减轻肺部炎症的方法与流程
本发明涉及一种通过给药高浓度的吸入性螯合剂来治疗或预防肺部炎症的方法，以及用于该方法的制剂。在本发明的一个实施方案中，肺部炎症与囊性纤维化病有关或是由其引起的。
背景技术：
囊性纤维化的特征在于易感染，其导致炎症和肺部损伤。但是，炎症和肺部损伤在没有细菌感染的情况下也可能发生(sly等人amjrespircritcaremed.2009180(2):146-52)。
炎症是人体对侵害的反应，包括感染、创伤和过敏。炎症反应是复杂的，且涉及多种防御病原体和修复组织的机制。在肺部中，炎症通常是由病原体或暴露于毒素、污染物、刺激物和过敏原引起的。
在炎症期间，多种类型的炎症细胞被激活。每种细胞均释放细胞因子和介质，以改变其它炎症细胞的活性。这些细胞和分子的编排导致炎症进展。临床上，急性炎症见于以下疾病中，如肺炎和急性呼吸窘迫综合征(ards)，而慢性炎症则表现为以下疾病，如哮喘、囊性纤维化和慢性阻塞性肺疾病(copd)。因为肺是进行气体交换的重要器官，所以过度的炎症会危及生命。炎症和抗炎症之间的微妙平衡对于肺部稳态至关重要。
免疫力涉及先天性和适应性系统。先天性免疫是非特异性的，可引起快速反应，包括面对病原体侵害时的炎症。适应性免疫是抗原特异性的。它首先检测特定抗原，然后动员炎症细胞靶向该特定抗原。先天性和适应性系统共享组件并协同行动以抵御病原体。
气道上皮分泌多种物质，如粘蛋白、防御素、溶菌酶、乳铁蛋白和一氧化氮，这些物质非特异性地保护呼吸道免受微生物侵袭。上皮细胞还产生多种介质，例如活性氧自由基、细胞因子(tnf-α、il-1β、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子[gm-csf])和血小板活化因子，以将炎症细胞募集到炎症部位。细胞因子刺激花生四烯酸从膜脂中释放，导致类花生酸的产生，从而进一步刺激杯形细胞和组织炎症引起的粘液分泌。
表面活性剂位于肺泡表面，并包含四种表面活性蛋白(spa-d)。这些蛋白在表面活性剂吸收到肺泡表面中起着关键作用，这对于降低肺表面张力很重要。sp-a和sp-d也参与宿主防御。它们结合细菌表面分子，调节白细胞活性，并导致病原体调理作用。
浆细胞分泌的iga会形成额外的上皮保护屏障，其阻止微生物粘附到上皮表面。其还与病原体结合，引起吞噬作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。免疫球蛋白e(ige)在呼吸道中引起速发型超敏反应。其通过与肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和b淋巴细胞表面的ige受体结合而产生严重反应。重复暴露于同一抗原会导致脱颗粒和促炎症介质(包括组胺、前列腺素、白三烯和类胰蛋白酶)的释放。这些作用会增加血管通透性、支气管收缩和炎症细胞浸润。
us20160263151教导吸入的抗生素与酸化的亚硝酸盐和铁螯合剂的组合用于治疗细菌感染的用途。存在于us20160263151的制剂中的铁螯合剂当与酸化的亚硝酸盐组合时，提供协同作用，从而增强抗生素的能力。
当前针对肺部炎症的治疗包括口服或吸入类固醇以及靶向宿主炎症反应的非类固醇药物。但是，这种作用是暂时的，需要连续治疗，并且存在明显的副作用。
需要治疗或预防肺部炎症的方法；或至少一种补充或提供先前已知治疗方法的替代的方法。
本发明意在提供一种通过给药高浓度的吸入性螯合剂来治疗或预防肺部炎症的改进或替代方法。
先前对背景技术的讨论仅旨在促进对本发明的理解。本讨论并非承认或认同所提到的任何材料在申请的优先权日之前是或曾经是公知常识的一部分。
发明概述
本发明提供一种通过给药高浓度的吸入性螯合剂来治疗或预防肺部炎症的方法。
优选地，所述吸入性螯合剂的高浓度是高于37.5mg/剂。
优选地，所述吸入性螯合剂的高浓度是高于50mg/剂。
在本发明的一种形式中，高浓度螯合剂以包括至少50mg/剂或50mg/剂至300mg/剂的剂型提供。所述螯合剂可每天给药一次至四次，总剂量最高约1,200mg/天，优选至少150mg/天。
在本发明的一种形式中，高浓度螯合剂以包括至少37.5mg/剂或37.5mg/剂至300mg/剂的剂型提供。所述螯合剂可每天给药一次至四次，总剂量最高约1,200mg/天，优选至少150mg/天。
优选给药37.5mg/天至1,200mg/天的螯合剂。优选地，给药至少50mg/天的螯合剂。所述螯合剂可每天给药一次至四次，最多以约1,200mg/天的总剂量给药。
优选地，每剂螯合剂以不超过8小时的时间段给药。优选地，所述螯合剂和/或抗生素以不超过1小时的时间段给药。
优选地，所述螯合剂是caedta。
本发明还提供一种通过给药高浓度的吸入性螯合剂来治疗或预防肺部炎症的方法，其中所述炎症的治疗或预防导致用力呼气量(fev)的增加。
本发明还提供一种通过给药高浓度的吸入性螯合剂来治疗或预防肺部炎症的方法，其中所述炎症的治疗或预防与基质金属蛋白酶(mmp)活性降低相关。
本发明还提供一种通过给药高浓度的吸入性螯合剂来治疗或预防肺部炎症的方法，其中所述炎症的治疗或预防与羟基自由基的生成减少相关。
本发明提供了包含高浓度螯合剂的可吸入制剂。
本发明提供一种可吸入制剂，其包含高浓度的螯合剂且能够以单一剂量递送高浓度的可吸入螯合剂。
本发明提供了一种用于治疗或预防含肺炎的试剂盒，其包含(i)包含高浓度螯合剂的可吸入制剂；和(ii)使用说明书。
本发明提供了一种用于治疗或预防含肺炎的试剂盒，其包含(i)能够以单剂量递送高浓度的可吸入螯合剂的可吸入制剂；和(ii)使用说明书。
高浓度的螯合剂在制造用于治疗或预防肺部炎症的可吸入制剂中的用途。
可吸入的螯合剂在药物生产中的用途，该药物用于递送以单一剂量治疗或预防肺部感染的高浓度的可吸入螯合剂。
附图概述
本发明的其它特征将在以下的本发明的几个非限制性实施方案的描述中更加充分地描述。仅出于举例说明本发明的目的而包括该描述。不应将其理解为对如上所述的本发明的广泛概括、公开或说明的限制。所述描述将参考附图，其中：
图1显示了edta的亚微米颗粒杀灭铜绿假单胞菌的生物被膜并与cf黏液中的妥布霉素在体外协同作用于铜绿假单胞菌生物被膜，所述黏液用雾化的edta颗粒和/或妥布霉素处理。液滴中妥布霉素的终浓度为325μg/ml。1a)用baclightlive/dead染色的生物被膜的共聚焦显微镜图像。1b)细菌计数显示治疗的定量效果。
图2显示，caedta降低cf肺中细菌负载的速度比单独使用抗生素治疗快。cf受试者用雾化的caedta(edta)或盐水(安慰剂)处理，并监测排痰粘液中的细菌负载(每克粘液的菌落形成单位)。
图3a显示从治疗开始至第10周(治疗后4周)，用caedta或安慰剂治疗的患者的fev1的平均变化(％点)。图3b显示了fev1改善(0-2周)与体重之间的关系。
图4显示用75mg雾化的caedta治疗后5分钟和2小时，在三名cf受试者的痰液中达到的edta浓度。
图5-7表明，在没有感染的情况下，向小鼠肺部给药高浓度的螯合剂减轻了炎症。
图5显示暴露于空气或香烟烟雾(cs)中并通过鼻内给药媒介物或去铁胺(dfo)治疗的小鼠的支气管肺泡灌洗液(balf)中的白细胞总计数。尽管香烟烟雾能如预期的那样诱导白细胞数量，但用dfo治疗大大降低了这种效果。
图6显示暴露于空气或cs并如上所述用媒介物或dfo处理的小鼠的肺重量。肺重量可以用作炎症的替代，重量增加表明更多的炎症。在经cs处理的小鼠中，肺部重量如预期那样显著增加，而dfo治疗降低了平均重量，表明炎症减轻。
图7显示，虽然cs增加了balf中的铁含量，但用去铁胺处理降低了该效果。左：每组小鼠的平均铁含量；右：相同数据的散点图。
发明描述
发明详述
治疗或预防方法
本发明提供一种通过给药高浓度的吸入性螯合剂来治疗或预防肺部炎症的方法。
优选地，所述吸入性螯合剂的高浓度是高于37.5mg/剂。
优选地，所述吸入性螯合剂的高浓度是高于50mg/剂。
先前已证明单独使用吸入性edta不能治疗细菌感染(brown等人(amjdischild.1985139(8):836-9)；hassett(frontmicrobiol.20167:291))。brown等人(1985)用雾化的edta钠治疗10例慢性感染铜绿假单胞菌的cf儿童三个月，观察到肺功能无变化。其他人已报道edta引起浓度依赖性支气管收缩(beasley等人(brmedj(clinresed).1987294(6581):1197-8))；edta对fev1没有影响(asmus等人(jallergyclinimmunol.2001107(1):68-72))。因此，没有理由相信螯合剂会对患有如囊性纤维化(cf)、哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)或其它引起或与炎症相关的肺部病状的受试者产生积极影响。然而，本发明令人惊讶地发现，吸入性螯合剂可以治疗或预防肺部炎症。
通常认为cf肺环境是酸性的。但是，最近发现cf肺的ph与正常肺的ph相同(schultz等人“airwaysurfaceliquidphinchildrenwithcysticfibrosis”.naturecommunications20178(1):1409)。现有技术使用酸化亚硝酸盐，如us20160263151中所描述，因此该制剂不太可能对cf在临床中起作用，因为该制剂不会保持酸化，而是会立即恢复到正常的肺部ph值的7.4。
尽管cf肺的酸度正常，已发现铁水平与正常肺显著不同。stites等人(amjrespircritcaremed.1999160(3):796-80)的结果表明，与健康个体相比，cf患者肺部和吸烟者肺部的铁水平大幅升高。其还显示，大多数的这种铁是亚铁形式，fe(ii)，且与疾病的严重程度显著相关(hunter等人,mbio.20134(4):1-8)。亚铁可参与fenton反应，产生高反应性氧自由基，其可严重破坏组织和dna(jomova等人toxicology.2011283(2-3):65-87；macnee,eurjpharmacol.2001429(1-3):195-207)。
不希望受到理论的束缚，据信本发明的方法通过以下来减轻炎症：(i)通过锌的螯合使基质金属蛋白酶(mmp)失活；(ii)通过铁的螯合减少活性氧(ros)的产生；和/或(iii)通过剥夺细菌中必需的离子(例如铁和锌)来减少肺中的细菌负载。对于个体肺部的作用是减轻炎症的理论方法中的一种方法、或多种方法的组合。
吸入是一种局部给药方法，因此可以更有效地到达目标区域，即肺部，并提供局部高浓度的吸入性螯合剂。吸入避免了由于活性物质的全身暴露而产生的不希望看到的副作用，并降低了患者产生耐药性的风险。
本发明还提供一种通过给药高浓度的吸入性螯合剂来治疗或预防肺部炎症的方法，其中所述炎症的治疗或预防导致fev的增加。
本发明还提供一种通过给药高浓度的吸入性螯合剂来治疗或预防肺部炎症的方法，其中所述炎症的治疗或预防与mmp活性降低相关。已知基质金属蛋白酶(mmp)引起肺损伤(garratt等人eurrespirj.201546(2):384-94)并且mmp活性是zn2+依赖性的(hazra等人molecularvision2012；18:1701-1711)。但是，先前对靶向肺部中的mmp的尝试均未成功。本发明使用吸入性螯合剂来螯合肺中的锌，从而减少mmp诱导的肺损伤并治疗或预防炎症。
本发明还提供一种通过给药高浓度的吸入性螯合剂来治疗或预防肺部炎症的方法，其中所述炎症的治疗或预防与羟基自由基生成减少相关。铁是肺损伤的关键因素(stites等人(amjrespircritcaremed.1999160(3):796-80)，由于铁催化羟基自由基的形成。但是，迄今为止，抗氧化剂试验未能产生肺功能的显著改善。本发明使用吸入性螯合剂来螯合肺中的铁，从而减少羟基自由基引起的肺损伤并治疗或预防炎症。
本发明还提供一种通过给药高浓度的吸入性螯合剂来治疗或预防肺部炎症的方法，其中所述炎症的治疗或预防是由通过所述螯合剂的存在来移除或减少细菌产生的生物被膜而导致的。生物被膜的减少使通过咳嗽和咳痰去除的细菌和生物被膜增加。
本发明还提供一种通过给药高浓度的吸入性螯合剂来治疗或预防肺部炎症的方法，其中所述炎症的治疗或预防是由去除或减少细菌产生的蛋白酶而导致的，所述蛋白酶可刺激局部炎症、引起局部组织损伤，且可中和抗生素活性。这些酶很大程度上是阳离子依赖性的，从环境中去除阳离子有望使这些酶失活。
优选地，所述螯合剂是铁螯合剂或锌螯合剂。更优选地，所述螯合剂是铁和锌的螯合剂(铁/锌螯合剂)。可替代地，所述螯合剂可以是两种或更多种螯合剂的混合物，例如铁螯合剂和锌螯合剂的混合物，或铁/锌螯合剂和锌螯合剂的混合物，或铁螯合剂和铁/锌螯合剂的混合物。
所述螯合剂优选地选自柠檬酸、磷酸盐、乙二胺四乙酸(edta)的二、三和四钠盐、edta的钙盐、乙二醇-双-(b-氨基乙基醚)-n,n,n',n'-四乙酸(egta)；1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-n,n,n',n'-四乙酸(bapta)；乙烯-n,n'-二甘氨酸(edda)；2,2'-(乙烯基亚氨基)-二丁酸(ebda)；月桂酰基edta；二月桂酰基edta、三亚乙基四胺二氢氯化物(trien)、二亚乙基三胺五乙酸(dpta)、三亚乙基四胺六乙酸(ttg)、去铁胺(dfo)、地拉罗司(deferasirox，dsx)、二巯丙醇、柠檬酸锌、青霉胺二巯丁二酸、依替膦酸、六偏磷酸钠、d-青霉胺、多酚、没食子酚(gallol)、儿茶酚、二巯丙醇、四硫钼酸盐、乳铁蛋白和氯碘羟喹及其组合。
优选地，螯合剂是药学上可接受的螯合剂。
在一个实施方案中，螯合剂是乙二胺四乙酸(edta)。在另一实施方案中，螯合剂是去铁胺(dfo)。在另一实施方案中，螯合剂是地拉罗司(dsx)。
优选地，所述螯合剂具有与edta近似相同的铁亲和力，和/或与edta近似相同的锌亲和力。edta在25℃和0.1m的形成常数或稳定常数(logk1)为：fe2+为14.3、fe3+为25.1且锌为16.5。
在一个实施方案中，螯合剂是所述螯合剂的钙盐。优选地，所述螯合剂是caedta。
在一个实施方案中，所述螯合剂以包含37.5mg/剂至300mg/剂、50mg/剂至300mg/剂、约75mg/剂至200mg/剂、约75mg/剂至100mg/剂、约37.5mg/剂至200mg/剂、约50mg/剂至200mg/剂；优选约37.5mg/剂、50mg/剂、75mg/剂、100mg/剂、200mg/剂或300mg/剂的吸入剂型提供。所述螯合剂优选以包含至少37.5mg/剂的吸入剂型提供。所述螯合剂优选以包含至少50mg/剂的吸入剂型提供。
每天螯合剂吸入总量优选为约37.5mg/天至1,200mg/天、约50mg/天至1,200mg/天、约100mg/天至1,000mg/天、约300mg/天至900mg/天、约400mg/天至800mg/天；优选为约150mg/天、300mg/天、500mg/天或600mg/天。
每天螯合剂吸入总量优选为约0.1mg螯合剂/kg体重至15mg螯合剂/kg体重、约0.5mg螯合剂/kg体重至10mg螯合剂/kg体重、约1.0mg螯合剂/kg体重至5mg螯合剂/kg体重；约1.0mg螯合剂/kg体重至3.5mg螯合剂/kg体重；优选为约1.0mg螯合剂/kg体重、1.5mg螯合剂/kg体重、2.0mg螯合剂/kg体重、2.5mg螯合剂/kg体重、3.0mg螯合剂/kg体重、3.5mg螯合剂/kg体重、4.0mg螯合剂/kg体重、4.5mg螯合剂/kg体重、5.0mg螯合剂/kg体重、10mg螯合剂/kg体重、15mg螯合剂/kg体重。
已经确定，如果吸入75mg的螯合剂(如caedta)，则在5分钟后从肺中的痰液中可检测到约0.4mm至1.34mm的螯合剂。
吸入性螯合剂优选为以不多于8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、45分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟的时间段递送。如果通过干粉递送给药，则吸入性螯合剂可以秒为周期递送，例如1秒每“喷”气雾剂装置或干粉吸入器，其中在每个时间点给药一或多喷。
优选地，吸入的螯合剂至少连续28天给药。吸入的螯合剂可以递送2天或更长时间、3天、4天、5天、6天或7天。吸入的螯合剂可以递送2至28天、1周、2周、3周或4周。
一些受试者可从一段时间内对受试者“加载”抗生素和/或螯合剂中受益，在几天或几周内以更高剂量或更频繁地给药，然后以降低剂量或维持剂量给药。
因此本发明：
·递送吸入性螯合剂总量为37.5mg/天至1,200mg/天；
·每天至少给药一次，最多每天给药六次，优选为最多每天给药四次；
·给药不超过8小时的时间段。
优选地，本发明：
·递送吸入性螯合剂总量为37.5mg/天至1,200mg/天；
·每天给药一次或两次；
·以不多于1小时每次给药的周期给药；
·包含caedta作为螯合剂。
任意螯合剂的优选量可通过对比所述试剂与caedta的螯合能力，然后将上述给定的剂量范围乘以该数量来计算。结果提供的螯合水平应近似等于由优选量的edta提供的优选螯合水平。
优选地，炎症是由以下肺部病状引起、造成或与之相关：囊性纤维化(cf)；哮喘；慢性阻塞性肺疾病(copd)；肺动脉高压；肺癌；肺纤维化；支气管扩张；支气管炎；细支气管炎；急性呼吸窘迫综合征；结核；非结核分枝杆菌(ntm)肺部感染；肺炎包括但不限于呼吸机相关性肺炎、社区获得性肺炎、支气管肺炎、大叶性肺炎；由以下细菌，如假单胞菌属、肺炎链球菌、衣原体、支原体肺炎、葡萄球菌属、克雷伯菌属、大肠杆菌、嗜麦芽单胞菌属，和真菌，包括曲霉、丝孢菌和念珠菌引起的感染；对可能发生感染的病状，例如插管或通气患者；肺移植患者的感染；支气管炎；百日咳；内耳感染；链球菌性喉咙感染；吸入性炭疽菌；兔热病或鼻窦炎进行预防性治疗或预防。
优选地，将所述制剂对有需要的受试者以约每天一次至约每天6次给药，更优选为约每天4次给药。
可替代地，所述制剂可以通过连续吸入、通过雾化器对有需要的受试者给药。雾化的制剂可以递送24小时、12小时、8小时、6小时、4小时、2小时或1小时，并且每一次递送(除了24小时和12小时)都可以在24小时内重复几次。
受试者通常会接受约约0.01至15mg/kg/天剂量的螯合剂，+20％或+10％。该剂量通常会雾化或通过至少一次、优选为多次“喷”的气雾剂装置给药。例如，受试者可以单剂量或一天中的多剂量接受0.1mg/kg至15mg/kg螯合剂。
每天的总剂量优选每天给药至少一次，但是可以分为每天给药两次或多次。一些受试者可从一段时间内对受试者“加载”抗生素和/或螯合剂中受益，在几天或几周内以更高剂量或更频繁地给药，然后以降低剂量或维持剂量给药。因为囊性纤维化、copd等，通常为慢性病状，受试者期望在延长的时间段内接受该疗法。
不论药物制剂的形式如何，优选生成的用于吸入的液滴或颗粒的范围为：约0.1μm至12μm、或约0.25μm至6μm、优选1μm至6μm、更优选为约2μm至4μm。可替代地，所述颗粒可为0.1μm至1.0μm、0.2μm至0.9μm、0.3μm至0.8μm、0.4μm至0.7μm或0.5μm。通过生成尺寸范围较窄的吸入颗粒，可以进一步提高药物递送系统的效率并改善剂量的可重复性。因此，优选的是，所述颗粒不仅尺寸在0.1μm至12μm或2μm至6μm或约3至4μm的范围内，而且平均粒径在窄的范围内，因此，被递送到受试者的80％或更多的颗粒的粒径在平均粒径的±20％以内，优选为平均粒径的±10％，更优选为±5％。
“粒径”是为了比较固体颗粒、液体颗粒(液滴)的尺寸而引入的概念。对于小滴和气溶胶，使用术语如“空气动力学直径”和“质量中值空气动力学直径(mmad)”。其定义在下文中给出。
“空气动力学直径”是单位密度球的直径，其具有与所讨论的粒子相同的最终沉降速度。它用于预测此类颗粒在呼吸道中的何处沉积。
“质量中值空气动力学直径”是几何平均空气动力学直径。按重量计，百分之五十的颗粒将小于mmad，而百分之五十将大于mmad。
在粒径实验中，悬浮剂包含无数个运动中大小不同的颗粒。当粒度分析仪分析这些颗粒时，它会形成一条颗粒分布曲线，覆盖从最小的颗粒(可为1nm)开始到最大的颗粒(可为100μm)的整个粒度范围。在粒度分布曲线中，计算出颗粒的累积频率。d10是指特定粒径，其中悬浮剂中10％的颗粒具有小于或等于特定粒径的直径。
d50：与d10相似，d50是制剂中50％粒子群体的截止直径，且指特定粒径，其中悬浮剂中50％的颗粒具有小于或等于特定粒径的直径。
d90:d90是制剂中90％粒子群体的截止直径，且指特定粒径，其中悬浮剂中90％的颗粒具有小于或等于特定粒径的直径。
术语“呼吸道”应理解为在呼吸中起作用的细胞和器官的系统，特别的，呼吸道的器官、组织和细胞包括：肺、鼻子、鼻腔、鼻旁窦、鼻咽、喉、气管、支气管、细支气管、呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊、肺泡、肺细胞(1型和2型)、纤毛黏膜上皮、黏膜上皮细胞、粘膜上皮细胞、肥大细胞、杯状细胞和上皮内树突状细胞。
在本发明的一种形式中，所述治疗或预防受试者的肺部炎症的方法包括给药治疗有效或预防有效浓度的吸入性螯合剂，以单一或多剂量的至少37.5mg/剂的形式，其中所述剂量或每剂螯合剂的给药不超过8小时的时间段。
在本发明的一种形式中，所述治疗受试者的肺部炎症的方法包括给药治疗有效浓度的吸入性螯合剂，以单一或多剂量的至少37.5mg/剂的形式，其中所述剂量或每剂螯合剂的给药不超过8小时的时间段。
在本发明的一种形式中，所述预防受试者的肺部炎症的方法包括给药预防有效浓度的吸入性螯合剂，以单一或多剂量的至少37.5mg/剂的形式，其中所述剂量或每剂螯合剂的给药不超过8小时的时间段。
在本发明的一种形式中，所述治疗或预防受试者的肺部炎症的方法包括治疗或预防需要该治疗的受试者的肺部炎症。
本文所用术语“治疗有效量”是指制剂的量，其中当根据所需给药方案给药时，其足以部分地达到所需治疗效果，或延缓炎症发作，或抑制炎症发展，部分地或完全地停止炎症的发作或发展。
本文所用术语“预防有效量”是指制剂的量，其中当根据所需给药方案给药时，其足以至少部分地预防或延缓炎症的发作。
如本文所用，“治疗”指抑制疾病或病状，即阻止或减少其发展或其至少一种临床或亚临床症状。“治疗”还指减轻疾病或病状，即导致疾病或病状或其至少一种临床或亚临床症状消退。对将要治疗的受试者的益处在统计学上是显著的，或者至少对于受试者和/或医师而言是可察觉的。在治疗炎症的情况下，术语治疗包括减少或消除白细胞浸润(包括巨噬细胞，多形核中性粒细胞，淋巴细胞和其他免疫细胞)；免疫球蛋白；促炎性细胞因子和炎症趋化因子及其受体；有害介体，如活性氧和蛋白水解酶；mmp的丰度和活性；氧化性应激的标志物；以及支气管高反应性和加重的一种或多种。术语治疗进一步包括抗炎细胞因子增加和肺功能增加(fev1)中的一种或多种。
基于以上所述，本领域技术人员将理解，可以使用多种不同的治疗方法和给药方式来治疗单个受试者。因此，已经接受例如静脉内环丙沙星或抗生素等药物的受试者可从吸入本发明的制剂中受益。一些受试者可仅通过吸入接受本发明的高浓度螯合剂制剂。该受试者可具有囊性纤维化的症状，其被诊断为患有肺部感染，或者具有医学状况的症状，这些症状可以受益于向受试者给药高浓度的螯合剂。本发明的制剂也可用于诊断。在实施方案中，例如，作为诊断肺部感染的过程的一部分，受试者可以接受一定剂量的本发明的制剂，其中受试者的一种或多种症状响应于该制剂而改善。
剂型
本发明提供了包含高浓度螯合剂的可吸入制剂。
可吸入制剂可为用于吸入干粉形式，或为用于吸入雾化形式。优选地，该制剂适于吸入以治疗或预防肺部炎症。
在一个实施方案中，所述螯合剂是该螯合剂的钙盐。优选地，所述螯合剂是caedta。
优选地，所述吸入性螯合剂的高浓度为高于37.5mg/剂。优选地，所述吸入性螯合剂的高浓度为高于50mg/剂。优选地，所述高浓度螯合剂以包含37.5mg/剂至300mg/剂、50mg/剂至300mg/剂、约75mg/剂至200mg/剂、约75mg/剂至100mg/剂、约50mg/剂至200mg/剂；优选为约50mg/剂、75mg/剂、100mg/剂、200mg/剂或300mg/剂的剂型提供。所述螯合剂优选为以包含至少37.5mg/剂的吸入剂型提供。所述螯合剂优选为以包含至少50mg/剂的吸入剂型提供。
每天吸入的螯合剂的总量优选为约37.5mg/天至1,200mg/天、50mg/天至1,200mg/天、约100mg/天至1,000mg/天、约300mg/天至900mg/天、约400mg/天至800mg/天；优选为约300mg/天、500mg/天或600mg/天。所述螯合剂最多可以最多为约1,200mg/天，优选为至少150mg/天的总剂量给药。.
每天吸入的螯合剂的总量优选为约37.5mg/天至1,200mg/天、约50mg/天约1,200mg/天、约100mg/天约1,000mg/天、约300mg/天约900mg/天、约400mg/天约800mg/天；优选为约150mg/天、300mg/天、500mg/天或600mg/天。
每天吸入的螯合剂的总量优选为约0.1mg螯合剂/kg体重至15mg螯合剂/kg体重、约0.5mg螯合剂/kg体重至10mg螯合剂/kg体重、约1.0mg螯合剂/kg体重至5mg螯合剂/kg体重；约1.0mg螯合剂/kg体重至3.5mg螯合剂/kg体重；优选为约1.0mg螯合剂/kg体重、1.5mg螯合剂/kg体重、2.0mg螯合剂/kg体重、2.5mg螯合剂/kg体重、3.0mg螯合剂/kg体重、3.5mg螯合剂/kg体重、4.0mg螯合剂/kg体重、4.5mg螯合剂/kg体重、5.0mg螯合剂/kg体重、10mg螯合剂/kg体重、15mg螯合剂/kg体重。
例如，50mg剂量的caedta可以33mm的4ml雾化溶液给药(c10h12can2na2o8的分子质量为274.27g/mol)。相似地，75mg剂量可以50mm的4ml给药或100mg可以66mm的4ml给药。
优选地，所述制剂对有需要的受试者每天给药约一次至每天给药约6次，更优选为每天4次。
可替代地，所述制剂可通过连续吸入、通过雾化器对有需要的受试者给药。所述雾化制剂可递送24小时、12小时，优选为8小时、6小时、4小时、2小时或1小时，并且每一次递送(除了24和12小时)都可以在24小时内重复几次。
可以使用一次性包装和便携式、手持式、电池供电的装置，例如aerx装置，将本发明的制剂对受试者给药(美国专利号5,823,178,aradigm,hayward,calif.)。可替代地，本发明的制剂可以使用机械(非电子)装置来获得。其他可用于递送制剂的吸入装置，包括常规的喷射雾化器、超声雾化器、软雾吸入器、干粉吸入器(dpi)、定量吸入器(mdi)、冷凝气雾发生器和其他系统。
为了作为气雾剂使用，可以将溶液或悬浮液中的本发明化合物与合适的推进剂，例如烃推进剂如丙烷、丁烷或异丁烷，与常规助剂一起包装在加压气雾剂容器中。干粉吸入器是可与压缩空气源一起操作以产生被压缩成非常小的体积的药物制剂的干粉颗粒的系统。对于吸入，所述系统具有多个腔室或泡罩(blister)，每个包含单剂量的药物制剂和用于释放单剂量的选择元件。
可以通过迫使药物穿过膜的孔来产生气雾，该孔的大小范围约为0.25至6μm(美国专利号5,823,178)。当所述孔具有该尺寸时，穿过该孔以形成气雾的颗粒会具有0.5至12μm范围内的直径。药物颗粒可随气流释放，以将颗粒保持在此尺寸范围内。可通过使用振动装置促进小颗粒的产生，所述振动装置提供约800至约4000千赫兹范围内的振动频率。本领域技术人员将认识到，可以对参数进行一些调整，例如从中释放药物的孔的尺寸、振动频率、压力和其他基于制剂的密度和粘度的参数。应注意，一些实施方案的目的是提供直径在约0.5至12μm范围内的雾化颗粒。
赋形剂
本文所述制剂的上述示例性形式可以通过制剂科学领域的技术人员众所周知的方法来制造。另外，本文所述的制剂可包括其他任选的赋形剂，以辅助制造和/或给药本文所述的制剂。这类赋形剂的非限制性实例是本领域众所周知的，包括调味剂、着色剂、口感剂(palatant)、抗氧化剂、粘度调节剂、张度剂、药物载体、缓释剂、舒适性增强剂、乳化剂、增溶剂、润滑剂、结合剂和其他稳定剂，以辅助制剂的制造和/或给药。
优选地，本制剂是无菌的。在另一实施方案中，本发明的制剂是稳定的。
此外，可以添加缓冲剂以调节制剂的ph值。优选地，本发明的制剂包含三(羟甲基)氨基甲烷(tris，也称为tham或氨基丁三醇)作为缓冲剂。tris可在增强edta杀死细菌的作用方面具有进一步的作用。优选地，tris被添加到本发明的制剂中以缓冲制剂并增加edta和/或抗生素在治疗或预防细菌感染中的有效性。
此外，本发明的制剂可包含抗微生物防腐剂。
优选地，本发明制剂的ph为约6.5至8.0，更优选约7.0至7.4。以前已经发现，ph下降越多，细菌对抗菌治疗的耐性就越高。优选的ph有助于避免细菌对制剂在不存在酸化亚硝酸盐的情况下的耐性，所述制剂包含高浓度吸入性螯合剂与抗生素的组合。
在一个替代实施方案中，本发明的制剂可以包含防腐剂，悬浮剂，润湿剂，张度剂和/或稀释剂。本文提供的制剂可包含约0.01％至约90％、或约0.01％至约50％、或约0.01％至约25％、或约0.01％至约10％、或约0.01％至约5％的一种或多种药理学上合适的悬浮液，其在吸入给药后是生理上可接受的。用于本文的药理学上合适的流体包括但不限于极性溶剂，包括但不限于含有羟基或其他极性基团的化合物。溶剂包括但不限于水或醇，例如乙醇、异丙醇、以及包括丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚、甘油和聚氧乙烯醇的二醇。极性溶剂还包括质子溶剂，包括但不限于水、具有一种或多种药学上可接受的盐、醇、二醇或它们的混合物的盐水溶液。在一个替代实施方案中，用于本制剂的水应达到或超过用于吸入药物的适用法规要求。
在一个实施方案中，本文所述的制剂可以是水性的并且包含0-90％的水。在其它实施方案中，本文所述的水性制剂可包含20-80％的水。在其它实施例中，水性制剂可包含50-70％的水。水可以进一步包括纯净的、蒸馏的、无菌的、软化的或去离子的水。
可替代地，制剂可以是非水性的、不含水或水量可忽略不计(例如低于1％、低于0.1％、低于0.01％)。
在一个实施方案中，所述制剂还包含一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
除了灭菌或作为灭菌的替代，本发明的制剂可包含药学上可接受的防腐剂以使微生物污染的可能性最小化。另外，可在本发明的制剂中使用药学上可接受的防腐剂以增加制剂的稳定性。但是，应注意，选择任意防腐剂必须考虑吸入安全性，因为处理的组织可能对刺激物敏感。适用于本文的防腐剂包括但不限于保护溶液免受致病性颗粒污染的那些防腐剂，包括苯乙醇，苯扎氯铵或苯甲酸或苯甲酸盐如苯甲酸钠和苯乙醇。在某些实施方案中，本文的制剂包含约0.001％至约10.0％w/w的苯扎氯铵，或约0.01％v/w的苯乙醇。防腐剂也可以约0.001％至约1％，优选约0.002％至约0.02％，更优选0.02％w/w的量存在。
本文提供的制剂还可包含约0.001％至约90％、或约0.001％至约50％、或约0.001％至约25％、或约0.001％至约10％、或约0.001％至约1％的一种或多种乳化剂、湿润剂或悬浮剂。用于本文的此类试剂包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酯或聚山梨酸酯、包括但不限于聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(聚山梨酯80)、聚山梨酯20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、聚山梨酸酯65(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三硬脂酸酯)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单硬脂酸酯；卵磷脂；琼脂；角叉菜胶；豆角胶；瓜尔胶；黄蓍胶；阿拉伯胶；黄原胶；刺梧桐树胶；果胶；酰胺化果胶；磷脂酸铵；微晶纤维素；甲基纤维素；羟丙基纤维素；羟丙基甲基纤维素；乙基甲基纤维素；羧甲基纤维素；脂肪酸的钠、钾和钙盐；脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯；脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的乙酸酯；脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的乳酸酯；脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯；脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的酒石酸酯；脂肪酸单和双甘油酯的单和二乙酰酒石酸酯；脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的混合乙酸酯和酒石酸酯；脂肪酸蔗糖酯；蔗糖甘油酯；脂肪酸的聚甘油酯；蓖麻油的缩聚脂肪酸的聚甘油酯；脂肪酸的1,2-丙二醇酯；硬脂酰-21丙烯酸钠；硬脂酰基-2-乳酸钙；酒石酸硬脂酰酯；脱水山梨糖醇单硬脂酸酯；脱水山梨糖醇三硬脂酸酯；脱水山梨糖醇单月桂酸酯；脱水山梨糖醇单油酸酯；脱水山梨醇单棕榈酸酯；皂树皮提取物；大豆油二聚脂肪酸的聚甘油酯；氧化聚合大豆油；和果胶提取物。
本发明的制剂可包含按重量计约0.001％至约5％的保湿剂，以抑制粘膜干燥并防止刺激。可以使用多种药学上可接受的保湿剂中的任何一种，例如包括山梨糖醇、丙二醇、聚乙二醇、甘油或它们的混合物。
本发明的制剂可以进一步包含佐剂，例如：支气管扩张剂、另一种抗炎药、表面活性剂、阿司匹林或乙醇。
在本发明的制剂中任选使用的支气管扩张剂包括但不限于β2-肾上腺素能受体激动剂(例如沙丁胺醇(albuterol)、班布特罗、沙丁胺醇(salbutamol)、沙美特罗、福莫特罗、阿福特罗、左旋沙丁胺醇、丙卡特罗、茚达特罗、卡莫特罗、milveterol、丙卡特罗、特布他林等)和抗毒蕈碱类(例如曲司氯胺(trospium)、异丙托铵(ipratropium)、葡萄糖吡喀、aclidinium等)。可以使用药物的组合。
可任选地用于本发明的制剂中的其它抗炎药包括但不限于吸入皮质类固醇(例如倍氯米松、布地奈德、环索奈德、氟替卡松、etiprednol、莫米松等)、白三烯受体拮抗剂和白三烯合成抑制剂(例如孟鲁司特、齐留通、异丁司特、扎鲁司特、普仑司特、阿美卢班、泰鲁司特等)、环氧加酶抑制剂(如布洛芬、酮洛芬、酮咯酸、吲哚美辛、萘普生、扎托洛芬、氯诺昔康、美洛昔康、塞来昔布、芦米考昔、依托考昔、吡罗昔康、安吡昔康、辛诺昔康、双氯芬酸、联苯乙酸、氯诺昔康、美沙拉嗪、三氟柳、替诺立定、艾拉莫德、帕米格雷等)。可以使用药物的组合。也可以加入阿司匹林作为抗炎药。
本发明涵盖的表面活性剂包括但不限于合成表面活性剂
可以添加抗氧化剂，如谷胱甘肽和维生素e、锌和edta的锌盐。
乙醇蒸气可作为肺部的消泡剂，使痰更液体化，可以帮助呼吸并减少肺水肿。可以将乙醇以0.5％至60％，更优选地1至40％，1至20％或1至10％的比例添加到本发明的制剂中。乙醇可以1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的比例加入。
本发明还涉及通过吸入而给予的高浓度的螯合剂与其它药物的组合的用途。这些其他药物可以包括核苷酸序列，其可以掺入合适的递送载体例如质粒或病毒载体中。所述其它药物可以是治疗性核苷酸序列(dna、rna、sirna)、降低粘液粘弹性的酶(如dnase和其它粘液溶解剂)、正调节氯离子通道或增加穿过细胞的离子流动的化学物质、尼古丁、p2y2激动剂、弹性蛋白酶抑制剂，包括α-1抗胰蛋白酶(aat)、n-乙酰半胱氨酸，抗生素和阳离子肽，如羊毛硫抗生素，特别为耐久霉素，短效支气管扩张剂(例如，β2-肾上腺素能受体激动剂，如沙丁胺醇或茚达特罗)、m3毒蕈碱拮抗剂(例如，异丙托溴铵)、k+-通道开放剂、长效支气管扩张剂(例如，福莫特罗、沙美特罗)、类固醇(例如，布地奈德、氟替卡松、曲安西龙、倍氯米松、环索奈德等),黄嘌呤、白三烯拮抗剂(例如，孟鲁司特钠)、磷酸二酯酶4抑制剂、腺苷受体拮抗剂、其它各种抗炎药(例如，syk激酶抑制剂(ave-0950)、类胰蛋白酶抑制剂(ave-8923&ave-5638)、速激肽拮抗剂(ave-5883)、诱导型一氧化氮合酶抑制剂(gw-274150)和其它)、转录因子诱饵、tlr-9激动剂、反义寡核苷酸、sirna、dna、cgrp、利多卡因、反向β2-激动剂、抗感染性氧化疗法、细胞因子调节剂(例如，ccr3受体拮抗剂(gsk-766994,dpc-168,azd-3778)、tnf-α生成抑制剂(lmp-160和ys-th2)以及il-4拮抗剂(ave-0309))、ige的小分子抑制剂、细胞粘附分子(cam)抑制剂、靶向vla4受体或整联蛋白α4β1的小分子(例如，r-411、ps-460644、dw-908e和cdp-323)、免疫调节剂，包括那些通过抑制钙神经素来阻断t细胞信号传导的那些免疫调节剂(他罗利姆)、肝素中和剂(talactoferrinα)、细胞溶质pla2抑制剂(efipladib)或其组合。如果有需要的受试者患有cf，则还可根据标准操作规范对他们给药标准药物，如依伐卡托、阿法链道酶、甘露醇、或其它获批准的药物，并与本发明的制剂组合。
可以通过将药物组合成一种稳定的制剂来实现组合产物的递送，或在分开的容器中提供药物并给药时将其合并或可替代地通过连续递送所述产物。
优选地，本发明的制剂是稳定的。如本文所用，本文提供的制剂的稳定性指在给定温度，多于80％、85％、90％或95％的初始量的药物物质(例如，螯合剂和抗生素)存在于所述制剂中的时间长度。例如，本文提供的制剂可在约15℃至约30℃之间储存，并保持稳定至少1、2、12、18、24或36个月。同样，该制剂在25℃储存超过1、2、12、18、24或36个月后，可适合于给药对其需要的受试者。另外，在另一替代实施方案中，使用阿伦尼乌斯动力学(arrheniuskinetics)，在所述制剂于约15℃至约30℃储存超过1、2、12、18、24或36个月后，超过80％或超过85％或超过90％或超过95％的初始量的药物物质剩余。
如本文所用，陈述“制剂在“长期储存”期间是稳定的”，是指所述制剂适于给药于对其有需要的受试者，当该制剂具有估计贮存期限为：在25℃超过1、2或3个月使用时间和在5℃超过或等于1、2或3年的储存时间。在本文的某些实施方案中，使用阿伦尼乌斯动力学，估计>80％或>85％或>90％或>95％的螯合剂和抗生素在该储存后剩余。
如本文所用，术语“炎症”是指身体对侵害的反应的一种或多种体征，例如感染、环境侵害(包括香烟烟雾)、创伤或超敏反应。炎症可以是急性或慢性的，体征包括组织肿胀、不同类型的炎症细胞的募集、细胞因子和介质的释放以及支气管高反应性。炎症可以是局部的、亚临床的或暂时的，也可以是更广泛的并可为慢性的。炎症可包括体液免疫反应和细胞免疫反应，并且在触发炎症的侵害消除后可能会持续存在。炎症体征包括但不限于炎症细胞(例如树突状细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞)水平升高、促炎性细胞因子(例如tnfα、il-1β、il-6、il-8和ifnγ)及其受体水平升高、过量蛋白酶，包括mmp、ros和其它调节剂以及炎症标志物如c-反应蛋白(cfp)痰以及血清钙卫蛋白。短期(“急性”)炎症会导致气道肿胀、肺顺应性改变、气道反应性和粘液分泌过多，具有临床症状，包括呼吸频率增加和呼吸困难、喘鸣、咳嗽和fev1降低，如果持续存在(“慢性”)，会导致纤维化、囊性改变和支气管扩张形式的气道壁和肺实质结构破坏。
制备药物的方法
高浓度的螯合剂在制备用于治疗或预防肺部炎症的可吸入制剂中的用途。
可吸入螯合剂在制备用于以单剂量递送高浓度的用于治疗或预防肺部炎症的所述可吸入螯合剂的药物中的用途。
优选地，所述高浓度螯合剂以包含至少37.5mg/剂、至少50mg/剂、或50mg/剂至300mg/剂、或37.5mg/剂至300mg/剂的剂型提供。所述螯合剂每天给药一至四次，最多可以最多为约1,200mg/天，优选为至少150mg/天的总剂量给药。所述螯合剂优选为caedta。
试剂盒
本发明提供了一种用于治疗或预防肺部炎症的试剂盒，其包含(i)含有高浓度螯合剂的可吸入制剂；和(ii)使用说明书。
本发明提供了一种用于治疗或预防肺部炎症的试剂盒，其包含(i)能以单剂量递送高浓度的可吸入螯合剂的可吸入制剂；和(ii)使用说明书。
优选地，所述高浓度螯合剂以包含至少37.5mg/剂、至少50mg/剂、或37.5mg/剂至300mg/剂、或50mg/剂至300mg/剂的剂型提供。所述螯合剂每天给药一至四次，最多可以最多为约1,200mg/天，优选为至少150mg/天的总剂量给药。所述螯合剂优选为caedta。
在实施方案中，本发明的试剂盒包含制剂，所述制剂包含治疗有效量的高浓度吸入性螯合剂。在一个替代实施方案中，该制剂已预先计量、预先混合和/或预先包装。优选地，吸入溶液是无菌的。
本发明的试剂盒还包含旨在促进使用者顺从性的说明书。如本文所用，说明书指的是任何标签、插入物等，并且可以位于包装材料的一个或多个表面上，或者说明书可以在单独的图表上或其任何组合上提供。例如，在实施方案中，本发明的试剂盒包括用于给药本发明的制剂的说明书。在一个实施方案中，说明书指示本发明的制剂适合于治疗肺部炎症。此类说明书还可包括剂量说明，以及通过喷雾器或干粉吸入器给药的说明。
所述吸入性螯合剂和任何其他活性剂可以单独包装，以使从业者或使用者可以根据需要将它们各自配制成药物制剂。可替代地，包含吸入性螯合剂和任何其他活性剂的药物制剂可以包装在一起，从而形成从业者或使用者需要的最小剂量的制剂。无论如何，包装应保持活性成分的化学、物理和美学完整性。
通则
本领域技术人员将理解，本文描述的发明除了具体描述的之外还可以进行变化和修改。本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、制剂和化合物，以及任何或所有组合或任何两个或更多个步骤或特征。
本文中引用的每个文件、参考文献、专利申请或专利均通过全文引用的方式明确地并入本文，这意味着读者应将其作为本文的一部分来阅读并考虑。本文中所引用的文件、参考文献、专利申请或专利在本文中不再重复仅仅是出于简洁的原因。
在本文中或在通过引用并入本文的任何文档中提及的任何产品的任何制造商的说明、描述、产品规格和产品单，均通过引用并入本文，并且可以用于实施本发明。
本发明的范围不受本文所述的任何具体实施方案的限制。这些实施方案仅出于示例的目的。功能上等效的产品、制剂和方法显然在本文所述的本发明的范围内。
本文描述的发明可以包括一个或多个值的范围(例如尺寸、位移和场强等)。值的范围将被理解为包括该范围内的所有值，包括定义范围的值，以及与该范围相邻的值，这些值导致与紧邻于定义范围边界的那个值的值相同或基本相同的结果。因此，除非有相反的指示，否则说明书和权利要求书中列出的数字参数是近似值，其可以根据本发明试图获得的所需特性而变化。因此，“约80％”是指“约80％”，也指“80％”。至少，每个数字参数应根据有效数字的位数和普通的约数方法来解释。
在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”或变体如“包含”或“含有”将被理解为暗示包括所述整体或整体的组，但不排除任何其他整体或整体的组。还应注意，在本发明中，尤其是在权利要求和/或段落中，诸如“包括”、“包含”、“含有”等术语可以具有在美国专利法中赋予它的含义。例如，theycanmean“includes”,“included”,“including”,andthelike；并且“基本上由...组成”等术语具有美国专利法赋予它们的含义，例如，它们允许未明确叙述的元件，但排除了现有技术中发现的或影响本发明的基本或新颖特征的元件。
在本文中使用的所选术语的其他定义可以在本发明的详述中找到并且贯穿全文使用。除非另有定义，否则本文使用的所有其他科学和技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。术语“活性剂”可以表示一种活性剂，或者可以涵盖两种或更多种活性剂。
下列实施例用来更充分地描述使用上述发明的方式，并阐明为实现本发明的各个方面而设想的最佳模式。应当理解，这些方法绝不用于限制本发明的真实范围，而是出于说明性目的而提出。
实施例
在以下非限制性实施例中更充分地描述了本发明的其他特征。仅出于举例说明本发明的目的而包括本描述。不应将其理解为对如上所述的本发明的广泛描述的限制。
实施例1：通过给药高浓度的吸入性螯合剂治疗或预防肺部感染的方法
使用从上皮细胞系中收获的囊性纤维化粘液的悬浮液滴，在仿真的体外模型中生长生物被膜(haley等人bmcmicrobiol201212:181)。将铜绿假单胞菌临床菌株(mic妥布霉素>256μg/ml)的培养物在无碳源的m63中生长到静止期晚期，以模拟营养限制。
从倒置的ibidi盖玻片上悬浮粘液滴(5μl)，并接种103个菌落形成单位(cfu)，然后在35℃的潮湿环境中温育72小时，以使生物被膜发育。然后用雾化妥布霉素(20mg/ml)、雾化的caedta颗粒(10mg/ml)或两者同时处理5分钟。对照用雾化的0.9％盐水/水的50/50溶液处理。处理后，将液滴温育16小时，然后用baclightlive/dead(1μl)染色，并在多聚甲醛蒸气中固定30分钟。使用共聚焦显微镜观察生物被膜。
图1a显示厚而坚固的生物被膜，用雾化盐水处理后大部分是活细胞(绿色)。如对耐药性菌株所预期的那样，仅使用妥布霉素治疗对生存力影响很小。单独使用edta会造成一定程度的杀灭(红色细胞)。令人惊讶的是，妥布霉素和edta的组合杀死了绝大多数生物被膜细胞。图1b显示图1a中的显微图像的定量表示。对照生物被膜为1x108cfu/ml，而edta-妥布霉素处理过的生物被膜降低了>6个数量级，降至<102cfu/ml。
入院的病情加重的≥6岁cf患者，除常规静脉内注射抗生素和雾化妥布霉素治疗外，还随机接受edta或生理盐水(安慰剂)治疗。edta作为雾化溶液与妥布霉素一起给药，所述雾化溶液为4ml的0.9％盐水中的50mmcana2edta、111mmtris，ph7.1。随机化后，受试者在医院治疗两周，期间每天接受四次治疗(300mgedta/天，或最多3.3mgedta/kg/天)。然后患者出院并继续治疗，每天两次，持续四周。进一步监测患者四周，使总研究时间达到10周。
用雾化的3％高渗盐水以8-10l/min的速度诱导痰≥5分钟。在治疗之前以及在第2、6和10周时收集样品，然后根据相关方案进行处理，并保存于-80℃。从混有sputalysin(每克痰1ml)的透明痰中分离粘液，涡旋并温育一小时，然后放入脱脂乳甘油储存介质中，并储存于-80℃。
在最初的筛查中、以及然后在第3次访视(约2周后)、第5次访视(6周)、最后在随访时(10周)，通过排痰从受试者身上获得痰液样本。从透明的痰中分离粘液，用sputalysin(每克痰1ml)处理，然后放入脱脂乳甘油存储介质(1ml/100mg粘液)中，涡旋混合并储存于-80℃。
将样品在冰上融化，将系列稀释液从原始浓度最多稀释至10-7，并将20μl各稀释液分别置于mcconkey(mcc)琼脂或blood琼脂(ba)的三个平板中。培养板于35℃温育。
假单胞菌属被定义为mc琼脂平板上的透明或非常浅的粉红色的乳糖阴性菌落。粗糙形态菌落具有金属光泽和粗糙的菌落边缘，光滑形态菌落生长缓慢，在mc琼脂上具有规则的菌落边界，并且粘液样形态菌落被细菌分泌的大量藻酸盐包围。
在24小时时，分别在mcc琼脂平板和ba平板上计数粗糙、光滑和粘液样菌落的数量，将板再温育24小时，并进行每个菌落形态的确认计数。挑选每个样品中存在的每种形态的单个菌落，并在ba平板上划线，以获得纯培养物。
通过革兰氏染色进一步鉴定，以确认分离物由革兰氏阴性杆状细胞组成，并通过将菌落的一小部分擦到氧化酶测试条上来确认氧化酶阳性状态。深蓝色的快速发展表明存在氧化阳性分离物。
假单胞菌属的确认通过测试对c390抗生素的抗性进行。将经过抗生素浸渍的圆盘置于营养琼脂(na)平板上，该平板上铺有纯分离物在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的悬浮液，其mcfarland密度为0.5。在35℃过夜温育后，圆盘周围没有任何抑制区域，表明对抗生素具有抗性。挑选每个分离物中存在的每种形态学类型的被确认的铜绿假单胞菌属单菌落(可能是铜绿假单胞菌)并将其重悬浮在甘油/血清存储介质中，并于-80℃存储。图2显示与治疗时开始相比，第2周和第6周铜绿假单胞菌(mcc)的菌落计数变化。治疗两周后，edta组的菌落数减少>400倍，而安慰剂组为4.5倍。
实施例2：肺部炎症的治疗导致fev1的剂量依赖性增加
入院的病情加重的≥6岁cf受试者，除常规静脉内注射抗生素和雾化妥布霉素治疗外，还随机接受edta或生理盐水(安慰剂)治疗。edta作为雾化溶液与妥布霉素一起给药，所述雾化溶液为4ml的0.9％盐水中的50mmcana2edta、111mmtris，ph7.1。随机化后，受试者在医院治疗两周，期间每天接受四次治疗(300mgedta/天)。出院后继续治疗，每天两次，持续四周。进一步监测患者四周，使总研究时间达到10周。
在每次研究访视时，通过肺活量测定法测量肺功能。记录数据为三次尝试中最好的一次，结果以预测％表示。
图3a显示治疗开始后第2、6和10周两组的fev1的平均变化。edta组2周后fev1的平均增加为16％点，而安慰剂组为5％点。这种差异在治疗完成后四周持续存在，edta组增加了7％点，而安慰剂组增加了2％点。这表明edta组的肺功能明显改善，而安慰剂组变化不大。图3b显示edta组fev1改善与体重呈负相关(r2＝0.70)，但单独使用妥布霉素治疗的安慰剂组无相关性(r2＝0.01)。这表明edta对肺功能具有剂量依赖性作用(mgedta/kg体重)。
图4显示，向肺中递送75mgcaedta会导致在给药后5分钟edta的峰值浓度为0.41-1.34mm。
实施例3：香烟烟雾引起的肺部炎症可以通过对肺部给药高剂量的螯合剂来治疗
在慢性阻塞性肺疾病(copd)的小鼠模型中测试螯合剂对肺部炎症的作用。众所周知，香烟烟雾(cs)会诱发肺部炎症，其可以通过增加的白细胞计数和增加的肺重量来测量。
将雄性balb/c小鼠(每组8只)在两周的时间内暴露于一定剂量的香烟烟雾(3支香烟，周一至周五每天3次)或过滤后的室内空气中。在实验过程中，每次香烟烟雾暴露前30-60分钟，每天三次用铁螯合剂去铁胺(dfo，3.8mg，50μl)或媒介物鼻内处理小鼠。然后杀死小鼠，并评估气道和肺以确定对香烟烟雾引起的炎症的影响和元素浓度。
收集支气管肺泡灌洗液(balf)(约1ml/小鼠)，并通过手术切除肺并称重。通过将等体积的锥虫蓝与balf混合，并使用zeissaxioscope荧光显微镜在标准neubauer血细胞计数器上手动计数，来确定balf中的活细胞总数。使用激光烧蚀-电感耦合等离子体质谱法(la-icp-ms)通过元素分析、并与已知金属含量的标准品进行定量来测量铁。
图5表明，如预期的那样，香烟烟雾显著增加balf白细胞的总数。用铁螯合剂dfo处理会显著降低该效果。
与此相符的是，图6显示，使用香烟烟雾处理后，平均肺部重量显著增加，但是使用cfo进行处理可以防止这种作用。
如前文提到的，stites等人(amjrespircritcaremed.1999160(3):796-80)显示，与健康个体相比，cf患者的肺部和吸烟者的肺部的铁水平大幅升高。图7(左)证实暴露于香烟烟雾的小鼠的balf中平均铁水平显著提高，并且用dfo处理降低了balf中的平均铁含量。图7(右)结果表明，在用dfo治疗的7只小鼠中(其中一只因与治疗无关的原因而丢失)，有6只中的balf的铁含量与暴露于空气中的小鼠处于相同水平。
预示性实施例p1：高剂量干粉螯合剂对感染、炎症和氧化应激影响的体内研究
需要使用干粉妥布霉素治疗的cf受试者将分为四组，每天接受112mg干粉两次，持续28天。另外，组1(患者>18岁)接受递增剂量的干粉caedta(37.5mg每天两次持续1周；75mg每天两次持续2周，150mg每天两次持续1周)。组2(患者>18岁)接受caedta(37.5mg每天两次持续1周；75mg每天两次持续2周；75mg每天四次持续1周)。组3(患者12-18岁)接受caedta(37.5mg每天两次持续1周；75mg每天两次持续2周，150mg每天两次持续1周)。最后，对照组将仅接受妥布霉素治疗28天。
每周收集痰样品，评估感染和炎症的标志物。细菌将通过痰菌落计数进行监测。如前所述，使用明胶酶谱测定法和免疫测定法分别测定基质金属蛋白酶(mmp)和金属蛋白酶组织抑制剂(timp)的水平，以作为结构损伤的度量(gaggar等人,eurrespirj.201138(3):721–727；garratt等人,eurrespirj.201546(2):384-94)。如前所述，痰液中铁的含量通过icp-ms进行定量(hunter等人,mbio.20134(4):1-8)。使用免疫测定法评估铁结合蛋白的量。如前所述，作为嗜中性粒细胞炎症的量度，还测定了髓过氧化物酶活性(gaggar等人,eurrespirj.201138(3):721–727)。测量3-氯酪氨酸作为强氧化剂次氯酸的生物标志物。使用稳定的同位素稀释气相色谱仪和质谱仪测量水平(gaggar等人,eurrespirj.201138(3):721–727)。使用商业免疫测定试剂盒测量蛋白质羰基化合物作为活性氧(ros)的指标(gaggar等人,eurrespirj.201138(3):721–727)。如前所述，通过使用免疫测定法测量谷胱甘肽(gssg和gsh)来评估氧化应激(kettle等人,eurrespirj.201444(1):122-9)。炎症和氧化应激标志物(例如il-8，il-6，tnfa)的基因表达也将通过nanostring进行监测，蛋白质将通过elisa进行测定。氧化应激也可以通过代谢产物进行测定，例如丙二醛(比色测定)或8-异前列腺素(elisa)。铁将通过元素分析使用激光烧蚀-电感耦合等离子体质谱法进行测量(la-icp-ms)。
可以预期，与安慰剂组相比，该实验将显示edta组中的炎症标志物减少，铁水平降低。可以进一步预期该实验将显示mmp和timp之间，尤其是mmp-9和timp-1之间的平衡变化，其与支气管扩张的进展有关。
进一步预期该实验将显示与对照患者相比，用edta治疗的受试者的fev1增加，其痰液中细菌负载减少。
预示性实施例p2：高剂量螯合剂对炎症、肺损伤和氧化应激的影响的体外研究
肺上皮细胞在组织培养物中生长，并且通过暴露于fe(ii)或过量氧气而诱导炎症。细胞用caedta(0、1、5、10、25、50mm)处理30分钟、1、3、24和48小时。
免疫测定法用于监测炎症标志物如il-6、il-8、tnf-α、中性粒细胞弹性蛋白酶等的变化。氧化应激和毒性是通过根据tunel测定法评估谷胱甘肽(gsh)水平的降低和细胞凋亡来测量的，二者均使用商业测定试剂盒如，thermofisherscientific的谷胱甘肽荧光检测试剂盒和biovisioninc.的tuneldna片段(gragmentation)分析试剂盒。
可以预期，该实验将显示，与对照相比，edta处理的细胞中炎症标志物浓度依赖性的降低；gsh的减少指示与对照相比，edta处理的细胞中活性氧的减少；且与对照相比，如tunel测定法所测量的，edta处理的细胞中的细胞凋亡减少。
预示性实施例p3：高剂量雾化螯合剂对炎症、肺损伤和氧化应激影响的体内研究
入院的病情加重的≥6岁cf受试者，除常规静脉内注射抗生素和雾化妥布霉素治疗外，还随机接受雾化edta或生理盐水(安慰剂)治疗。edta作为雾化溶液与妥布霉素一起给药，所述雾化溶液为4ml的0.9％盐水中的50mmcana2edta、111mmtris，ph7.1。
随机化后，受试者在医院治疗两周，期间每天接受四次治疗(300mgedta/天，或最多3.3mgedta/kg/天)。然后患者出院并继续治疗，每天两次，持续四周。进一步监测患者四周，使总研究时间达到10周。痰液通过用雾化的3％高渗盐水以8-10l/min的速度诱导≥5分钟来收集。在治疗之前以及在第2、6和10周时收集样品，然后根据相关方案进行处理，并保存于-80℃。
·炎症标志物表达
咳出的痰液储存在
可以预期，该实验将显示，与安慰剂组相比，edta组中炎症标志物基因表达平均下降。
·细胞损伤、游离铁和氧化应激
将咳出的痰液不处理直接冷冻，并按上述方法检测炎症标志物。如前所述，作为结构损伤的度量，分别使用明胶酶谱法和免疫测定法测量基质金属蛋白酶(mmp)和金属蛋白酶组织抑制剂(timp)的水平(gaggar等人,eurrespirj.201138(3):721–727；garratt等人,eurrespirj.201546(2):384-94)。如前所述，痰液中铁的含量通过icp-ms进行定量(hunter等人,mbio.20134(4):1-8)。使用免疫测定法评估铁结合蛋白的量。如前所述，通过使用免疫测定法测量谷胱甘肽(gssg和gsh)来评估氧化应激(kettle等人,eurrespirj.201444(1):122-9)。
可以预期，该实验将显示，与安慰剂组相比，edta组中炎症标志物减少。可以进一步预期该实验将显示mmp和timp之间，尤其是mmp-9和timp-1之间的平衡变化，其与支气管扩张的进展有关。
预示性实施例p4：高剂量螯合剂对炎症、肺部损伤和氧化应激影响的体内研究
对囊性纤维化受试者进行了单中心、随机、双盲、交叉研究。受试者随机接受吸入性caedta或盐水(安慰剂)治疗两周。接下来是冲洗阶段，然后是持续两周的其它治疗(edta或安慰剂)。
如上所述监测铁水平、炎症标志物、mmp/timp和fev1。如前所述，还测定了作为嗜中性粒细胞炎症的量度的髓过氧化物酶活性(gaggar等人,eurrespirj.201138(3):721–727)。将3-氯酪氨酸作为强氧化剂次氯酸的生物标志物来测定。使用稳定的同位素稀释气相色谱仪和质谱仪测量水平(gaggar等人,eurrespirj.201138(3):721–727)。使用商业免疫测定试剂盒测量蛋白质羰基化合物作为活性氧(ros)的指标(gaggar等人,eurrespirj.201138(3):721–727)。
可以预期，与用安慰剂治疗相比，用edta治疗的受试者的铁和炎症标志物水平降低、mmp/timp平衡改变、平均fev1升高。可以进一步预期该实验将显示降低的髓过氧化物酶活性和较低的氯酪氨酸和羰基平均水平。
临床数据显示以300mg/天持续两周的疗效。同一项研究表明150mg/天(75mg每天两次)对肺功能和感染有益(图2为降低的细菌计数；图3a为改善的肺功能)。如本领域技术人员所理解的，根据改善的显著程度(fev1平均为16％点)，很可能更低的剂量，即75mg/天(37.5mg每天两次)，是有效的，如预示性实施例p1所设想。
图4显示，单一剂量的75mgcaedta在30分钟后可导致在粘液栓内部高达1.34mm的edta。众所周知，妥布霉素等药物进入cf痰的渗透是显著受阻的(kuhn,r.j.(2001)。formulationofaerosolizedtherapeutics.chest120,94s-98s)，因此，气道表面液体中edta的浓度极有可能大大高于中心。因此，可以合理地预期，37.5mg的每日剂量(比具有临床益处的较低剂量低4倍)将在一项完全研究中显示出疗效。在年轻患者的情况下尤其如此，其接受每单位体重更高的剂量且通常在fev1中表现出更大的反应(图3b)。
基于与所公开的发明有关的以上指导，在不脱离基本发明构思的情况下，对于本领域技术人员而言，实现本发明的各种实施方案的上述模式的多种变化和修改对于本领域技术人员将是显而易见的。本发明的上述实施例仅是示例性的，不应解释为任何方式的限制，并且所有这样的变化和修改都应视为在本发明的范围内，其性质应从前述描述中确定。
来自囊性纤维化治疗基金会(cysticfibrosisfoundationtherapeutics)的奖励支持了本发明的工作。
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