用于预防或治疗炎性肠病的包含青黛提取物或其级分作为有效成分的药物组合物的制作方法

本发明涉及用于预防或治疗炎性肠病的组合物，其包含青黛(Indigo Pulverata Levis)提取物或其级分作为有效成分。

背景

炎性肠病(IBD)是由小肠和大肠中的免疫系统失调引起的慢性复发性炎性疾病的常见名称。在以克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)为代表的炎性肠病的情况下，已知免疫反应的失调可能是这样的疾病的关键原因(Braus等人，Clin Immunol，2009，132，1-9；McGuckin等人，Inflamm Bowel Dis，2008,15,100-113)。

炎性肠病曾被认为是亚洲地区的一种罕见疾病。然而，随着最近生活习惯的西化，患有炎性肠病的患者的数量自1980年代以来在东方趋于迅速增加。因此，一直在积极研究缓解炎性肠病。最近，发现一些细胞因子或细胞与炎性肠病相关，因此致使开发了许多生物制剂，用于选择性地攻击与肠炎相关的某些分子或路径(Sandborn等人，Gastroenterology，2002,122:521-530)。

现在，作为炎性肠病的治疗剂，已使用用于阻断前列腺素类(例如柳氮磺胺吡啶等)的产生的基于5-氨基水杨酸(5-ASA)的药物，或者使用类固醇免疫抑制药物。

然而，柳氮磺胺吡啶可能引起副作用，如腹胀、头痛、皮疹、肝病、白细胞减少、粒细胞缺乏、男性不育等。此外，由于如引起的感染性疾病、继发性肾上腺皮质功能不全症、消化性溃疡、糖尿病、精神障碍等的副作用，类固醇免疫抑制药物的局限性在于这样的药物可能无法改善长期预后和应仅用于急性情况。因此，仍然需要开发用于炎性肠病而没有副作用的治疗剂。

同时，青黛是指通过发酵蓼蓝或马蓝(其是在韩国、中国和日本自然生长的一年生草本植物，其植物高度为60-100厘米左右)的叶子获得的粉末。

从古时开始，在东方医学中已知青黛具有各种功效，诸如特别是解热和解毒、灭虫、血液净化和除疖等。然而，关于其通过临床缓解如抑制炎症因子、胶状便、血便、腹泻等症状对炎性肠病的作用效果等一无所知。

因此，作为努力从药用植物开发炎性肠病治疗剂的结果，本发明人确定青黛提取物或其级分表现出降低炎症评分的效果，并且该级分特别地显示出显著效果。此外，由于所述提取物或其级分在炎性肠病的体内模型中显著降低炎性肠病的疾病活动指数(DAI)，本发明人确定青黛提取物或其级分可有价值地用作治疗和预防炎性肠病的药物组合物的有效成分，从而完成本发明。

[现有技术文献]

[非专利文件]

(非专利文件1)Braus等人，Clin Immunol，2009,132,1-9

(非专利文件2)McGuckin等人，Inflamm Bowel Dis，2008,15,100-113

(非专利文件3)Sandborn等人，Gastroenterology，2002,122:521-530

发明详述

技术问题

本发明的目的是提供用于预防或治疗炎性肠病的药物组合物，其含有青黛提取物或其级分作为有效成分。

本发明的另一个目的是提供用于预防或缓解炎性肠病的保健功能食物，其含有青黛提取物或其级分作为有效成分。

本发明的另一个目的是提供预防或治疗炎性肠病的方法，其包括向有需要的个体给药含有青黛提取物或其级分作为有效成分的药物组合物的步骤。

另外，本发明的另一个目的是提供青黛提取物或其级分用于预防或治疗炎性肠病的预期用途。

此外，本发明的另一个目的是提供青黛提取物或其级分用于生产具有预防或治疗炎性肠病的效果的药物的用途。

技术方案

作为研究开发具有预防或治疗炎性肠病效果的天然产物药物的结果，本发明人确定青黛提取物或其级分表现出预防和治疗炎性肠病的优异效果，从而完成本发明。

在实现所述目的的一个方面，本发明提供用于预防或治疗炎性肠病的药物组合物，其含有青黛提取物或其级分作为有效成分。

在本发明中，术语“炎性肠病”统称为在肠道中引起炎症的疾病，特别是可以是由小肠和大肠中的免疫系统失调引起的慢性复发性炎性疾病。所述炎性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。

用于制备本发明提取物或其级分的青黛可以从商业产品中购买，或者可以直接制备和使用。

本发明的青黛提取物可包括所有蒸馏水或有机溶剂提取物，其体积是青黛的干重的1至30倍，特别地可以是有机溶剂提取物、粗提取物或其浓缩物。

所述有机溶剂可以是选自具有1至4个碳原子的低级醇、己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、氯仿和丙酮中的至少一种。所述具有1至4个碳原子的低级醇可以是选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇和正丁醇中的至少一种。具有1至4个碳原子的低级醇可包括所有无水或含水醇。所述醇，例如乙醇可以是1至100％(v/v％)，特别是30至100％，更特别是30至80％，且更加特别是30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的醇。

在本发明中，青黛提取物可以用水、具有1至4个碳原子的低级醇或其混合物作为溶剂提取，并且所述具有1至4个碳原子的低级醇可以是乙醇、甲醇或丁醇。根据本发明的一个实施方案方面，青黛提取物可以是用70％乙醇获得的提取物。

本发明的级分可以是有机溶剂级分，所述有机溶剂可以是选自己烷、氯仿、乙酸乙酯和丁醇中的至少一种。

在本发明中，青黛提取物的级分可以是己烷级分、氯仿级分、乙酸乙酯级分或丁醇级分，其顺序地通过浓缩青黛提取物，然后通过再次向其中添加有机溶剂，特别是己烷、氯仿、乙酸乙酯和丁醇获得。

根据本发明的一个实施方案方面，可以将青黛提取物的级分制备成青黛的乙醇提取物的己烷级分、其氯仿级分、其乙酸乙酯级分和其丁醇级分，其通过用乙醇对青黛进行提取得到其乙醇提取物；然后通过向所述乙醇提取物中加入水并用己烷分级所得混合物，以第一将己烷级分层和水层彼此分离；然后通过用氯仿分级所述水层，以第二将氯仿级分层和水层彼此分离；然后通过用乙酸乙酯分级所述水层，以第三将乙酸乙酯级分层和水层彼此分离；然后通过用丁醇分级所述水层，以最后从中分离丁醇级分层。

根据本发明的青黛提取物或其级分可以通过使用常规干燥方法，如低压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等制备成粉末状态，以从中除去剩余的低级醇和有机溶剂，使得这样的提取物或其级分可适合用作药物的原料。特别地，所述青黛提取物可以是浓缩液体或冻干粉末形式。根据本发明的一个实施方案方面，青黛提取物可以是软浸膏，其是浓缩液体形式。

在本发明的一个示例性实施方案中，作为向具有诱导的炎性肠病的动物模型给药青黛提取物或其级分的结果，确定其存在增加结肠长度、降低炎症活化标志物的活性和表达以及改善炎性肠病的疾病活动指数的效果，因此可以看出所述青黛提取物可有效治疗和预防炎性肠病。特别地，可以看出青黛提取物的乙酸乙酯级分表现出最优异的效果。

本发明的药物组合物可根据常规方法配制成口服给药的剂型，例如片剂、含片、锭剂、水溶性或油悬浮剂、制备的粉末或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂、糖浆剂、酏剂等，用于预防或治疗炎性肠病。

为配制成剂型，诸如片剂、胶囊剂等，可含有以下物质：粘合剂，如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉或甘薯淀粉；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠或聚乙二醇蜡。在胶囊剂型的情况下，除了上述材料之外，还可含有液体载体如脂肪油。

而且，本发明的药物组合物可肠胃外给药。肠胃外给药可以通过皮下注射、静脉注射、肌内注射或胸腔内注射方法进行。为了配制成用于肠胃外给药的剂型，可以通过在水中与稳定剂或缓冲剂混合将所述组合物制备成溶液，然后可以再次配制成用于安瓿或小瓶给药的单位形式。

根据本发明的药物组合物的剂量需要是药学有效量。“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理利益/风险比预防或治疗疾病的量，并且本领域技术人员可根据如配制方法、患者的病情、体重、性别和年龄、疾病程度、药物形式、给药途径和时间、排泄率、反应敏感性等的因素不同地选择有效剂量水平。如本领域技术人员所认识到的，有效量可根据治疗途径、赋形剂的使用和与其他药物一起使用的可能性而变化。

根据本发明的含有青黛提取物或其级分作为有效成分的药物组合物的剂量或剂可根据患者的年龄、身体状况、体重等变化，但通常可优选地在10至100mg/kg(体重)/天的范围内给药。并且这样给药可以每天进行一次，或者在每日有效投入的范围内每天分成几次。

另一方面，本发明提供用于预防或缓解炎性肠病的保健功能食物，其含有青黛提取物或其级分作为有效成分。

根据本发明的青黛提取物或其级分可以包含在食物中，因此可以在其摄入时有效地预防或缓解炎性肠病。

根据本发明的青黛提取物或其级分可以原样添加或者可以与其他食物或食物成分一起使用，并且可以根据常规方法适当地使用。

所述食物的种类没有特别限制。作为可以添加青黛提取物或其级分至其的食物的示例，包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、点心、甜食、比萨饼、方便面、其他面条、口香糖、乳制品，包括冰淇淋、各种类型的汤、饮料、茶、保健饮料、醇饮料、维生素复合物等，并且在常规意义上均包括所有保健功能食物。除了上述食物外，根据本发明的青黛提取物或其级分可含有各种营养补充剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。此外，根据本发明的青黛提取物或其级分可含有制备果汁饮料和蔬菜基饮料的天然果汁或果肉。可以单独使用或组合使用这样的成分。

另外，在另一方面，本发明提供预防或治疗炎性肠病的方法，其包括向有需要的个体给药含有青黛提取物或其级分作为有效成分的药物组合物的步骤。

如本文所用，术语“青黛”、“青黛提取物”、“级分”、“肠病”、“给药”等与上述相同。

在本发明中，所述个体是指动物，并且通常可以是哺乳动物，对其使用本发明的提取物的治疗可表现出有益效果。这样的个体的优选实例可包括像人类的灵长类。此外，这样的个体可包括具有炎性肠病症状或具有发生这样的症状的风险的所有个体。

此外，另一方面，本发明提供使用青黛提取物或其级分预防或治疗炎性肠病的预期用途。

此外，另一方面，本发明提供青黛提取物或其级分用于生产具有预防或治疗炎性肠病的效果的药物的用途。

有益效果

表现出降低炎症活化标志物的活性和表达以及缓解炎性肠病的疾病活动指数的效果，根据本发明的青黛提取物或其级分可有价值地用作预防和治疗炎性肠病的药物组合物的有效成分。

附图简述

图1是显示由于向具有吡罗昔康诱导的肠病的模型给药青黛提取物或其级分的结果的重量变化的图：

PXC是服用吡罗昔康的组；PXC+1是服用吡罗昔康+青黛的70％乙醇提取物的组；PXC+2是服用吡罗昔康+青黛的70％乙醇提取物的乙酸乙酯级分的组；以及PXC+3是服用吡罗昔康+青黛的70％乙醇提取物的丁醇级分的组：*表示与正常组有显著差异，而表示与具有诱导疾病的组有显著差异，下文中相同。

图2是显示由于向具有吡罗昔康诱导的肠病的模型给药青黛提取物或其级分的结果的结肠长度变化的图像。

图3是将由于向具有吡罗昔康诱导的肠病的模型给药青黛提取物或其级分的结果的结肠长度相互比较的图。

图4是显示由于向具有吡罗昔康诱导的肠病的模型给药青黛提取物或其级分的结果的肠组织中MPO表达的抑制的图。

图5是显示由于向具有吡罗昔康诱导的肠病的模型给药青黛提取物或其级分的结果的肠组织中IL-6表达的抑制的图。

图6是显示由于向具有吡罗昔康诱导的肠病的模型给药青黛提取物或其级分的结果的肠组织中IL-1b表达的抑制的图。

图7是显示由于向具有吡罗昔康诱导的肠病的模型给药青黛提取物或其级分的结果的肠组织中IL-17表达的抑制的图。

图8是显示由于向具有吡罗昔康诱导的肠病的模型给药青黛的70％乙醇提取物的乙酸乙酯级分的结果的肠病的疾病活动指数(DAI)降低的图。

图9是显示由于向具有吡罗昔康诱导的肠病的模型给药青黛的70％乙醇提取物的乙酸乙酯级分的结果的存活率增加的图。

基于对数秩(Mantel-Cox)检验的统计分析。

图10是用显微镜确定由于向具有吡罗昔康诱导的肠病的模型给药青黛的70％乙醇提取物的乙酸乙酯级分的结果的肠组织中病理细胞破坏减少的图像。

图11是显示由于向具有吡罗昔康诱导的肠病的模型给药青黛的70％乙醇提取物的乙酸乙酯级分的结果的肠组织中病理细胞破坏的评分的图。

图12是显示由于向具有葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠炎的模型给药青黛提取物或其级分的结果的重量变化的图：

DSS是服用葡聚糖硫酸钠的组；DSS+1是服用葡聚糖硫酸钠+青黛的70％乙醇提取物的组；DSS+2是服用葡聚糖硫酸钠+青黛的70％乙醇提取物的乙酸乙酯级分的组；以及DSS+3是服用葡聚糖硫酸钠+青黛的70％乙醇提取物的丁醇级分的组：*表示与正常组有显著差异，而表示与具有诱导疾病的组有显著差异，下文中相同。

图13是显示由于向具有葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠炎的模型给药青黛提取物或其级分的结果的肠炎的疾病活动指数(DAI)降低的图。

图14是显示由于向具有葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠炎的模型给药青黛提取物或其级分的结果的肠组织中IL-6表达的抑制的图。

图15是显示由于向具有葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠炎的模型给药青黛提取物或其级分的结果的肠组织中IL-1b表达的抑制的图。

图16是显示由于向具有葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠炎的模型给药青黛提取物或其级分的结果的肠组织中IL-17表达的抑制的图。

图17是显示由于向具有葡聚糖硫酸钠诱导的肠炎的模型给药青黛的70％乙醇提取物的乙酸乙酯级分的结果的结肠长度增加的图像。

图18是显示由于向具有葡聚糖硫酸钠诱导的肠炎的模型给药青黛的70％乙醇提取物的乙酸乙酯级分的结果的结肠长度增加的图。

图19是显示由于向具有葡聚糖硫酸钠诱导的肠炎的模型给药青黛提取物的结果的结肠组织中炎症的肉眼观察评分的抑制的图。

图20是用显微镜确定由于向具有葡聚糖硫酸钠诱导的肠炎的模型给药青黛的70％乙醇提取物的乙酸乙酯级分的结果的肠组织中病理细胞破坏减少的图像。

图21是显示由于向具有葡聚糖硫酸钠诱导的肠炎的模型给药青黛的70％乙醇提取物的乙酸乙酯级分的结果的肠组织中病理细胞破坏的评分的图。

本发明的最佳方式

在下文中，会通过实施例更详细地描述本发明的构造和效果。然而，提供以下实施例仅用于说明本发明，因此本发明的内容不限于此。

实施例1：青黛提取物及其级分的制备

将青黛和70％乙醇搅拌48小时以进行提取，并过滤以从其中蒸发溶剂和水，从而制备软浸膏的形式的青黛提取物。之后，将水加入到所述提取物中，之后向其中加入己烷并分级，使得有机溶剂层和水层第一彼此分离。再将氯仿(CHCl3)加入到所述第一分离的水层中并分级，使得有机溶剂层和水层第二彼此分离。再将乙酸乙酯(EtOAc)加入到所述第二分离的水层中，使得有机溶剂层和水层第三彼此分离。再将丁醇(BuOH)加入到所述第三分离的水层中，之后有机溶剂层和水层第四彼此分离，从而分别收集己烷级分、氯仿级分、乙酸乙酯级分和丁醇级分。在以下实验例中，将青黛的70％乙醇提取物、其乙酸乙酯级分和其丁醇级分如以下表1中所示用作样品。

[表1]

实验例1：青黛提取物用于预防和治疗结肠炎肠病的实验

通过使用用于结肠炎肠病的动物模型确定青黛提取物对预防和治疗炎性肠病的效果。通过用吡罗昔康处理IL-10敲除小鼠来制备用于实验的结肠炎肠病的动物模型，其中已知这样的小鼠用于确定预防和治疗肠病的效果(Holgersen等人，J Crohns Colitis，2014；8；147-60；Hale等人，Inflamm Bowel Dis 2005；11:1060-9)。

特别地，当给IL-10缺陷的实验室小鼠喂食混合吡罗昔康的饮食时，将根据上述实施例1制备的青黛提取物或其级分，如表1所示，口服给药至每只小鼠，25mg每天一次，持续13天。每天测量体重，持续13天的实验期。在实验的第14天后，处死实验室小鼠，然后测量结肠的长度，并获得组织用ELISA试剂盒测量免疫反应性因子。

作为比较重量的结果，在正常组的情况下，维持一定水平的重量。然而，在服用吡罗昔康的组的情况下，重量大幅下降。然而，在服用青黛提取物及其级分的组的情况下，确定与仅服用吡罗昔康的组相比，重量降低的比率较低(图1)。

此外，作为确定结肠长度变化的结果，显示在服用吡罗昔康诱导的结肠炎肠病的组的情况下结肠的长度减小。然而，在服用青黛提取物及其级分的组的情况下，确定与仅服用吡罗昔康的组相比结肠的长度增加并且恢复至正常组的水平(图2和图3)。

此外，作为比较与结肠炎疾病相关的免疫因子水平的结果，显示在服用吡罗昔康诱导的结肠炎肠病的组中MPO、IL-6、IL-1b和IL-17的水平增加。然而，在服用青黛提取物及其级分的组的情况下，显示与仅服用吡罗昔康的组相比，所述免疫因子水平降低(图4至图7)。

同时，对于服用青黛提取物的乙酸乙酯级分的组，在13天的实验期间观察其重量、大便形式和血便，以根据表2的方法测量结肠炎肠病的疾病活动指数(DAI)。

[表2]

此外，在实验的第14天之后，将实验室小鼠处死以从中分离结肠，之后用显微镜确定对结肠的组织学损伤的存在，并且根据表3的方法给出对结肠的损伤评分。

[表3]

作为实验的结果，确定与服用吡罗昔康诱导的结肠炎的组相比肠疾病的疾病活动指数(DAI)(据报道在结肠炎模型中最好地反映炎症)显著缓解(图8)。

作为研究实验期间动物模型存活率的结果，对于服用乙酸乙酯级分的组，确定与服用吡罗昔康以具有诱导的结肠炎的组相比存活率较高(图9)。此外，对于服用乙酸乙酯级分的组，确定对结肠的损伤程度降低以病理学地缓解结肠炎(图10和图11)。

从上述实验中，确定青黛提取物及其级分对预防和治疗结肠炎肠病具有优异的效果而没有任何毒性。

实验例2：青黛提取物用于预防和治疗肠炎的实验

通过使用具有葡聚糖硫酸钠诱导的肠炎的动物模型确定青黛提取物对预防和治疗炎性肠病的效果，已知该动物模型用于确定预防和治疗肠疾病的效果(Mizoguchi等人，Prog Mol Biol Transl Sci，2012:105；263-320；Yan等人，PLos One，2009:4；e6073)。

特别地，根据上述实施例1制备的青黛提取物或其级分，如表1所示，对每组以合适的量每天一次口服给药至实验室小鼠(C57BL6)。在给药样品后两天，将饮用水或含有4％葡聚糖硫酸钠的饮用水供应给这样的动物模型七天，在实验期间每天观察重量、大便形式和血便，以根据实验例1中所示的上述表2相同的标准测量肠炎的疾病活动指数(DAI)。并且，在实验的第8天后，处死实验室小鼠，之后从其中获得结肠组织以用ELISA试剂盒测量免疫反应性因子。

作为实验的结果，确定重量在正常组中缓慢增加，但在服用葡聚糖硫酸钠的组中大幅减少。然而，对于服用青黛提取物或其级分的组也确定重量减少程度显著降低(图12)。

此外，对于服用葡聚糖硫酸钠的组，确定肠炎的疾病活动指数(DAI)增加，表现炎性肠病模型的特征，但是也确定对于服用青黛提取物及其级分的组与服用葡聚糖硫酸钠的组相比，疾病活性指数降低(图13)。

此外，作为比较与炎性肠病相关的免疫因子水平的结果，显示在服用葡聚糖硫酸钠诱导的炎性肠病的组的情况下，IL-6、IL-1b和IL-17的水平增加。然而，在服用青黛提取物及其级分的组的情况下，显示与仅服用葡聚糖硫酸钠的组相比，所述免疫因子水平降低(图14至图16)。

同时，在服用青黛提取物的乙酸乙酯级分的组的情况下，以不同浓度给药这样的级分。在实验的第8天后，处死实验室小鼠，然后测量结肠的长度，并根据表4的标准测量直肠和阑尾中的炎症的肉眼观察评分(通过用在不使用显微镜的情况下观察并判断肠黏膜表面的方法)。此外，用显微镜确定对结肠的组织学损伤的存在，并根据表5的方法测量损伤的评分。

[表4]

[表5]

作为实验的结果，确定服用葡聚糖硫酸钠的组与正常组相比，结肠的长度显著减小，但是还确定服用乙酸乙酯级分的组与服用葡聚糖硫酸钠的组相比，结肠的长度显著增加(图17和图18)。此外，对于服用葡聚糖硫酸钠的组，确定炎症的组织学评分增加，表现炎性肠病模型的特征，但是还确定服用乙酸乙酯级分的组与服用葡聚糖硫酸钠的组相比，炎症的组织学评分降低(图19)。此外，对于服用乙酸乙酯级分的组，确定对结肠的损伤程度降低以病理学地缓解结肠炎(图20和21)。

从上述实验中，确定青黛提取物及其级分对预防和治疗炎性肠病具有优异的效果而没有任何毒性。

虽然上面已经详细描述了本发明的具体部分，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这样的详细描述仅用于说明示例性实施方案，而不被解释为限制本发明的范围。

因此，应理解本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。