用于口服递送的活细胞制剂的制作方法
【专利说明】用于口服递送的活细胞制剂
[0001 ]本发明设及用于活细胞的口服递送的制剂，所述活细胞例如细菌细胞。
[0002]目前，口服活细菌递送被用于两种主要类型的治疗应用中。首先，从肠分离物鉴定 出的未修饰的肠细菌菌株在抗生素治疗后的肠的重新建群[1]、炎性肠病患者的症状缓解
[2] W及生物学治疗递送的基因工程化形式(例如IL-10[3])中具有治疗应用。其次，活细菌 是有前景的候选疫苗。目前，测试减毒活细菌的不同菌株在对抗诸如霍乱、肠毒性大肠杆菌 和伤寒的疾病中的保护作用的很多人群临床试验正在进行中（[4])。活细菌疫苗超过常规 疫苗的优势在于它们是口服给药的，运避免了注射和用针。基因工程化的活细菌疫苗还可 W携带来自病原体或肿瘤的异源DNA或抗原来刺激或引发对抗病原体或肿瘤细胞的免疫应 答。
[0003] 由于稳定性的原因，通常对用于活递送的细菌进行干燥。用于活细菌递送的干燥 制剂的备选方案是"湿"的形式，例如诸如酸乳的食品。活细菌在液体形式时具有明显的稳 定性问题，即使是冷藏。已经提议了用于细菌口服递送的多种微封装系统[5]，但是都遭受 细菌在胆存时降解运一相同问题，并且需要昂贵的冷藏设备来减少降解。
[0004] 制备干燥的细菌的各种技术是本领域已知的。最常见的是使用常规冷冻干燥。此 夕h最近还关注于使用诸如海藻糖和薦糖的二糖，二糖能稳定生物分子并使干燥的细菌在 室溫下更稳定[6]、[7]。二糖稳定化的干燥的细菌可W例如常规胆存在室溫下。
[0005] 目前，干燥的活细菌的口服给药是W下两种常见形式:冷冻干燥的细菌的肠胶囊 和需要在碳酸氨盐缓冲液中重悬的冷冻干燥的细菌的药囊。通常，给予非常高剂量的细菌， 并且需要多剂量才仅产生适当的效果。有趣的是，临床数据表明肠胶囊制剂的功效显著低 于碳酸氨盐缓冲液系统[引[15]，但是对肠胶囊为何功效相对较低还知之甚少。
[0006] 对于碳酸氨盐缓冲液系统的作用机制的了解还很少。吞服的碳酸氨盐缓冲液的量 不太可能吸收分泌至胃中的酸，所W似乎是W运种方式给药的细菌会遇到一定酸度。尽管 存在运些可能的局限，但是在诸如霍乱[9]和肠毒性大肠杆菌[10]的疾病的疫苗菌株的现 行的人群临床试验中，与碳酸氨盐缓冲液或相似酸中和缓冲液的共同给药目前是递送的标 准模式。
[0007] 胃具有分泌盐酸并将内容物降至pH IW下的能力。很少的细菌能在该pH下存活
[11]，并且已证实干燥的活细菌比来自新鲜培养物的细菌更敏感[12]。"肠溶"衣可W用于 避免活细菌制剂在胃酸中死亡。肠溶衣是在酸性条件下不会溶解的聚合物层，但是在胃排 空后它会在肠中溶解，从而将干燥的细菌释放到小肠上段。如上文所述，已有的活细菌疫苗 的肠胶囊的功效相对较低，尽管它们具有保护细菌对抗胃酸的能力[引。
[000引肠含有酶和其它杀微生物成分的复杂混合物。胆汁是从胆囊分泌到十二指肠中。 胆汁通常包含至少50%的胆汁酸，胆汁酸作为清洁剂来溶解和消化脂肪食物成分。胆汁酸 在杀细菌方面也很强。诸如沙口氏菌（Salmonella SPP.)的通常存在于肠内部位的细菌菌 株对于诸如胆汁盐的清洁剂具有演变的抗性机制，运允许它们在肠中存活和生长。
[0009]细菌在干燥或冷冻后通常丧失了它们对于胆汁酸的抗性。从肠溶制剂中释放入肠 的干燥的细菌对于胆汁酸是敏感的，并且不能在肠环境中存活[12]。
[0010] 本发明设及下述发现:在干燥的活细胞的制剂中渗入少量胆汁酸结合剂能显著增 加细胞在肠道中的存活。因此，运些制剂可W用于将诸如细菌细胞的活细胞口服递送至肠。
[0011] 本发明的一方面提供了用于对个体口服给药的固体制剂，其包含干燥的活细胞和 胆汁酸结合剂。
[0012] 胆汁结合剂允许水性液体渗入制剂，但是吸收胆汁酸并阻止它们渗入制剂。运能 保护干燥的活细胞免受胆汁酸毒性的损害，直至它们被渗入的水性液体再水合并恢复其胆 汁耐受性。运可W例如增加将细胞递送至肠的功效。
[0013] 干燥的活细胞可W是微生物细胞。本文所述的制剂中可W使用任何微生物细胞， 并且细胞的类型取决于制剂的具体使用目的。
[0014] 在一些实施方案中，可W使用细菌细胞，例如来自肠细菌的细胞。肠细菌是本领域 公知的，并且包括病原体和非致病性种类，例如肠杆菌科化111日1'〇6日(31日1'1日[日日日），所述肠杆 菌科例如埃希氏菌属（Escherichia)、沙口氏菌属（Salmonella)、克雷伯氏菌属 化Iebsiella)、肠杆菌属化nterobacter)、沙雷氏菌属（Serratia)、变形菌（Proteus spp) W及双歧杆菌属（Bif idobacterium)、拟杆菌属（Bacteroides)、梭菌属（Clostridium)、假 单胞菌属（Pseudomonas )、瘤胃球菌属（Ruminococcus )、乳酸杆菌属(Xactobaci 1 Ius )、乳球 菌属（Lactococcus)、弯曲杆菌属（Campylobacter)和链球菌（Str巧tococ州S spp.)。
[0015] 使用本文所述的制剂将肠细菌细胞递送至肠可W用于，例如抗生素治疗后的患者 的肠内菌群的恢复W及炎性肠病患者的症状缓解。
[0016] 在其它实施方案中，所述干燥的活的微生物细胞可W是真核细胞，例如酵母或真 菌细胞，例如酵母（Saccharomyces SPP .)、曲霉（AspergiIlus S邮.）或念珠菌（Candida SPP.)O
[0017] 在一些实施方案中，可W使用具有特定的酶学性质或其它性质的微生物细胞。将 所述细胞递送至肠可W用于，例如疾病相关化合物或毒素的分解或代谢或通过影响肠吸收 来降低胆固醇水平，所述疾病相关化合物或毒素例如草酸盐，草酸盐是肾结石形成的危险 因素。
[0018] 在一些实施方案中，所述微生物细胞可W表达治疗因子，例如表达重组蛋白。合适 的重组多肤对于细菌细胞可W是外源的（即所述细菌细胞不会天然表达的多肤，例如人多 肤），并且可W对患者具有治疗效果。合适的重组多肤包括细胞因子，包括诸如IL-IO的白细 胞介素;趋化因子；W及抗体、抗体片段或与免疫应答的介质结合的相关结合分子，所述介 质例如细胞因子(例如中和炎性肠病中的TNF-a的细胞因子）。
[0019] 用于表达重组多肤的合适的微生物细胞包括来自乳酸细菌的细胞，，诸如乳酸乳 球菌（L. 1 曰Ctis) (Europesn Journsl of Phsrnmceutics 曰nd Bioph曰rm曰ceutics(2005) 60 : 349)的乳球菌化actococci);肠杆菌科和上文所述的其它肠细菌；W及其它微生物细 胞，例如酵母和真菌，例如酵母或念珠菌。
[0020] 在一些实施方案中，所述干燥的活细胞可W是活细菌疫苗的细胞。活细菌疫苗通 常是毒力已被减弱的细菌细胞，例如通过使一个或多个毒力基因失活。适于用作疫苗的减 毒细菌细胞的很多实例是本领域已知的。
[0021] 细菌疫苗可W是细菌病原体的减毒细胞。减毒疫苗表达病原体的天然内源性抗原 可W刺激或引发针对病原体的有毒力的非疫苗菌株的保护性免疫应答。合适的细菌疫苗包 括W下细胞的减毒细胞:霍乱弧菌(V化rio cholerae);大肠杆菌化.coli)的肠毒性菌株， 例如0 1 5 7 : H7、0 1 2 1和0 1 0 4 : H2 1 ;志贺氏菌（Sh i g e 11 a )，例如频疾志贺氏菌 (S.dysenteriae)、宋内志贺氏菌（S. sonnei)、鲍氏志贺氏菌（S.boydii)和福氏志贺氏菌 (S.f Iexneri);弯曲杆菌，例如空肠弯曲杆菌（CJejuni);和沙口氏菌，例如肠沙口氏菌 (Salmonella enterica)(特别是伤寒血清变型）。
[0022] 用于伤寒的治疗或预防性处理的活细菌疫苗是本领域公知的，并且包括伤寒沙口 氏菌（Salmonella typM)菌株Ty21a(Vivotif?)、Ty800、CVD908、CVD908-htr、CVD915和 Z册。
[0023] 用于霍乱的治疗或预防性处理的活细菌疫苗也是本领域公知的，并且包括邮1(-70、CVD lOl'CVD 102、CVD 104、CVD 105、395N1、JJM43、TCP2、CVD 103、CVD 103-RM、CVD 103-叱3(八41_!化础〇1饭）、00)110、8址脚111-3、口6削-3、化削-5和化削-15。
[0024] 用于志贺氏菌病和细菌性频疾的治疗或预防性处理的活细菌疫苗也是本领域公 知的，并且包括减毒志贺氏菌的减毒疫苗菌株，例如CVD1204和WRSSl。
[0025] 用于腹泻的治疗或预防性处理的活细菌疫苗也是本领域公知的，并且包括减毒肠 毒性大肠杆菌细胞，例如PTL002和PTL003。
[0026] 用于李斯特菌病的治疗或预防性处理的活细菌疫苗也是本领域公知的，并且包括 单核细胞增多性李斯特菌化isteria monocytogenes)的减毒菌株，例如Lmdd。
[0027] 细菌疫苗可W包含编码外源抗原即不是由疫苗细胞天然表达的抗原(例如人或病 毒抗原或来自不同细菌种类的抗原）的异源核酸。细菌疫苗可W刺激或引发针对外源抗原 的保护性免疫应答，例如当抗原出现在病原体或诸如癌细胞或病毒感染的细胞的疾病细胞 的表面上时。
[0028] 术语"异源"表示的核酸序列是重组序列，所述重组序列被人工使用基因工程或重 组手段，即通过人为干预，引入构建体、载体或细胞。异源的核巧酸序列在自然界中不会一 起出现。对于细胞是异源性的核巧酸或氨基酸序列不会天然存在于该类型、品种(variety) 或种类的细胞中（即外源的或外来的）。对于细胞是异源性的核酸序列可W编码异源氨基酸 序列，即对于该细胞是外源的或外来的氨基酸序列。
[0029] 在一些实施方案中，异源核酸可W由微生物细胞表达来产生外源抗原。外源抗原 可W由微生物细胞分泌、出现在微生物细胞的表面上或保留在微生物细胞的细胞内。
[0030] 在其它实施方案中，异源核酸可W不由微生物细胞表达。例如，异源核酸可W在递 送至肠后被转移到个体的宿主细胞并在宿主细胞中表达。可W例如WDNA接种或DNA转移的 方法表达异源核酸来产生外源抗原，或者可W例如WRNA干扰的方法表达异源核酸来产生 有义或反义RNA分子。
[0031] 可W由异源核酸编码的合适的外源抗原包括疾病相关抗原，例如肿瘤抗原和病 毒、细菌和其它病原体的抗原，例如来自于变形链球菌（Streptococcus mu化ns)、宋内志贺 氏菌、大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis)、炭痘芽抱 杆菌（日日。111118 311*^日^3)、^￥、流感病毒、肝炎病毒、乳头瘤病毒、镶状追原虫 (Plasmodium falciparum)、上拉热弗朗西丝菌（FranciselIa tularensis)和曼森血吸虫 (Schistosoma mansoni)的抗原，或来自肿瘤的抗原，例如化r2/neu或前列腺特异性抗原 (PSA)O
[0032] 其它合适的外源抗原包括来自个体的分子，例如抗体个体基因型，例如用于产生 抗个体基因型免疫应答。
[0033] 任选地，细菌疫苗还可W共表达重组异源免疫调节多肤，例如细胞因子，例如TNF-a、GM-CSF、Iレl、Iレ6、Iレ12、Iレ18、IFN-a、IFN-丫；趋化因子，例ク日C化-25;或抑制细胞因 子(例如化-l〇、TGF-e)或其它免疫应答介导物或免疫细胞(例如调节性T细胞或抑制性T细 胞)的抗体或抗体片段或其它结合多肤。运可W用于增强对外源抗原的免疫应答。
[0034] 用于表达外来抗源的合适的细菌疫苗包括活细菌疫苗菌株，例如减毒病原菌，例 如肠沙口氏菌、霍乱弧菌、肠毒性大肠杆菌、志贺氏菌和空肠弯曲杆菌;和非病原菌细胞，包 括肠细菌，例如肠细菌科；W及其它细菌，例如枯草芽抱杆菌(Bacillus subtlis)和乳酸