小提试剂盒(Spin Miniprep Kit)(凯杰公司，希尔登，德国)从这四个菌落的每个中分离质粒DNA。使用Applied Biosystems模型3730自动DNA测序仪使用3.1版BIG-DYE^TM终止子化学(应用生物系统公司(Applied Biosystems，Inc.)，福斯特市(Foster City)，加利福尼亚州，美国)，将所得质粒DNA用引物8653和8654(SEQ ID NO:8和9)进行测序。选择一种质粒，指定为pKKSC0312-2，用于转化米曲霉MT3568。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO 2002/40694)，其中通过钝化米曲霉amdS基因来修复pyrG营养缺陷型。根据欧洲专利EP 0238023，第14-15页中所描述的方法制备米曲霉MT3568原生质体。

根据制造商的说明(Genomed)，使包含pKKSC0312-2的大肠杆菌3701生长过夜，并且根据制造商的说明使用质粒Midi试剂盒(Genomed JETquick试剂盒，目录号400250，Genomed有限公司，德国)分离pKKSC0312-2的质粒DNA。将纯化的质粒DNA转化入米曲霉MT3568中。根据克Christensen等，1988，Bio/Technology 6:1419-1422的方法制备米曲霉MT3568原生质体。选择板由以下组成：COVE蔗糖与+10mM乙酰胺+15mM CsCl+X-100(50μl/500ml)。在37℃孵育平板。简言之，将代表3μg的DNA的8μl的质粒DNA添加到100μl的MT3568原生质体中。添加250μl的60％PEG溶液，并且将这些管轻轻地混合，并且在37℃孵育30分钟。将混合物添加到10ml的预融化的Cove顶层琼脂糖中(该顶层琼脂糖融化并且然后在被添加到原生质体混合物之前在热水浴中温度平衡至40℃)。然后将合并的混合物涂布于具有10mM乙酰胺的两个Cove-蔗糖选择培养板上。将这些板在37℃孵育4天。通过在使用作为碳源的选择乙酰胺的平板上生长来鉴定单个曲霉属转化菌落。将四种米曲霉转化体中的每个接种入96深孔板中补充有2％葡萄糖的750μl的YP培养基和补充有2％麦芽糊精的750μl的YP培养基和补充有DAP4C的750μl的YP培养基中，并在37℃静止孵育4天。同时，将四种转化体再划线于COVE-2蔗糖琼脂培养基上。

然后根据制造商推荐，使用10％Bis-Tris SDS凝胶(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)通过SDS-PAGE，针对GH24多肽的产生，对来自米曲霉转化体的培养液进行分析。对于这些米曲霉转化体中每个，在大约27kDa观察到一个蛋白质条带。将一个米曲霉转化体在26℃在包含100ml的DAP4C培养基的1000ml锥形摇瓶中在85rpm搅拌下培养4天。

实例3：来自褐孢长毛盘菌的GH24溶菌酶的纯化

通过具有0.22μm截留的Fast PES Bottle top过滤器过滤具有来自实例3的具有GH24溶菌酶的发酵上清液。将所得溶液用5mM乙酸钠pH4.5渗滤，并在具有10kDa截留膜的Ultra过滤单元(赛多利斯公司(Sartorius))上浓缩(体积减少10倍)。

在预处理后，通过在XK26柱中SP琼脂糖(SP Sepharose，大约60mL)上的色谱法纯化约275mL包含该溶菌酶的溶液，使用0至100％梯度的缓冲液A(50mM乙酸钠pH 4.5)和缓冲液B(50mM乙酸钠+1M NaCl pH 4.5)经10个柱体积洗脱结合的溶菌酶。基于色谱图(在280nm和254nm处的吸收)和SDS-PAGE分析将来自该柱的部分进行合并。

如从SDS-PAGE中估算的分子量大约为27kDa并且纯度>90％。

实例4：来自褐孢长毛盘菌的GH24溶菌酶的其他特征

确定N-端序列为：YPVKTDL。

来自该成熟序列的计算的分子量是26205.5Da(M+H)⁺。

通过完整分子量分析确定的分子量是26205.3Da。(M+H)⁺。

成熟序列(来自埃德曼N末端测序数据、完整分子量分析和蛋白组学分析)：

YPVKTDLHCRSSPSTSASIVRTYSSGTEVQIQCQTTGTSVQGSNVWDKTQHGCYVADYYVKTGHSGIFTTKCGSSSGGGSCKPPPINAATVALIKEFEGFVPKPAPDPIGLPTVGYGHLCKTKGCKEVPYSFPLTQETATKLLQSDIKTFTSCVSNYVKDSVKLNDNQYGALASWAFNVGCGNVQTSSLIKRLNAGENPNTVAAQELPKWKYAGGKVMPGLVRRRNAEVALFKKPSSVQAHPPKC(SEQ ID NO:4)。

实例5：溶菌酶活性的确定

通过在分光光度计中测量被测的重悬溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)ATTC号4698(Sigma-Aldrich M3770)或不死微小杆菌(Exiguobacterium undea)(DSM14481)的溶液在540nm的吸光度/光密度的减少(下降)测定溶菌酶的活性。

溶壁微球菌底物的制备

在使用前，将这些细胞重悬在柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中，至0.5mg细胞/mL的浓度并且在540nm下测量光密度(OD)。然后调节细胞悬液，这样使得细胞浓度等同于OD540＝1.0。然后在使用之前将调节的细胞悬液冷冻存储。在4小时内使用重悬的细胞。

不死微小杆菌底物的干燥细胞的制备

使不死微小杆菌(DSM14481)的培养物在500mL摇瓶中，在30℃、250rpm下，在100mL LB培养基(Fluka 51208，25g/L)中生长过夜。然后将过夜的培养物在20℃和5000g下离心10分钟，并且然后将沉淀用无菌的milliQ水洗涤两次，并且将其重悬于Milli-Q水中。将洗涤的细胞在13000rpm下离心1分钟并且倾析尽可能的上清液。将洗涤的细胞在真空离心机中干燥1小时。将细胞沉淀重悬于柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 4、5或6)中，这样使得在540nm处的光密度(OD)＝1。

在浊度测定中测量溶菌酶抗微生物活性

将待测的溶菌酶样品稀释于柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 4、5或6)中，至浓度为100-200mg酶蛋白/L，并且将其保持在冰上直到使用。在一个96孔微量滴定板(Nunc)中，向每个孔中添加200μL的底物，并且将该板在VERSAmax酶标仪(分子设备公司(Molecular Devices))中在37℃下孵育5分钟。孵育后，在540nm处测量每个孔的吸光度(起始值)。为了开始测量活性，向每个底物(200μL)中添加20μL的稀释的溶菌酶样品并且在37℃，在540nm处开始吸光度的动力学测量，持续最少30分钟长达24小时。监测每个孔在540nm处的测量的吸光度并且如果该溶菌酶具有溶菌酶活性，那么看到吸光度随着时间下降。结果呈现于下表1中。

表1：如通过光密度下降所测量的针对溶壁微球菌和不死微小杆菌的溶菌酶活性

^1-意指没有影响；+意指小的效应；++意指中等效应；+++意指大的效应。括号内的pH值列出了基于溶菌酶-底物组合的测定pH。

数据证实来自原鸡的GH22溶菌酶、来自褐孢长毛盘菌的GH24溶菌酶和来自嗜碱枝顶孢的GH25溶菌酶都具有溶菌酶活性。

实例6小鼠中的体内试验—结肠炎小鼠模型中的免疫调节特性

动物和圈舍

将雌性BalbC小鼠(抵达时6周龄，Charles Rivers UK Limited公司)在抵达时基于体重随机饲养在3只一笼的笼中，伴随12小时光暗循环。

在开始实验程序之前，允许14天的适应期。

饲养和处理

小鼠可随意获得标准食物(维持RM1P饮食，特殊饮食服务公司(Special Diet Services)，英国)。可随意从瓶中获得水。

将小鼠分成12个组。根据表2，通过口服强饲法(<20mL/Kg)每天一次用测试化合物或媒介物处理动物。第一次施用是在葡聚糖硫酸钠(DSS)处理前2天，并持续到研究终止前一天(总共7天的处理)。

表2：研究设计

用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎

为了诱导结肠炎，将葡聚糖硫酸钠(DSS)加入饮用水(3％w/v)中。DSS施用后5天，将动物拣选并进行终点分析，如下文详述的。在第0天给予测试化合物后立即将DSS加入饮用水中。

实验参数和分析

每天进行仔细的临床检查，包括观察以下方面的变化：皮肤、皮毛、眼睛、粘膜，分泌物和排泄物(例如腹泻)的发生和自主活动(例如流泪、流涎、竖毛、瞳孔大小、异常呼吸模式)。还注意步态、姿势和对处理的反应的变化，以及奇怪行为、震颤、抽搐、睡眠和昏迷的存在。此外每天记录每只动物的体重。

在第-3天(在第一次用测试化合物处理之前)和第0天(刚好在DSS加入饮用水之前)从所有小鼠进行粪便取样。通过个体小鼠的自然排便新鲜收集样品。将这些收集在无菌/无DNA酶的艾本德(Eppendorf)管中并在-80℃储存。

在将DSS加入饮用水中后5天，将动物安乐死并进行下述终点程序。

提取结肠，洗涤并打开。使用光学显微镜宏观地进行结肠的炎症分级，并且基于Wallace评分方法由2名盲测观察者进行实验。结肠损伤评分的标准是：

0-无损伤。

1-充血。无溃疡。

2-充血和肠壁增厚。无溃疡。

3-一处溃疡，无肠壁增厚。

4-两个或更多个位置处的溃疡或炎症。

5-两个或更多个主要位置处的溃疡和炎症，或沿着结肠长度延伸>1cm的一个位置处的溃疡/炎症。

6-10-如果沿着结肠长度的损伤覆盖>2cm，则每增加一厘米，分数增加1。

在拣选时去除盲肠和结肠的内容物，在分开的管中快速冷冻并储存在-80℃直至运输。

在Wallace评分后去除结肠的近端一半并称重。将每个样品置于艾本德管中并快速冷冻，然后储存在-80℃直至用于细胞因子分析。

将近端结肠的一部分置于含有裂解溶液(蛋白酶抑制剂和组织蛋白提取试剂，比率为1g结肠组织对5mL裂解溶液)的裂解管中。将组织以6800rpm达30秒匀浆化3次。然后将匀浆化的样品离心(1000rpm，4℃，5分钟)以提取蛋白质，并将所得上清液等分用于细胞因子分析。

评估来自匀浆化结肠部分的上清液的细胞因子水平，其使用针对一系列Th1和Th17特异性细胞因子(IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17a、IL-25)，使用Magpix系统(Luminex)的多重测定(Merck Millipore)。

结果：

与暴露于正常饮用水的对照动物相比时，用饮用水中DSS(3％w/v)处理5天在小鼠结肠中引起炎症效应，如由平均Wallace评分的增加所指示的(图1A)。

用SEQ ID NO:1处理剂量依赖性地抑制DSS诱导的炎症效应。在用SEQ ID NO:5处理后，观察到对Wallace评分的类似影响。SEQ ID NO:15也抑制DSS诱导的炎症，尽管不如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5(图1A)有效。

结肠长度是损伤严重性的指标，因为结肠炎增加水肿并缩短整个结肠的长度。在目前的研究中，所有组中的结肠长度是可比较的，因此证实其仅是由DSS诱导的轻度炎症(图1B)。

由于炎症，与暴露于正常饮用水的对照动物相比时，暴露于DSS(3％w/v)和用媒介物缓冲液处理的动物中的结肠重量增加。然而，在DSS暴露的动物中用SEQ ID NO:1处理导致在疾病对照组中看到的增加的结肠湿重有剂量依赖性的降低。在用SEQ ID NO:5处理后也观察到降低结肠重量的剂量依赖性趋势，然而其不像SEQ ID NO:1那么突出，表明与SEQ ID NO:5相比SEQ ID NO:1具有更好的性能。用SEQ ID NO:15处理未影响DSS诱导的增加的结肠湿重(图1C)。

从第-3天(当时开始用对照或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:5进行预防性治疗)开始监测小鼠的重量。组之间的体重增加(第-3天-第0天)是可比的(图2和3)，在此期间所有组的体重持续增加，如对这个年龄的小鼠所预期的那样。从开始DSS激发的第0天开始，到第4天时，在其饮用水中接受DSS的所有动物组的体重中有大约2或3g体重的明显轻度下降(图2和3)。在用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:5处理后，可以看到对该结肠炎有关的体重减轻的剂量依赖性抑制(图3)，其中在测试的最高剂量处SEQ ID NO:1在所有序列中最有效(图5)。

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是多功能促炎细胞因子，其由多种细胞包括单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞和T-淋巴细胞分泌。

如预期的，与健康对照动物相比，疾病对照组在其结肠中表达高水平的促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17a和IL-25)。此外，在DSS激发后诱导了促炎细胞因子IL-12以及调节细胞因子IL-10，尽管程度更低(图4)。

用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:5处理以剂量依赖性的方式降低了DSS诱导的细胞因子水平。与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5相比，SEQ ID NO:15对结肠中的细胞因子水平仅具有小的影响。令人惊讶的是，SEQ ID NO:1在降低细胞因子水平方面总体上最有效。特别是对于炎症的关键驱动因子TNF-α、IL-1b和IL-6而言(图4)。

当考虑到蛋白质的不同大小时，甚至更加清楚地看到SEQ ID NO:1相比于SEQ ID NO:5的优越性，因此SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:5具有分别为23.0、24.0和14.3kDa的分子大小。在图5中，结肠中的细胞因子水平显示为测试化合物的摩尔数/小鼠/天的函数。可以清楚地看出，SEQ ID NO:1总体上比SEQ ID NO:5更有效地降低细胞因子水平。

在目前的研究中，给予小鼠的每种测试化合物的浓度相似(mg/小鼠/天)，但是由于不同的分子大小，这意味着与SEQ ID NO:5相比，使用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:15给药的分子少约40％，令人惊讶的是尽管如此，SEQ ID NO:1的免疫调节性能优于SEQ ID NO:5。

总之，DSS添加到饮用水中(3％w/v)5天在结肠中引起炎症效应，如预期的那样。这点在作为炎症指标的Wallace评分和结肠重量增加上都很明显。评估的Th1和Th17细胞因子也支持由DSS诱导的炎症效应。

用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:5处理(第-3天至第5天)在降低结肠中DSS诱导的炎症效应方面产生一致的抑制作用。通过促炎性细胞因子水平的降低和观察到的所得炎症(如Wallace评分指示的)均观察到这一点。SEQ ID NO:1是减少炎症和改善动物健康的最有效化合物，表明用SEQ ID NO:1治疗对预防人的结肠炎具有潜在的保护作用。

实例7小鼠中的体内试验—消化道微生物调节对饮食诱发的肥胖和葡萄糖耐受的功效

动物和圈舍

将抵达时6周龄的36只雄性C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室(Jackson Lab)，巴尔港(Bar Harbor)，缅因州，美国)根据它们入组时的体重随机分配到实验组，确保所有组中有相等的标准偏差和平均体重。在实验开始前，将小鼠每笼饲养3只，每组12只小鼠/4只笼，并在低脂肪参考饮食(LFD)下适应12天。

饲养和处理

随意给小鼠喂食团粒状的非染色饲料，每周随着饲料摄入测量改变三次。给小鼠喂食高脂肪—高蔗糖饮食(HFD，D12451，研究饮食)或低脂肪参考饮食(LFD，D12450H，研究饮食)。将饲料储存在4℃直至使用(根据制造商的说明)。

随意从瓶中获取无菌水并每周更换。

实验参数和分析

在上午10点通过100μL的每日口服强饲法(25G针头)施用测试化合物或媒介物(PBS pH 7.4，参考：10010-023，吉博科公司(Gibco))。将约5mg/mL的SEQ ID NO:1保存在-20度直至使用。

通过在实验方案的第0、4、8和12周的磁共振(MR)扫描(Minispec LF90，布鲁克(Bruker)，使用时每天校准)的三次测量的平均值来评估个体小鼠的身体组成。在每天强饲前，在光周期开始(8AM±1小时)时与MR扫描同时收集新鲜粪便。将样品立即在干冰上冷冻并储存在-80℃直至进一步处理。

在实验方案的第10周评估口服葡萄糖耐受测试以及葡萄糖刺激的胰岛素分泌和消化道通透性。小鼠在上午8点禁食5小时并在上午10点强饲。在用4μL/g瘦质量的50％右旋糖溶液和150μL磺酸溶液进行口服强饲之前，执行5小时禁食血糖测量(OneTouch Vario Flex，LifeScan公司)和来自尾静脉的血液取样。磺酸溶液由在150μL的0.5％羧甲基纤维素钠盐(CMC)(中等粘度，西格玛公司(Sigma))的蒸馏水悬浮液中溶解的1.5mg荧光素-5(6)-磺酸(英杰公司(Invitrogen))组成。在右旋糖激发后0、15、30、60、90和120分钟的时间点从尾静脉穿刺测量血糖，并且在激发后0、15、30、60和120分钟的时间点取得用于胰岛素和消化道通透性的血液样品于准备了EDTA的毛细管(Microvette CB300，Sarstedt公司)中。在该程序后小鼠接受0.5mL盐水(0.9％氯化钠，Hospira公司)，使小鼠补充水分。将血液样品在室温以1000rcf离心10分钟。对于胰岛素测量，将前5μL血浆转移至干冰上的96孔PCR板中并保持在-80℃直至下游处理。将用于消化道渗透性测试的下一个5μL血浆转移至黑色96孔光学按钮板(Nunc)，并保持在湿冰上直至添加150μL蒸馏水中的0.5％CMC并充分混合。在Synergy HT酶标仪(美国伯腾仪器有限公司(BioTek))上以激发/发射485/528nm波长读板。按照制造商的方案，通过小鼠超灵敏胰岛素ELISA(参考：80-INDMSU-E10，批号：06489，Alpco公司)测量胰岛素水平，并在EnSpire2300多标记读数器(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))上定量。

尸检在实验方案的第12周进行。小鼠从上午7.15±15分钟禁食并在上午10点强饲。安乐死是按照交替顺序完成的。用异氟烷(3％于65％N2、35％O2中，Fresenius Kabi公司)麻醉小鼠。在安乐死前5分钟，通过2μL/g体重胰岛素(Humulin 100mU/mL稀释至1,9mU/μL，Lilly公司)静脉内注射每个装有3只小鼠的笼中的第一只和最后一只小鼠。三只中的一只(第二只小鼠)注射2μL/g体重的盐水(0.9％氯化钠，Hospira公司)。使用涂有EDTA的25G针头和1mL注射器进行心脏穿刺。将血液转移至含有1μL的DPP IV抑制剂(密理博公司(Millipore))和1μL的蛋白酶抑制剂混合物(P8340，西格玛公司(Sigma))的艾本德管中。将样品以1000rcf离心10分钟，将血浆等分一式三份，置于干冰上并转移至-80℃储存直至进一步处理。

组织采集：测量肝脏、胰腺、eWAT、iWAT、rpWAT、iBAT、心脏、四头肌、腓肠肌、脑和结肠的重量，并立即将组织在液氮中冷冻并储存在-80℃。由同一个操作者解剖组织，并以相同的顺序对所有小鼠取组织。死后将脑在液氮中冷冻<60秒。测量小肠(从胃到盲肠)和结肠(从盲肠到直肠)的长度并在整个处理时间保持在通过下方的湿冰降温的Plexiglas板上。十二指肠被认为是小肠的前5cm，剩余的小肠组织被分成相等长度的3部分。丢弃前3cm，将小肠近端2/3的剩余部分分类为空肠。将小肠的远端1/3的前3cm丢弃，将剩余的组织分类为回肠。在清空肠组织之前，将十二指肠、空肠、回肠和结肠的最近端的cm保存于Carnoy溶液中用于组织学(以保持粘膜层完整性)，该溶液由60％甲醇、30％氯仿和10％冰醋酸组成。通过机械压力分离小肠、盲肠和结肠的内容物，在干冰上冷冻，随后在-80℃储存。将来自十二指肠、空肠、回肠、结肠和盲肠的组织在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。将用于组织学的来自肝脏、eWAT、iWAT和iBAT的代谢组织在4％多聚甲醛溶液中保存72小时，然后在70％乙醇中保存。将肝脏组织另外保存在Tissue-Tek O.C.T化合物(Sakura Finetek公司)中以实现组织学油红O脂质染色。

结果

HFD喂养从第2周和贯穿整个实验期间诱导了严重的饮食诱发的肥胖。用SEQ ID NO:1处理不能防止体重增加(图1A)。然而，当通过磁共振扫描分析身体组成时，用SEQ ID NO:1处理的小鼠在第12周似乎具有减少的脂肪量，但在任何的前几周均没有(图1B)，表明SEQ ID NO:1处理可能改善饮食诱发的肥胖小鼠中的脂肪增加(图1C)，而不影响体重发展(图1A)。

受损的葡萄糖调节与一系列生活方式介导的疾病紧密相关。我们因此测试了用SEQ ID NO:1处理是否能独立于饮食诱发的肥胖去改善HFD诱导的葡萄糖调节异常。增加的空腹胰岛素(高胰岛素血症)和空腹血糖(高血糖症)是胰岛素抗性的生物学标志，并且与喂食HFD的对照小鼠相比，在用SEQ ID NO:1处理的小鼠中两个参数均得到改善(图2A-B)。通过葡萄糖耐受测试强化了增强的葡萄糖调节，其中用SEQ ID NO:1处理的小鼠比喂食HFD的对照小鼠更有效地清除葡萄糖激发(图2C)。β细胞的增加的胰岛素分泌能力不能解释改善的葡萄糖耐受(图2D)，因此表明在用SEQ ID NO:1处理的小鼠的代谢组织中胰岛素敏感性得到改善。结合起来，这些数据指示SEQ ID NO:1预防肥胖相关的胰岛素抗性；这是2型糖尿病和心血管疾病的共同特征。

HFD诱导的代谢性炎症最经常由消化道屏障功能降低(消化道渗漏)导致，其允许细菌细胞壁组分脂多糖(LPS)的循环水平增加。为了测试消化道屏障功能，我们用150μl的0.5％羧甲基纤维素钠盐(CMC)、1％荧光素-5(6)-磺酸溶液口服激发小鼠，并测量激发后0、15、30、60和120分钟时从尾静脉取的血浆样品中的荧光。用SEQ ID NO:1处理的小鼠表现出增加的屏障功能，表明SEQ ID NO:1减轻HFD诱导的代谢炎症。

实例8用于确定针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性的方法(A)。

PGN提取：

约氏乳杆菌的培养：

材料

MRS培养液，产品号BD 288130，pH 6.3-6.7。

MRS琼脂平板，BD 288130；琼脂Oxoid LP0011；pH 6.3-6.7。

0.9％NaCl，默克公司(Merck)106404，Cas号7647145

罐，供应商默克公司(Merck)116387，Anaerocult厌氧罐2.5L

Anaerogen 2,5L，赛默飞科学公司(ThermoScientific)，目录号AN0025A

约氏乳杆菌，DSM10533

程序

将约氏乳杆菌从冷冻原液划线至MRS琼脂平板并在厌氧条件下孵育2天，厌氧罐具有Anaerogen 2.5L，30℃。将一些菌落接种到500ml蓝色盖帽瓶中的500ml MRS培养液中，并置于具有Anaerogen 2.5L的厌氧罐中，在30℃72小时。

将培养物离心(6000rpm，10分钟)，倒出上清液，然后进行另一轮离心。将沉淀物在100ml 0.9％NaCl中洗涤，并且将悬浮液充分混合并以6000rpm离心10分钟。倒出上清液，并且重复在0.9％NaCl中的洗涤程序至总共三次洗涤。向沉淀中添加大约40ml 0.9％NaCl，并且将溶液转移至50ml falcon管中。将溶液以6000rpm离心10分钟，并且倒出上清液。将沉淀物储存在-18℃直至进行肽聚糖的提取。

提取程序：

材料

来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的蛋白酶，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)P5147，CAS 9036-06-0

PBS pH 7.3：

·NaCl：8g，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)31434，CAS 7647-14-5

·KCl：0.2g，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)P9333，CAS 7447-40-7

·KH2PO4：0.24g，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)P5655，CAS 7778-77-0

·Na2HPO4.2H2O:1.44g，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)30412，CAS 10028-24-7

·添加Milli-Q水至1000mL

1％Triton-X 100溶液：

·1mL Triton X100，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)X100，CAS 9002-93-1

·添加Milli Q水至100mL

500mM碳酸钠缓冲液，pH 9.3：

·500mM碳酸钠由在500mL MQ水中的21g Na2CO3(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)S7795，CAS 497-19-8)制成500mM碳酸氢钠由在500mL MW水中的72g NaHCO3(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)S6014，CAS 144-55-8)制成

·pH 9.3缓冲液由320mL NaHCO3和80mL Na2CO3制成，并且用HCl调节pH值

含10mM Tris HCl pH 8.0，1mM EDTA，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)P4557，CAS 108-95-2的苯酚溶液

丙酮，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)32201-M，CAS 67-64-1

乙醇，96％，CCS医疗保健(CCS Healthcare)1680643，CAS 64-17-5

程序

约氏乳杆菌细胞材料被冷冻干燥。将冷冻干燥的材料(525mg)悬浮在50mL Falcon管中的PBS(40mL)中。将该悬浮液在室温下在热振荡器中以700rpm摇动2小时。然后添加灰色链霉菌(Streptomyces griseus)蛋白酶(55mg)，并且将悬浮液在37℃在热振荡器中富有6小时。然后在室温下将其在1900g下离心20分钟，并且倾析出上清液。将沉淀重悬于1％Triton X-100(40mL)中并在37℃摇动过夜。在另一次离心和倾析后，将沉淀重悬于PBS(40mL)中并再次添加蛋白酶(55mg)。将悬浮液再次在37℃孵育6小时，离心并倾析。将沉淀重悬于PBS(40mL)中并在37℃摇动过夜。用PBS(40mL，30分钟搅拌)重复该洗涤程序一次，然后用50％乙醇/水(40mL，30分钟搅拌)重复该洗涤程序一次。然后将沉淀物分到两个Falcon管中。向每个管中添加预热至40℃的苯酚溶液(15mL)。将悬浮液在40℃摇动10分钟，并且然后添加96％乙醇(每管25mL)，离心并倾析。在冷冻干燥之前，用丙酮(每管40mL)和96％乙醇(每管40mL)进一步洗涤沉淀。将来自两个管的沉淀合并，得到80mg纯化的肽聚糖，为白色粉末。

还原端测定

取决于可用的储备溶液的强度，将溶菌酶在聚丙烯管中在磷酸盐稀释缓冲液(5mM柠檬酸盐，5mM K2HPO4，0.01％TritonX-100，pH 5.0)中稀释至50μg/mL。通过在磷酸盐稀释缓冲液(5mM柠檬酸盐，5mM K2HPO4，0.01％TritonX-100，pH 5.0)中制备2倍稀释系列降至浓度为6.3μg/mL，将稀释的溶菌酶在96孔聚丙烯微量滴定板中进一步稀释。制备在MillQ中的约氏乳杆菌底物的50mg/ml原液并在磷酸盐缓冲液(50mM柠檬酸盐，50mM K2HPO4，pH 5.0)中稀释至250μg/ml。在聚丙烯深孔板中，将50μL溶菌酶稀释液与450μL约氏乳杆菌溶液混合并在40℃在振荡(500rpm)下孵育45分钟。孵育后，将深孔板离心(3200rpm，7分钟)以沉淀不溶物质，并将100μL上清液与50μL 3.2M HCl在96孔PCR板中混合，并在95℃孵育80分钟。向PCR板的每个孔中添加50μL的3.5M NaOH，并将150μL的每种样品转移到新PCR板，该新PCR板含有在酒石酸钾钠/NaOH缓冲液(50g/L酒石酸K-Na+20g/L NaOH)中的75μL/孔的4-羟基苯甲酰肼(PAHBAH)溶液。将板在95℃孵育10分钟，然后将100μL/样品转移至透明平底微量滴定板，用于405nm处的光密度(OD)测量。三次稀释的样品(在Milli-Q水中在100μL中稀释的50μL样品)进行OD测量。OD测量值表示减去原始(背景)读数后的差值，并表示两个OD测量值的平均值。

结果示于表3中。

表3：还原端测定中的平均OD405测量值(背景校正)

ND:由于酶储备溶液的低浓度未确定

结果显示，溶菌酶SEQ ID NO:1、18、21、24、27和30针对见于约氏乳杆菌细胞壁中的肽聚糖具有优异的溶菌酶活性，而使用SEQ ID NO:5的溶菌酶未显示针对该肽聚糖的溶菌酶活性。

实例9用于确定针对约氏乳杆菌的溶菌酶活性的方法(B)。

PGN提取：

约氏乳杆菌的培养：

材料

MRS培养液，产品号BD 288130，pH 6.3-6.7。

MRS琼脂平板，BD 288130；琼脂Oxoid LP0011；pH 6.3-6.7。

0.9％NaCl，默克公司(Merck)106404，Cas号7647145

罐，供应商默克公司(Merck)116387，Anaerocult厌氧罐2.5L

Anaerogen 2,5L，赛默飞科学公司(ThermoScientific)，目录号AN0025A

约氏乳杆菌，DSM10533

程序

将约氏乳杆菌从冷冻原液划线至MRS琼脂平板并在厌氧条件下孵育2天，厌氧罐具有Anaerogen 2.5L，30℃。将一些菌落接种到500mL蓝色盖帽瓶中的500mL MRS培养液中，并置于具有Anaerogen 2.5L的厌氧罐中，在30℃持续72小时。

将培养物离心(6000rpm，10分钟)，倒出上清液，然后进行另一轮离心。将沉淀物在100mL 0.9％NaCl中洗涤，并且将悬浮液充分混合并以6000rpm离心10分钟。倒出上清液，并且重复在0.9％NaCl中的洗涤程序至总共三次洗涤。向沉淀中添加大约40mL 0.9％NaCl，并且将溶液转移至50mL falcon管中。将溶液以6000rpm离心10分钟，并且倒出上清液。将沉淀物储存在-18℃直至进行肽聚糖的提取。

提取程序：

材料

来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的蛋白酶，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)P5147，CAS 9036-06-0

PBS pH 7.3：

·NaCl：8g，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)31434，CAS 7647-14-5

·KCl：0.2g，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)P9333，CAS 7447-40-7

·KH2PO4：0.24g，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)P5655，CAS 7778-77-0

·Na2HPO4.2H2O:1.44g，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)30412，CAS 10028-24-7

·添加Milli-Q水至1000mL

1％Triton-X 100溶液：

·1mL Triton X100，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)X100，CAS 9002-93-1

·添加Milli Q水至100mL

500mM碳酸钠缓冲液，pH 9.3：

·500mM碳酸钠由在500mL MQ水中的21g Na2CO3(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)S7795，CAS 497-19-8)制成

·500mM碳酸氢钠由在500mL MW水中的72g NaHCO3(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)S6014，CAS 144-55-8)制成

·pH 9.3缓冲液由320mL NaHCO3和80mL Na2CO3制成，并且用HCl调节pH值

含10mM Tris HCl pH 8.0，1mM EDTA，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)P4557，CAS 108-95-2的苯酚溶液

丙酮，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)32201-M，CAS 67-64-1

乙醇，96％，CCS医疗保健(CCS Healthcare)1680643，CAS 64-17-5

程序

还原端测定

将溶菌酶在磷酸盐稀释缓冲液(5mM柠檬酸盐，5mM K2HPO4,0.01％TritonX-100，pH 5.0)中在聚丙烯管中稀释至200μg/mL。通过在磷酸盐稀释缓冲液(5mM柠檬酸盐，5mM K2HPO4，0.01％TritonX-100，pH 5.0)中制备2倍稀释系列降至浓度为6.3μg/mL，将稀释的溶菌酶在96孔聚丙烯微量滴定板中进一步稀释。制备在MillQ中的约氏乳杆菌底物的50mg/ml原液并在磷酸盐缓冲液(50mM柠檬酸盐，50mM K2HPO4，pH 5.0)中稀释至250μg/ml。在聚丙烯深孔板中，将50μL溶菌酶稀释液与450μL约氏乳杆菌溶液混合并在40℃在振荡(500rpm)下孵育45分钟。孵育后，将深孔板离心(3200rpm，7分钟)以沉淀不溶物质，并将100μL上清液与50μL 3.2M HCl在96孔PCR板中混合，并在95℃孵育80分钟。向PCR板的每个孔中添加50μL的3.5M NaOH，并将150μL的每种样品转移到新PCR板，该新PCR板含有在酒石酸钾钠/NaOH缓冲液(50g/L酒石酸K-Na+20g/L NaOH)中的75μL/孔的4-羟基苯甲酰肼(PAHBAH)溶液。将板在95℃孵育10分钟，然后将100μL/样品转移至透明平底微量滴定板，用于405nm处的光密度(OD)测量。对三次稀释的样品(在Milli-Q水中在100μL中稀释的50μL样品)进行OD测量。OD测量值表示减去原始(背景)读数后的差值，并表示两个OD测量值的平均值。

结果示于表4中。

表4：还原端测定中的平均OD405测量值(背景校正)

结果显示，两种溶菌酶(SEQ ID NO:1和15)针对见于约氏乳杆菌细胞壁中的肽聚糖具有优异的溶菌酶活性，而使用SEQ ID NO:5的溶菌酶未显示针对该肽聚糖的溶菌酶活性。

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技术研发人员：S.卡杰鲁夫;M.T.科恩;N.N.克里斯滕森
技术所有人：诺维信公司
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