使用氮杂双环式化合物的癌症化学疗法的制作方法
本发明涉及将氮杂双环式化合物或其盐与免疫检查点分子调节剂组合而成的抗肿瘤剂、抗肿瘤效果增强剂和试剂盒制剂、以及以氮杂双环式化合物或其盐为有效成分的免疫赋活剂。
背景技术：
被称为分子伴侣的一组蛋白质在促进和维持其他蛋白质的功能性的结构的形成、促进正确的结合、抑制不必要的聚集、避免分解、促进分泌等诸多方面发挥功能(非专利文献1)。hsp90是在细胞内以总可溶性蛋白质的约1～2％的量丰富存在的分子伴侣，但与其他的伴侣蛋白不同，对于大部分的多肽的生物合成而言并不是必须的(非专利文献1)。作为与hsp90相互作用、控制其结构形成和稳定性的主要的客户蛋白(clientprotein)，已知信号转导相关因子(例如erbb1/egfr、erbb2/her2、met、igf1r、kdr/vegfr、flt3、zap70、kit、chuk/ikk、braf、raf1、src、akt)、细胞周期调控因子(例如cdk4、cdk6、cyclind、plk1、birc5)、转录调控因子(例如hif－1α、p53、androgenreceptor、estrogenreceptor、progesteronereceptor)(非专利文献2、3)。hsp90维持这些蛋白质的正常的功能，因而与细胞的增殖、生存密切相关。并且，引发癌变或癌恶化的突变型或嵌合型的因子(例如bcr－abl、npm－alk)的正常的功能需要hsp90，因此，特别是在癌变、癌的生存、增殖、恶化、转移等过程中，表现出hsp90的重要性(非专利文献2)。
在利用格尔德霉素(geldanamycin)等特异性抑制剂抑制hsp90的伴侣功能时，发生客户蛋白的钝化和不稳定化，结果引发细胞的增殖停止或凋亡(非专利文献4)。在hsp90的生理功能方面，hsp90抑制剂具有同时抑制与癌的生存、增殖相关的多个信号转导通路的特征，因而hsp90抑制剂可以作为广泛且具有有效的抗癌作用的药剂。另外，来自癌细胞的hsp90的活性比来自正常细胞的hsp90高，对于atp和抑制剂的亲和性高，基于这样的见解，期待着hsp90抑制剂成为癌选择性高的药剂(非专利文献5)。
另一方面，免疫系统是对于来自生物体内外的各种各样的疾病进行自我防御的重要的机制。由于免疫系统功能低下，会引起发生因细菌或病毒而造成的感染症、发生肿瘤、伤病恢复缓慢等对疾病的不良影响。因此，使免疫系统活化对于各种各样的疾病的予防和治疗而言是非常重要的。于是，作为新的癌症治疗法之一，癌免疫疗法的开发逐步进展。
适应的免疫反应的活化通过抗原肽－mhc复合物与t细胞受体(tcr)的结合而开始。该结合进一步由通过共刺激分子b7家族与其受体cd28家族间的结合所引起的协同刺激(costimulation)或联合抑制(coinhibition)决定。即，为了t细胞的抗原特异化的活化，需要2个特征的信号转导事件(event)，不受来自b7家族的共刺激、而仅受抗原刺激的t细胞呈现无反应状态(anergy)，免疫耐受性被诱导。
癌细胞正是利用该机理，抑制抗原特异性的t细胞的活化，从而逃避免疫监控机制而持续增殖。因此，可以认为通过利用协同刺激的强化和联合抑制的阻断来诱导癌症患者的生物体内的抗肿瘤免疫响应、控制肿瘤的免疫逃逸，对于癌症治疗是有效的，提出了各种以协同刺激分子(刺激性的共刺激分子)或联合抑制分子(抑制性的共刺激分子)为标的的癌症免疫疗法(非专利文献6)。例如，作为通过抑制pd－1与其配基(pd－l1和pd－l2)的结合而使t细胞活化的免疫检查点分子调节剂，纳武单抗(对于人pd－1的人型igg4单克隆抗体)被用于恶性黑色素瘤等的治疗(专利文献1、非专利文献7)。
后述的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐已知可以作为hsp90抑制剂(专利文献2)，迄今为止报道了该hsp90抑制剂与其他的抗肿瘤剂的组合(专利文献3)。
但是，并未进行将该hsp90抑制剂与免疫检查点分子调节剂并用。并且，该hsp90抑制剂的免疫赋活作用也是未知的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2004/004771号
专利文献2：国际公开第2011/004610号
专利文献3：国际公开第2015/046498号
非专利文献
非专利文献1：nat.rev.cancer，5：761－772(2005)
非专利文献2：trendsmol.med.，10：283－290(2004)
非专利文献3：clin.cancerres.，15：9－14(2009)
非专利文献4：curr.opin.pharmacol.，8：370－374(2008)
非专利文献5：drugresist.updat.，12：17－27(2009)
非专利文献6：nat.rev.cancer，12：252－264(2012)
非专利文献7：n.engl.j.med.，366：2443－2454(2012)
技术实现要素：
发明要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题在于提供表现出非常优异的抗肿瘤效果、副作用少的新的癌症治疗方法。
用于解决技术问题的技术手段
因此，本发明的发明人将通式(i)所示的氮杂双环式化合物与免疫检查点分子调节剂组合，研究抗肿瘤效果，结果发现与单独使用药剂的情况相比，抗肿瘤效果显著增强且不会引发严重的副作用。
还发现氮杂双环式化合物具有免疫赋活作用。
即，本发明提供以下的发明〔1〕～〔64〕。
〔1〕一种抗肿瘤剂，其特征在于，并用给予下述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐、和免疫检查点分子调节剂。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔2〕如〔1〕所述的抗肿瘤剂，其中，氮杂双环式化合物是如下化合物，
该化合物是：
在通式(i)中，
x1为ch或n；
x2为n，x3和x4为ch；
y1和y3为ch，y2和y4的任一个或两个为c－r4，其他的为ch；
r1为可以具有取代基的1h－咪唑－1－基、可以具有取代基的吡唑－4－基、可以具有取代基的噻吩－3－基、可以具有取代基的呋喃－2－基、可以具有取代基的吡啶－3－基、可以具有取代基的吡啶－4－基、可以具有取代基的吲哚－5－基、可以具有取代基的1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－5－基、可以具有取代基的苯并呋喃－2－基、可以具有取代基的喹啉－3－基、可以具有取代基的5，6，7，8－四氢喹啉－3－基中的任意基团；
r2为可以具有卤原子的碳原子数1～6的烷基或碳原子数2～6的烯基；
r3为－co－r5；
r4为卤原子、可以具有单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基或者具备n、s、o中的任意1个或2个杂原子的单环性的5～7元的饱和杂环基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5为氨基、或者单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基；
r6为氢原子或可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基；
r7为氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的碳原子数7～12的芳烷基、可以具有取代基的碳原子数6～14的芳香族烃基、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的可以具有取代基的饱和杂环基、或者具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7与它们所键合的氮原子一起形成5～7元的饱和杂环基；r8为可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的碳原子数6～14的芳香族烃基；r9为氢原子、羟基、氨基、或者单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基。
〔3〕如〔1〕或〔2〕所述的抗肿瘤剂，其中，氮杂双环式化合物为3－乙基－4－{3－异丙基－4－(4－(1－甲基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基)－1h－吡唑并[3，4－b]吡啶－1－基}苯甲酰胺。
〔4〕如〔1〕～〔3〕中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，免疫检查点分子调节剂为选自pd－1通路拮抗剂、icos通路激动剂、ctla－4通路拮抗剂和cd28通路激动剂中的至少一种以上。
〔5〕如〔1〕～〔4〕中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，免疫检查点分子调节剂为选自pd－1通路拮抗剂、ctla－4通路拮抗剂和cd28通路激动剂中的至少一种以上。
〔6〕如〔1〕～〔5〕中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，免疫检查点分子调节剂为选自pd－1通路拮抗剂和ctla－4通路拮抗剂中的至少一种以上。
〔7〕如〔1〕～〔6〕中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，免疫检查点分子调节剂为pd－1通路拮抗剂。
〔8〕如〔4〕～〔7〕中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，pd－1通路拮抗剂为选自抗pd－1抗体、抗pd－l1抗体和抗pd－l2抗体中的至少一种以上。
〔9〕如〔8〕所述的抗肿瘤剂抗，其中，抗pd－1抗体为选自纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)中的至少一种以上，抗pd－l1抗体为选自阿特珠单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)和阿维鲁单抗(avelumab)中的至少一种以上。
〔10〕如〔4〕～〔6〕中任一项所述的抗肿瘤剂，其中，ctla－4通路拮抗剂为抗ctla－4抗体。
〔11〕如〔10〕所述的抗肿瘤剂，其中，抗ctla－4抗体为选自伊匹单抗(ipilimumab)和替西木单抗(tremelimumab)中的至少一种以上。
〔12〕一种免疫检查点分子调节剂的抗肿瘤效果增强剂，其以下述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐为有效成分。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔13〕一种抗肿瘤剂，其用于对给予了免疫检查点分子调节剂的癌症患者进行治疗，所述抗肿瘤剂含有氮杂双环式化合物或其盐，其中，氮杂双环式化合物为下述通式(i)所示的化合物。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基；或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔14〕一种抗肿瘤剂，其用于对给予了氮杂双环式化合物或其盐的癌症患者进行治疗，所述抗肿瘤剂包括免疫检查点分子调节剂，其中，氮杂双环式化合物是下述通式(i)所示的化合物。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔15〕一种抗肿瘤剂，其是将氮杂双环式化合物或其盐和免疫检查点分子调节剂组合而成的抗肿瘤剂，其中，氮杂双环式化合物为下述通式(i)所示的化合物。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔16〕一种免疫赋活剂，其以下述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐为有效成分。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔17〕一种氮杂双环式化合物或其盐，其用于与免疫检查点分子调节剂并用给予以治疗肿瘤，其中，氮杂双环式化合物由下述通式(i)表示。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔18〕如〔17〕所述的氮杂双环式化合物或其盐，其中，氮杂双环式化合物是如下化合物，
该化合物是：
在通式(i)中，x1为ch或n；
x2为n，x3和x4为ch；
y1和y3为ch，y2和y4的任一个或两个为c－r4，其他的为ch；
r1为可以具有取代基的1h－咪唑－1－基、可以具有取代基的吡唑－4－基、可以具有取代基的噻吩－3－基、可以具有取代基的呋喃－2－基、可以具有取代基的吡啶－3－基、可以具有取代基的吡啶－4－基、可以具有取代基的吲哚－5－基、可以具有取代基的1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－5－基、可以具有取代基的苯并呋喃－2－基、可以具有取代基的喹啉－3－基、可以具有取代基的5，6，7，8－四氢喹啉－3－基中的任意基团；
r2为可以具有卤原子的碳原子数1～6的烷基或碳原子数2～6的烯基；
r3为－co－r5；
r4为卤原子、可以具有单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基或者具备n、s、o中的任意1个或2个杂原子的单环性的5～7元的饱和杂环基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5为氨基、或者单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基；
r6为氢原子或可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基；
r7为氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的碳原子数7～12的芳烷基、可以具有取代基的碳原子数6～14的芳香族烃基、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的可以具有取代基的饱和杂环基、或者具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的可以具有取代基的不饱和杂环基，r6和r7与它们所键合的氮原子一起形成5～7元的饱和杂环基；r8为可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的碳原子数6～14的芳香族烃基；r9为氢原子、羟基、氨基、或者单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基。
〔19〕如〔17〕或〔18〕所述的氮杂双环式化合物或其盐，其中，氮杂双环式化合物为3－乙基－4－{3－异丙基－4－(4－(1－甲基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基)－1h－吡唑并[3，4－b]吡啶－1－基}苯甲酰胺。
〔20〕如〔17〕～〔19〕中任一项所述的氮杂双环式化合物或其盐，其中，免疫检查点分子调节剂为选自pd－1通路拮抗剂、icos通路激动剂、ctla－4通路拮抗剂和cd28通路激动剂中的至少一种以上。
〔21〕如〔17〕～〔20〕中任一项所述的氮杂双环式化合物或其盐，其中，免疫检查点分子调节剂为选自pd－1通路拮抗剂、ctla－4通路拮抗剂和cd28通路激动剂中的至少一种以上。
〔22〕如〔17〕～〔21〕中任一项所述的氮杂双环式化合物或其盐，其中，免疫检查点分子调节剂为选自pd－1通路拮抗剂和ctla－4通路拮抗剂中的至少一种以上。
〔23〕如〔17〕～〔22〕中任一项所述的氮杂双环式化合物或其盐，其中，免疫检查点分子调节剂为pd－1通路拮抗剂。
〔24〕如〔20〕～〔23〕中任一项所述的氮杂双环式化合物或其盐，其中，pd－1通路拮抗剂为选自抗pd－1抗体、抗pd－l1抗体和抗pd－l2抗体中的至少一种以上。
〔25〕如〔24〕所述的氮杂双环式化合物或其盐，其中，抗pd－1抗体为选自纳武单抗和派姆单抗中的至少一种以上，抗pd－l1抗体为选自阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗中的至少一种以上。
〔26〕如〔20〕～〔22〕中任一项所述的氮杂双环式化合物或其盐，其中，ctla－4通路拮抗剂为抗ctla－4抗体。
〔27〕如〔26〕所述的氮杂双环式化合物或其盐，其中，抗ctla－4抗体为选自伊匹单抗和替西木单抗中的至少一种以上。
〔28〕一种氮杂双环式化合物或其盐，其用于增强免疫检查点分子调节剂的抗肿瘤效果，其中，氮杂双环式化合物由下述通式(i)表示。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔29〕一种氮杂双环式化合物或其盐，其用于在给予了免疫检查点分子调节剂的癌症患者的肿瘤治疗中使用，其中，氮杂双环式化合物由下述通式(i)表示。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔30〕一种免疫检查点分子调节剂，其用于在给予了氮杂双环式化合物或其盐的癌症患者的肿瘤治疗中使用，其中，氮杂双环式化合物为下述通式(i)所示的化合物。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔31〕一种氮杂双环式化合物或其盐与免疫检查点分子调节剂的组合，其用于肿瘤的治疗，其中，氮杂双环式化合物由下述通式(i)表示。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔32〕一种氮杂双环式化合物或其盐，其用于免疫赋活，其中，氮杂双环式化合物由下述通式(i)表示。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔33〕氮杂双环式化合物或其盐的用途，其为用于制造与免疫检查点分子调节剂并用给予的抗肿瘤剂的用途，其中，氮杂双环式化合物由下述通式(i)表示。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔34〕如〔33〕所述的氮杂双环式化合物或其盐的用途，其中，氮杂双环式化合物是如下化合物，
该化合物是：
在通式(i)中，x1为ch或n；
x2为n，x3和x4为ch；
y1和y3为ch，y2和y4的任一个或两个为c－r4，其他的为ch；
r1为可以具有取代基的1h－咪唑－1－基、可以具有取代基的吡唑－4－基、可以具有取代基的噻吩－3－基、可以具有取代基的呋喃－2－基、可以具有取代基的吡啶－3－基、可以具有取代基的吡啶－4－基、可以具有取代基的吲哚－5－基、可以具有取代基的1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－5－基、可以具有取代基的苯并呋喃－2－基、可以具有取代基的喹啉－3－基、可以具有取代基的5，6，7，8－四氢喹啉－3－基中的任意基团；
r2为可以具有卤原子的碳原子数1～6的烷基或碳原子数2～6的烯基；
r3为－co－r5；
r4为卤原子、可以具有单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基或者具备n、s、o中的任意1个或2个杂原子的单环性的5～7元的饱和杂环基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5为氨基、或者单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基；
r6为氢原子或可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基；
r7为氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的碳原子数7～12的芳烷基、可以具有取代基的碳原子数6～14的芳香族烃基、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的可以具有取代基的饱和杂环基、或者具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7与它们所键合的氮原子一起形成5～7元的饱和杂环基；r8为可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的碳原子数6～14的芳香族烃基；r9为氢原子、羟基、氨基、或者单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基。
〔35〕如〔33〕或〔34〕所述的氮杂双环式化合物或其盐的用途，其中，氮杂双环式化合物为3－乙基－4－{3－异丙基－4－(4－(1－甲基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基)－1h－吡唑并[3，4－b]吡啶－1－基}苯甲酰胺。
〔36〕如〔33〕～〔35〕中任一项所述的氮杂双环式化合物或其盐的用途，其中，免疫检查点分子调节剂为选自pd－1通路拮抗剂、icos通路激动剂、ctla－4通路拮抗剂和cd28通路激动剂中的至少一种以上。
〔37〕如〔33〕～〔36〕中任一项所述的氮杂双环式化合物或其盐的用途，其中，免疫检查点分子调节剂为选自pd－1通路拮抗剂、ctla－4通路拮抗剂和cd28通路激动剂中的至少一种以上。
〔38〕如〔33〕～〔37〕中任一项所述的氮杂双环式化合物或其盐的用途，其中，免疫检查点分子调节剂为选自pd－1通路拮抗剂和ctla－4通路拮抗剂中的至少一种以上。
〔39〕如〔33〕～〔38〕中任一项所述的氮杂双环式化合物或其盐的用途，其中，免疫检查点分子调节剂为pd－1通路拮抗剂。
〔40〕如〔36〕～〔39〕中任一项所述的氮杂双环式化合物或其盐的用途，其中，pd－1通路拮抗剂为选自抗pd－1抗体、抗pd－l1抗体和抗pd－l2抗体中的至少一种以上。
〔41〕如〔40〕所述的氮杂双环式化合物或其盐的用途，其中，抗pd－1抗体为选自纳武单抗和派姆单抗中的至少一种以上，抗pd－l1抗体为选自阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗中的至少一种以上。
〔42〕如〔36〕～〔38〕中任一项所述的氮杂双环式化合物或其盐的用途，其中，ctla－4通路拮抗剂为抗ctla－4抗体。
〔43〕抗ctla－4抗体为选自伊匹单抗和替西木单抗中的至少一种以上〔42〕所述的氮杂双环式化合物或其盐的用途。
〔44〕氮杂双环式化合物或其盐的用途，其为用于制造增强免疫检查点分子调节剂的抗肿瘤效果的抗肿瘤效果增强剂的用途，其中，氮杂双环式化合物由下述通式(i)表示。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔45〕氮杂双环式化合物或其盐的用途，其为用于制造对给予了免疫检查点分子调节剂的癌症患者进行治疗的抗肿瘤剂的用途，其中，氮杂双环式化合物由下述通式(i)表示。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔46〕免疫检查点分子调节剂的用途，其为用于制造对给予了氮杂双环式化合物或其盐的癌症患者进行治疗的抗肿瘤剂的用途，其中，氮杂双环式化合物为下述通式(i)所示的化合物。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔47〕氮杂双环式化合物或其盐和免疫检查点分子调节剂用于制造抗肿瘤剂的用途，其中，氮杂双环式化合物由下述通式(i)表示。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔48〕氮杂双环式化合物或其盐用于制造免疫赋活剂的用途，其中，氮杂双环式化合物由下述通式(i)表示。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔49〕一种肿瘤的治疗方法，其包括对需要治疗肿瘤的对象并用给予下述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐、和免疫检查点分子调节剂的步骤。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔50〕如〔49〕所述的方法，其中，氮杂双环式化合物是如下化合物，
该化合物是：
在通式(i)中，x1为ch或n；
x2为n，x3和x4为ch；
y1和y3为ch，y2和y4的任一个或两个为c－r4，其他的为ch；
r1为可以具有取代基的1h－咪唑－1－基、可以具有取代基的吡唑－4－基、可以具有取代基的噻吩－3－基、可以具有取代基的呋喃－2－基、可以具有取代基的吡啶－3－基、可以具有取代基的吡啶－4－基、可以具有取代基的吲哚－5－基、可以具有取代基的1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－5－基、可以具有取代基的苯并呋喃－2－基、可以具有取代基的喹啉－3－基、可以具有取代基的5，6，7，8－四氢喹啉－3－基中的任意基团；
r2为可以具有卤原子的碳原子数1～6的烷基或碳原子数2～6的烯基；
r3为－co－r5；
r4为卤原子、可以具有单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基或者具备n、s、o中的任意1个或2个杂原子的单环性的5～7元的饱和杂环基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5为氨基、或者单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基；
r6为氢原子或可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基；
r7为氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的碳原子数7～12的芳烷基、可以具有取代基的碳原子数6～14的芳香族烃基、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的可以具有取代基的饱和杂环基、或者具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7与它们所键合的氮原子一起形成5～7元的饱和杂环基；r8为可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的碳原子数6～14的芳香族烃基；r9为氢原子、羟基、氨基、或者单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基。
〔51〕如〔49〕或〔50〕所述的方法，其中，氮杂双环式化合物为3－乙基－4－{3－异丙基－4－(4－(1－甲基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基)－1h－吡唑并[3，4－b]吡啶－1－基}苯甲酰胺。
〔52〕如〔49〕～〔51〕中任一项所述的方法，其中，免疫检查点分子调节剂为选自pd－1通路拮抗剂、icos通路激动剂、ctla－4通路拮抗剂和cd28通路激动剂中的至少一种以上。
〔53〕如〔49〕～〔52〕中任一项所述的方法，其中，免疫检查点分子调节剂为选自pd－1通路拮抗剂、ctla－4通路拮抗剂和cd28通路激动剂中的至少一种以上。
〔54〕如〔49〕～〔53〕中任一项所述的方法，其中，免疫检查点分子调节剂为选自pd－1通路拮抗剂和ctla－4通路拮抗剂中的至少一种以上。
〔55〕如〔49〕～〔54〕中任一项所述的方法，其中，免疫检查点分子调节剂为pd－1通路拮抗剂。
〔56〕如〔49〕～〔55〕中任一项所述的方法，其中，pd－1通路拮抗剂为选自抗pd－1抗体、抗pd－l1抗体和抗pd－l2抗体中的至少一种以上。
〔57〕如〔56〕所述的方法，其中，抗pd－1抗体为选自纳武单抗和派姆单抗中的至少一种以上，抗pd－l1抗体为选自阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗中的至少一种以上。
〔58〕如〔52〕～〔54〕中任一项所述的方法，其中，ctla－4通路拮抗剂为抗ctla－4抗体。
〔59〕如〔58〕所述的方法，其中，抗ctla－4抗体为选自伊匹单抗和替西木单抗中的至少一种以上。
〔60〕一种免疫检查点分子调节剂的抗肿瘤效果的增强方法，其包括对需要增强免疫检查点分子调节剂的抗肿瘤效果的对象给予下述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的步骤。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔61〕一种给予了免疫检查点分子调节剂的癌症患者的肿瘤治疗方法，其包括对需要治疗肿瘤的对象给予下述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的步骤，
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔62〕一种给予了氮杂双环式化合物或其盐的癌症患者的肿瘤治疗方法，其包括对需要治疗肿瘤的对象给予免疫检查点分子调节剂的步骤，其中，氮杂双环式化合物为下述通式(i)所示的化合物。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔63〕一种肿瘤的治疗方法，其包括对需要治疗肿瘤的对象给予下述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐、与免疫检查点分子调节剂的组合的步骤。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
〔64〕一种免疫赋活方法，其包括对需要免疫赋活的对象给予下述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的步骤。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
本发明还涉及以下方式。
·一种含有上述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐、和免疫检查点分子调节剂的用于肿瘤的予防和/或治疗的医药组合物。
·一种用于增强免疫检查点分子调节剂的抗肿瘤效果的上述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐。
·上述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐用于增强免疫检查点分子调节剂的抗肿瘤效果的用途。
·上述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐用于制造免疫检查点分子调节剂的抗肿瘤效果增强剂的用途。
·一种肿瘤的予防和/或治疗方法，其包括将上述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐与免疫检查点分子调节剂组合，对患者给予对于予防和/或治疗而言有效量的步骤。
·一种肿瘤的予防和/或治疗方法，其包括对给予了免疫检查点分子调节剂的癌症患者，给予对于予防和/或治疗而言有效量的上述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的步骤。
·一种抗肿瘤效果增强方法，其包括对给予了免疫检查点分子调节剂的癌症患者，给予对于予防和/或治疗而言有效量的上述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其的步骤。
·一种制品，其作为用于在予防和/或治疗肿瘤时同时地、依次地、或隔开间隔地使用的组合制剂，该制品含有上述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐、和免疫检查点分子调节剂。
·一种用于免疫赋活的上述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐。
·上述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐用于免疫赋活的用途。
·上述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐用于制造免疫赋活剂的用途。
·一种免疫赋活方法，其包括对需要免疫赋活的患者给予有效量的上述通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的步骤。
发明效果
利用本发明的抗肿瘤剂，能够进行可抑制副作用产生、并且获得很高的抗肿瘤效果(特别是缩小肿瘤的效果、延缓肿瘤增殖的效果(延长生命的效果))的癌症治疗。从而使癌症患者的生存期延长。
并且，利用本发明的免疫赋活剂，可以期待能够通过免疫赋活得到改善的疾病(各种感染症、免疫缺陷疾病等)的新的疗法。
附图说明
图1：化合物1+抗小鼠pd－1抗体的组合在移植了小鼠大肠癌株mc38的小鼠模型中的效果。
图2：a为在肿瘤浸润白细胞中，t细胞中的抑制性t细胞的比例；b为肿瘤浸润白细胞中的cd8阳性细胞的比例。
图3：化合物1+抗小鼠pd－l1抗体的组合在移植了小鼠大肠癌株mc38的小鼠模型中的效果。
图4：化合物1+抗小鼠ctla－4抗体的组合在移植了小鼠大肠癌株mc38的小鼠模型中的效果。
具体实施方式
本发明涉及特征在于并用给予通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐、和免疫检查点分子调节剂(特别是抗pd－1抗体、抗pd－l1抗体、抗ctla－4抗体)的抗肿瘤剂、抗肿瘤效果增强剂、试剂盒制剂和这些制剂的用途、肿瘤治疗方法、抗肿瘤效果增强方法、以及免疫赋活剂。
在本发明中，氮杂双环式化合物由下述通式(i)表示。
(式中，x1表示ch或n；
x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch；
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n；
r1表示可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基；
r2表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基；
r3表示氰基或－co－r5；
r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；
r5表示可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基；
r6和r7相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的卤代烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的芳烷基、可以具有取代基的芳香族烃基、可以具有取代基的饱和杂环基或可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成饱和杂环基；
r8表示可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的芳香族烃基；
r9表示氢原子、羟基、可以具有羟基的氨基、或者可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基。)
在本申请说明书中，作为“取代基”，例如可以列举卤原子、羟基、氰基、硝基、烷基、卤代烷基、环烷基、环烷基－烷基、芳烷基、羟烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤代烷氧基、烷氧基－烷基、环烷氧基、环烷基－烷氧基、芳烷氧基、芳烷氧基－烷基、烷硫基、环烷基－烷硫基、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基、环烷基－烷基氨基、酰基、酰氧基、氧基(oxogroup)、羧基、烷氧基羰基、芳烷氧基羰基、氨甲酰基、饱和或不饱和杂环基、芳香族烃基、饱和杂环氧基等，在存在上述取代基的情况下，其个数典型地为1～3个。
在上述取代基中，作为卤原子，可以列举氯原子、溴原子、氟原子、碘原子。
在上述的取代基中，作为烷基、卤代烷基，优选表示碳原子数1～6的直链状或支链状的烷基、或者这些烷基中的1个～全部的氢原子被上述卤原子取代的基团，可以列举：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等烷基；三氟甲基等卤代烷基。
在上述的取代基中，作为环烷基，优选为碳原子数3～7的环烷基，可以列举环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基。
在上述的取代基中，作为环烷基－烷基，优选为被碳原子数3～7的环烷基取代的碳原子数1～6的烷基，可以列举环丙基甲基、环丙基乙基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。
在上述的取代基中，作为芳烷基，优选表示被碳原子数6～14的芳香族烃基取代的碳原子数1～6的直链状或支链状的烷基，可以列举苯甲基、苯乙基、苯丙基、萘甲基、萘乙基等。
在上述的取代基中，作为羟烷基，优选表示具有羟基的上述的碳原子数1～6的直链状或支链状的烷基，可以列举羟甲基、羟乙基等。
在上述的取代基中，作为烯基，表示包含碳－碳双键的、优选碳原子数2～6的烯基，可以列举乙烯基、烯丙基、甲基乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。
在上述的取代基中，作为炔基，表示包含碳－碳三键的、优选碳原子数2～6的炔基，可以列举乙炔基、丙炔基等。
在上述的取代基中，作为烷氧基、卤代烷氧基，优选表示碳原子数1～6的直链状或支链状的烷氧基、或者这些烷氧基被上述卤原子取代的基团，可以列举甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、1－甲基丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、2－甲基－丁氧基、新戊氧基、戊烷－2－基氧基、氟代甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、1，1－二氟乙氧基、2，2－二氟乙氧基、2，2，2－三氟乙氧基、1，1，2，2－四氟乙氧基、全氟乙氧基、3－氟－2－(氟甲基)－丙氧基、1，3－二氟丙烷－2－基氧基、2，2，3，3，3－五氟－1－丙氧基等。
在上述的取代基中，作为环烷氧基，优选为碳原子数3～7的环烷氧基，可以列举环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基、环庚氧基。
在上述的取代基中，作为烷氧基－烷基，优选表示被上述的碳原子数1～6的直链状或支链状的烷氧基取代的上述的碳原子数1～6的烷基，可以列举甲氧基甲基、乙氧基甲基等。
在上述的取代基中，作为环烷基－烷氧基，优选为被碳原子数3～7的环烷基取代的碳原子数1～6的烷氧基，可以列举环丙基甲氧基、环丙基乙氧基、环丁基甲氧基、环戊基甲氧基、环己基甲氧基等。
在上述的取代基中，作为芳氧基，优选表示具有上述芳烷基的氧基，可以列举苯甲氧基、苯乙氧基、苯丙氧基、萘甲氧基、萘乙氧基等。
在上述的取代基中，作为芳氧基－烷基，优选表示具有上述芳氧基的、上述的碳原子数1～6的具有直链或支链的烷基，可以列举苯甲氧基甲基、苯甲氧基乙基等。
在上述的取代基中，作为烷硫基，优选为表示碳原子数1～6的直链状或支链状的烷硫基的(碳原子数1～6)烷硫基，可以列举甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基、叔丁硫基、戊硫基、己硫基等。
在上述的取代基中，作为环烷基－烷硫基，优选为被碳原子数3～7的环烷基取代的碳原子数1～6的烷硫基，可以列举环丙基甲硫基、环丙基乙硫基、环丁基甲硫基、环戊基甲硫基、环己基甲硫基等。
在上述的取代基中，作为单烷基氨基或二烷基氨基，为表示被上述的碳原子数1～6的具有直链或支链的烷基单取代或二取代的氨基的单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基，可以列举甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基、二乙基氨基、甲基乙基氨基等。
在上述的取代基中，作为环烷基－烷基氨基，表示被上述的环烷基取代的烷基氨基，可以列举环丙基甲基氨基、环丁基甲基氨基、环戊基甲基氨基等。
在上述的取代基中，作为酰基，可以列举甲酰基、乙酰基、丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、叔戊酰基等具有直链或支链的碳原子数1～6的酰基、苯甲酰基等。
在上述的取代基中，作为酰氧基，可以列举：甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、正丁酰氧基、异丁酰氧基、戊酰氧基、异戊酰氧基、叔戊酰氧基等具有直链或支链的碳原子数1～6的酰氧基；苯甲酰氧基、甘氨酰氧基、丙氨酰氧基、亮氨酰氧基等来自氨基酸的酰氧基等。
在上述的取代基中，作为烷氧基羰基，表示被上述的烷氧基取代的羰基，可以列举甲氧基羰基、乙氧基羰基、正丙氧基羰基、异丙氧基羰基、1－甲基丙氧基羰基、正丁氧基羰基、异丁氧基羰基、叔丁氧基羰基、2－甲基－丁氧基羰基、新戊氧基羰基、戊烷－2－基氧基羰基等。
在上述的取代基中，作为芳氧基羰基，优选表示被上述的芳氧基取代的羰基，可以列举苯甲氧基羰基、苯乙氧基羰基、苯丙氧基羰基、萘甲氧基羰基、萘乙氧基羰基等。
在上述的取代基中，作为氨甲酰基，可以列举－conh2基、(单烷基或二烷基)氨甲酰基、(单芳基或二芳基)氨甲酰基、(n－烷基－n－芳基)氨甲酰基、吡咯烷基氨甲酰基、哌啶基氨甲酰基、哌嗪基氨甲酰基、吗啉基氨甲酰基等。
在上述的取代基中，作为饱和或不饱和杂环基，表示优选具有1～4个n、s、o的任意杂原子的单环性或双环性的饱和或5～10元的不饱和杂环基，例如可以列举吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、六甲基亚氨基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、亚甲基二氧苯基、亚乙基二氧苯基、苯并呋喃基、二氢苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基等。
在上述的取代基中，作为芳香族烃基，优选表示碳原子数6～14的芳香族烃基，可以列举苯基、萘基等。
在上述的取代基中，作为饱和杂环氧基，表示具有具备n、s、o的任意1个或2个杂原子的单环性的5～7元饱和杂环基的氧基，例如具有吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、六亚甲基亚氨基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等的氧基，可以列举四氢呋喃氧基、四氢吡喃氧基。
通式(i)中，x1表示ch或n。另外，通式(i)中，x2、x3和x4的任一个为n，其他的表示ch。根据这些x1～x4的定义，作为通式(i)中的氮杂双环骨架的示例，可以列举如下结构。
(式中，r1和r2同上)
这些骨架之中，特别优选(a－3)和(a－6)。
通式(i)中，作为r1所示的“可以具有取代基的、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基”的“具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基”，优选具有选自n、s和o中的1～3个杂原子的单环性或双环性的5～10元的不饱和杂环基，更优选具有选自n、s和o中的1～3个杂原子的单环性的5～6元的不饱和杂环基、以及具有选自n、s和o中的1～3个杂原子的双环性的9～10元的不饱和杂环基。
作为该杂环基，优选具有咪唑、吡唑、噻吩、呋喃、吡咯、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、三唑、四唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲哚、异吲哚、吡咯并吡啶、吲唑、亚甲基二氧苯基、亚乙基二氧苯基、苯并呋喃、二氢苯并呋喃、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并噻唑、嘌呤、喹啉、四氢喹啉、异喹啉、喹唑啉或喹喔啉的基团。进一步优选具有咪唑、吡唑、噻吩、呋喃、吡啶、吲哚、吡咯并吡啶、苯并呋喃、喹啉或四氢喹啉的基团，特别优选具有咪唑、吡啶或喹啉的基团。
作为具体例，可以列举1h－咪唑－1－基、1h－咪唑－2－基、1h－咪唑－4－基、1h－吡唑－1－基、1h－吡唑－3－基、1h－吡唑－4－基、噻吩－2－基、噻吩－3－基、呋喃－2－基、呋喃－3－基、吡咯－1－基、吡咯－2－基、吡咯－3－基、噁唑－2－基、噁唑－4－基、噁唑－5－基、异噁唑－3－基、异噁唑－4－基、异噁唑－5－基、噻唑－2－基、噻唑－3－基、噻唑－4－基、噻唑－5－基、异噻唑－2－基、异噻唑－4－基、异噻唑－5－基、吡唑－1－基、吡唑－3－基、吡唑－4－基、1，2，3－三唑－1－基、1，2，3－三唑－4－基、1，2，4－三唑－1－基、1，2，4－三唑－3－基、1，2，4－三唑－4－基、四唑－1－基、四唑－5－基、吡啶－2－基、吡啶－3－基、吡啶－4－基、吡嗪－2－基、吡嗪－3－基、嘧啶－2－基、嘧啶－4－基、嘧啶－5－基、嘧啶－6－基、哒嗪－3－基、哒嗪－4－基、吲哚－1－基、吲哚－2－基、吲哚－3－基、吲哚－4－基、吲哚－5－基、吲哚－6－基、吲哚－7－基、异吲哚－1－基、异吲哚－2－基、异吲哚－4－基、异吲哚－5－基、1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－1－基、1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－2－基、1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－3－基、1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－4－基、1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－5－基、1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－6－基、1h－吲唑－1－基、1h－吲唑－3－基、1h－吲唑－4－基、1h－吲唑－5－基、1h－吲唑－6－基、1h－吲唑－7－基、亚甲基二氧苯基、亚乙基二氧苯基、苯并呋喃－2－基、苯并呋喃－3－基、苯并呋喃－4－基、苯并呋喃－5－基、苯并呋喃－6－基、苯并呋喃－7－基、2，3－二氢苯并呋喃－2－基、2，3－二氢苯并呋喃－3－基、苯并咪唑－1－基、苯并咪唑－2－基、苯并咪唑－4－基、苯并咪唑－5－基、苯并噁唑－2－基、苯并噁唑－4－基、苯并噁唑－5－基、苯并噻唑－2－基、苯并噻唑－4－基、苯并噻唑－5－基、嘌呤－2－基、嘌呤－6－基、嘌呤－7－基、嘌呤－8－基、喹啉－2－基、喹啉－3－基、喹啉－4－基、喹啉－5－基、喹啉－6－基、喹啉－7－基、喹啉－8－基、5，6，7，8－四氢喹啉－2－基、5，6，7，8－四氢喹啉－3－基、5，6，7，8－四氢喹啉－4－基、异喹啉－1－基、异喹啉－3－基、异喹啉－4－基、异喹啉－5－基、异喹啉－6－基、异喹啉－7－基、异喹啉－8－基、喹唑啉－4－基、喹喔啉－2－基、喹喔啉－5－基、喹喔啉－6－基等，优选为1h－咪唑－1－基、吡唑－4－基、噻吩－3－基、呋喃－2－基、吡啶－3－基、吡啶－4－基、吲哚－5－基、1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－5－基、苯并呋喃－2－基、喹啉－3－基、5，6，7，8－四氢喹啉－3－基，更优选为1h－咪唑－1－基、吡啶－3－基、吡啶－4－基、吲哚－5－基、1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－5－基、苯并呋喃－2－基、喹啉－3－基、5，6，7，8－四氢喹啉－3－基，特别优选为1h－咪唑－1－基、吡啶－3－基、喹啉－3－基。
通式(i)中，作为r1所示的上述的不饱和杂环基的“取代基”，可以例示上述的取代基。优选选自烷基、烷氧基、烷氧基－烷基、芳烷基、芳氧基－烷基、卤原子、卤代烷基、酰基、可以具有取代基的饱和或不饱和杂环基、可以具有取代基的芳香族烃基，其个数为1～3个。更优选选自：烷基；烷氧基；可以具有烷基、卤代烷基、芳烷基或羟烷基的不饱和杂环基；可以具有烷基、烷氧基或氨甲酰基的芳香族烃基，其个数为1～3个。在此，作为能够在r1所示的不饱和杂环上取代的不饱和杂环基，可以列举吡唑、咪唑、吡啶、嘧啶、呋喃、噻吩等。另外，作为芳香族烃基，可以列举苯基、萘基。
作为上述的r1所示的不饱和杂环基的“取代基”的具体例，可以例示甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、1－甲基丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、1h－吡唑－4－基、1－甲基－1h－吡唑－4－基、1－乙基－1h－吡唑－4－基、1－异丙基－1h－吡唑－4－基、1－苯甲基－1h－吡唑－4－基、1－(二氟甲基)－1h－吡唑－4－基、1－(羟乙基)－1h－吡唑－4－基、1h－咪唑－1－基、吡啶－3－基、吡啶－4－基、嘧啶－5－基、呋喃－2－基、呋喃－3－基、噻吩－3－基、苯基、4－甲氧基苯基、4－氨甲酰苯基、4－异丙基氨甲酰苯基、4－二甲基氨甲酰苯基。
作为具体的优选的r1，可以列举1h－咪唑－1－基、4－苯基－1h－咪唑－1－基、4－(4－氨甲酰苯基)－1h－咪唑－1－基、4－(4－甲氧苯基)－1h－咪唑－1－基、4－(噻吩－3－基)－1h－咪唑－1－基、4－(吡啶－3－基)－1h－咪唑－1－基、4－(吡啶－4－基)－1h－咪唑－1－基、5－甲基－4－(吡啶－3－基)－1h－咪唑－1－基、4－(嘧啶－5－基)－1h－咪唑－1－基、4－(呋喃－2－基)－1h－咪唑－1－基、4－(呋喃－3－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－甲基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－乙基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－异丙基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－羟甲基)－(1h－吡唑4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－(二氟甲基)－1h－吡唑4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－(羟乙基)－1h－吡唑4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－(羟甲基)－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－苯甲基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－(苯甲氧基乙基)－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、1'h－1，4'－联咪唑－1'－基、吡啶－3－基、吡啶－4－基、5－甲氧吡啶－3－基、6－甲氧吡啶－3－基、1－苯甲基－1h－吡唑4－基、1－甲基－1h－吲哚－5－基、1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－5－基、1－甲基－1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－5－基、1－甲氧基甲基－1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－5－基、5，6，7，8－四氢喹啉－3－基、喹啉－3－基、噻吩－3－基、呋喃－2－基、苯并呋喃－2－基，更优选为1h－咪唑－1－基、4－(吡啶－3－基)－1h－咪唑－1－基、4－(吡啶－4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－甲基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－乙基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－异丙基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(1－苯甲基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、喹啉－3－基，特别优选为4－(1－甲基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基、4－(吡啶－3－基)－1h－咪唑－1－基、喹啉－3－基。
通式(i)中，r2所示的“可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基”的“碳原子数1～6的烷基”表示碳原子数1～6的直链状或支链状的烷基，例如表示甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等，优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基。
作为r2所示的“可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基”的“取代基”，可以例示上述的取代基。其中，作为取代基，优选卤原子。
作为取代有卤原子的烷基，优选碳原子数1～6卤代烷基，更优选为三氟甲基。
r2所示的“可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基”的“碳原子数2～6的烯基”表示上述的碳原子数2～6的烯基，优选为乙烯基。作为该“可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基”的“取代基”，可以例示上述的取代基。
作为r2，更优选可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、可以具有取代基的碳原子数2～6的烯基，进一步优选可以具有卤原子的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基，特别优选可以具有卤原子的碳原子数1～4烷基。
y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的相同或不同，表示ch或n。其中，优选y1、y2、y3和y4的任一个或两个为c－r4，其他的为ch的情况，更优选y1和y3为ch、y2和y4的任一个或两个为c－r4，其他的为ch的情况下。以下以结构式表示它们的优选的方式。
(式中，r3和r4同上)
上述之中，特别优选(b1)和(b2)。
通式(i)中，r3表示氰基或－co－r5。其中，特别优选－co－r5。
通式(i)中，r4相同或不同，表示氢原子、卤原子、氰基、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数2～6的烯基、碳原子数1～6的烷氧基、芳香族烃基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9。其中，优选r4为卤原子、可以具有单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基或者具备n、s、o中的任意1个或2个杂原子的单环性的5～7元的饱和杂环基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9，更优选卤原子、碳原子数1～6的烷基、－n(r6)(r7)。
通式(i)中，r4所示的“卤原子”表示上述的卤原子，优选为氯原子。
通式(i)中，r4所示的“可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基”的“碳原子数1～6的烷基”表示上述的碳原子数1～6的烷基，优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基。
作为r4所示的“可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基”的“取代基”，可以例示上述的取代基，优选为乙基氨基、二甲基氨基等单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基、吡咯烷基、吗啉基等具有n、s、o中的任意1个或2个杂原子的单环性的5～7元的饱和杂环基。
通式(i)中，r4所示的“碳原子数2～6的烯基”表示上述的碳原子数2～6烯基，优选为乙烯基、丙－1－烯－2－基。
通式(i)中，r4所示的“碳原子数1～6的烷氧基”表示上述的碳原子数1～6的烷氧基，优选为甲氧基。
通式(i)中，r5所示的“可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基”的“单烷基氨基或二烷基氨基”表示上述的单烷基氨基或二烷基氨基，优选为单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基。
作为r5所示的“可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基”的“取代基”，可以例示上述的取代基。
作为r5，更优选氨基、羟氨基、单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基，特别优选氨基。
通式(i)中，r6、r7所示的“可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基”的“碳原子数1～6的烷基”表示上述的碳原子数1～6的烷基，优选为乙基、正丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、戊基。
作为r6、r7所示的“可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基”的“取代基”，可以例示上述的取代基。优选为：羟基、环己基等碳原子数3～7环烷基，吡咯烷基、吗啉基等饱和杂环基，吡啶基等不饱和杂环基，乙基氨基、二甲基氨基等单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基，甲基硫基等(碳原子数1～6的烷基)硫基、可以具有羟基的碳原子数1～6烷氧基。
通式(i)中，r6、r7所示的“碳原子数1～6的卤代烷基”表示上述的碳原子数1～6的卤代烷基，优选为2，2－二氟乙基、2，2，2－三氟乙基。
通式(i)中，作为r6、r7所示的“可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基”的“碳原子数3～7的环烷基”，例如可以列举环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基，优选为环丙基、环戊基、环己基。
作为r6、r7所示的“可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基”的“取代基”，可以例示上述的取代基。优选为羟基、氨基、来自氨基酸基的酰氧基、烷酰氨基、烷基磺酰氨基等。
通式(i)中，作为r6、r7所示的“可以具有取代基的芳烷基”的“芳烷基”，表示上述的芳烷基，优选为碳原子数7～12的芳烷基，具体地优选为苯甲基。
作为r6、r7所示的“可以具有取代基的芳烷基”的“取代基”，可以例示上述的取代基。作为具体的取代基，可以列举吡咯烷基等饱和杂环基等。
通式(i)中，作为r6、r7所示的“可以具有取代基的芳香族烃基”的“芳香族烃基”，表示上述的碳原子数6～14的芳香族烃基，优选为苯基。
作为r6、r7所示的“可以具有取代基的芳香族烃基”的“取代基”，可以例示上述的取代基。优选为卤原子、甲硫基等烷硫基、吗啉基等饱和杂环基、吡咯烷－羰基等取代氨甲酰基。
通式(i)中，r6、r7所示的“可以具有取代基的饱和杂环基”的“饱和杂环基”表示上述的饱和杂环基，优选为哌啶基、四氢吡喃基。
作为r6、r7所示的“可以具有取代基的饱和杂环基”的“取代基”，可以例示上述的取代基。优选为甲基等碳原子数1～6的烷基、乙酰基等酰基、2，6－二羟基嘧啶基－4－羰基等具有饱和杂环基的羰基、2－氨基乙酰基等氨基烷基羰基。
通式(i)中，r6、r7所示的“可以具有取代基的不饱和杂环基”的“不饱和杂环基”表示上述的不饱和杂环基，优选为吡啶基、噁唑基。
作为r6、r7所示的“可以具有取代基的不饱和杂环基”的“取代基”，可以例示上述的取代基。
通式(i)中，r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成的“饱和杂环基”表示优选具有1～4个氧原子、氮原子、硫原子的任意原子的单环性或双环性的饱和杂环基，例如表示吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、六亚甲基亚氨基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基、四氢呋喃基、四氢吡喃基。
通式(i)中，作为r6的r7的组合，优选：r6表示氢原子或可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基；r7表示氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的碳原子数7～12的芳烷基、可以具有取代基的碳原子数6～14的芳香族烃基、可以具有取代基的具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的饱和杂环基、或者可以具有取代基的具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的不饱和杂环基，或者r6和r7可以与它们所键合的氮原子一起形成5～7元的饱和杂环基。更优选：r6为氢原子，r7为氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的饱和杂环基的情况，特别优选：r6为氢原子，r7为可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基或可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基的情况。
通式(i)中，r8所示的“可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基”的“碳原子数3～7的环烷基”表示上述的碳原子数3～7的环烷基，优选为环己基。作为r8所示的“可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基”的“取代基”，可以例示上述的取代基，优选为羟基。
通式(i)中，r8所示的“可以具有取代基的芳香族烃基”的“芳香族烃基”表示上述的碳原子数6～14的芳香族烃基，优选为苯基。
作为r8所示的“可以具有取代基的芳香族烃基”的“取代基”，可以例示上述的取代基，优选为羟基。
作为r8，优选可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的碳原子数6～14的芳香族烃基。
通式(i)中，r9所示的“可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基”的“单烷基氨基或二烷基氨基”表示上述的单烷基氨基或二烷基氨基，优选为单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基。
作为r9所示的“可以具有取代基的单烷基氨基或二烷基氨基”的“取代基”，可以例示上述的取代基。
作为r9，优选氢原子、羟基、氨基、或者单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基，特别优选氢原子。
本发明的优选的氮杂双环式化合物为如下化合物：在通式(i)中，x1为ch或n；x2为n，x3和x4为ch；y1和y3为ch，y2和y4的任一个或两个为c－r4，其他的为ch；r1为可以具有取代基的1h－咪唑－1－基、可以具有取代基的吡唑－4－基、可以具有取代基的噻吩－3－基、可以具有取代基的呋喃－2－基、可以具有取代基的吡啶－3－基、可以具有取代基的吡啶－4－基、可以具有取代基的吲哚－5－基、可以具有取代基的1h－吡咯并[2，3－b]吡啶－5－基、可以具有取代基的苯并呋喃－2－基、可以具有取代基的喹啉－3－基、可以具有取代基的5，6，7，8－四氢喹啉－3－基中的任意基团；r2为可以具有卤原子的碳原子数1～6的烷基或碳原子数2～6的烯基；r3为－co－r5；r4为卤原子、可以具有单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基或者具备n、s、o中的任意1个或2个杂原子的单环性的5～7元的饱和杂环基的碳原子数1～6的烷基、碳原子数1～6的烷氧基、－n(r6)(r7)、－s－r8或－co－r9；r5为氨基、或者单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基；r6为氢原子或可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基；r7为氢原子、可以具有取代基的碳原子数1～6的烷基、可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基、可以具有取代基的碳原子数7～12的芳烷基、可以具有取代基的碳原子数6～14的芳香族烃基、具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的可以具有取代基的饱和杂环基、或者具有选自n、s和o中的1～4个杂原子的单环性或双环性的可以具有取代基的不饱和杂环基，或者r6和r7与它们所键合的氮原子一起形成5～7元的饱和杂环基；r8为可以具有取代基的碳原子数3～7的环烷基或可以具有取代基的碳原子数6～14的芳香族烃基；r9为氢原子、羟基、氨基、或者单(碳原子数1～6的烷基)氨基或二(碳原子数1～6的烷基)氨基。
作为更具体的氮杂双环式化合物，有3－乙基－4－{3－异丙基－4－(4－(1－甲基－1h－吡唑－4－基)－1h－咪唑－1－基)－1h－吡唑并[3，4－b]吡啶－1－基}苯甲酰胺(以下称为化合物1)。
作为本发明的通式(i)所示的氮杂双环式化合物的盐，只要是药学上可接受的盐就没有特别限制，可以列举：与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸、或甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸、苦味酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、谷氨酸等有机酸的酸加成盐；钠、钾、镁、钙、铝等无机碱、或甲胺、乙胺、葡甲胺、乙醇胺等有机碱；或者与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸的盐、或铵盐。
其中，本发明的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐例如可以按照国际公开第2011/004610号小册子所记载的方法合成。
本发明的免疫检查点分子调节剂直接作用于免疫检查点分子，诱发癌症患者生物体内的抗肿瘤免疫相应，具有抑制肿瘤的免疫逃避的作用。
作为这样的物质，可以列举促进协同刺激分子(刺激性的共刺激分子)的功能的物质、或者抑制联合抑制分子(抑制性的共刺激分子)的功能的物质。作为免疫检查点分子，例如可以列举b7家族(b7－1、b7－2、pd－l1、pd－l2等)、cd28家族(ctla－4、pd－1等)、tnf超家族(4－1bbl、ox40l)、tnf受体超家族(4－1bb、ox40)分子，免疫检查点分子调节剂能够使用以免疫检查点分子为标的的物质。例如可以列举pd－1通路拮抗剂、icos通路激动剂、ctla－4通路拮抗剂、cd28通路激动剂、btla通路拮抗剂、4－1bb通路激动剂等。
在本发明中，免疫检查点分子调节剂优选为选自pd－1通路拮抗剂、icos通路激动剂、ctla－4通路拮抗剂和cd28通路激动剂中的至少一种以上，更优选为选自pd－1通路拮抗剂和ctla－4通路拮抗剂中的至少一种以上，从抑制副作用的观点考虑，进一步优选为pd－1通路拮抗剂。
pd－1通路拮抗剂是抑制在t细胞上表达的pd－1、或者作为其配基的pd－l1或pd－l2所产生的免疫抑制信号的物质，可以列举抗pd－1抗体、抗pd－l1抗体、抗pd－l2抗体、pd－1细胞外结构域、pd－l1细胞外结构域、pd－l2细胞外结构域、pd－1－ig(pd－1细胞外结构域与免疫球蛋白(ig)的fc区域的融合蛋白)、pd－l1－ig、pd－l2－ig、pd－1sirna、pd－l1sirna、pd－l2sirna等，优选为抗pd－1抗体、抗pd－l1抗体或抗pd－l2抗体，更优选为抗pd－1抗体或抗pd－l1抗体。其中，特别优选为抗pd－1抗体。
另外，ctla－4通路拮抗剂是抑制在t细胞上表达的ctla－4、或者作为其配基的b7－1(cd80)或b7－2(cd86)所产生的免疫抑制信号的物质，优选为抗ctla－4抗体、ctla－4细胞外结构域、ctla－4－ig、抗b7－1(cd80)抗体或抗b7－2(cd86)抗体，更优选为抗ctla－4抗体或ctla－4－ig。其中，特别优选为抗ctla－4抗体。
另外，在本发明的一个方式中，免疫检查点分子调节剂优选为选自抗pd－1抗体、抗pd－l1抗体和抗ctla－4抗体中的至少一种以上。
这些抗体可以列举免疫球蛋白(iga、igd、ige、igg、igm、igy等)、fab片段、f(ab')2片段、单链抗体片段(scfv)、单结构域抗体、双体抗体(diabody)等(nat.rev.immunol.，6：343－357，2006)，这些可以列举人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体、羊驼抗体、鸡抗体等的单克隆抗体或多克隆抗体。
优选为人源化igg单克隆抗体或人igg单克隆抗体。
作为本发明的抗pd－1抗体，可以列举纳武单抗或派姆单抗等，优选为纳武单抗或派姆单抗。
作为本发明的抗pd－l1抗体，可以列举阿特珠单抗、德瓦鲁单抗或阿维鲁单抗等，优选为阿特珠单抗、德瓦鲁单抗或阿维鲁单抗，更优选为阿特珠单抗。
作为本发明的抗ctla－4抗体，可以列举伊匹单抗或替西木单抗等，优选为伊匹单抗。
作为本发明的ctla－4－ig，可以列举阿巴西普(abatacept)等，优选为阿巴西普。
这些抗体可以按照通常公知的抗体制作方法制造。
并且，抗pd－1抗体已经作为纳武单抗或派姆单抗、抗pd－l1抗体作为阿特珠单抗、德瓦鲁单抗或阿维鲁单抗、抗ctla－4抗体作为伊匹单抗或替西木单抗、ctla－4－ig作为阿巴西普销售、或预定销售，还可以使用这些销售品。
在本发明中，在使用2种以上的免疫检查点分子调节剂的情况下，例如可以将抗pd－1抗体和抗ctla－4抗体组合使用，也可以使用能够与pd－1和ctla－4两者结合的双重特异性抗体。作为双重特异性抗体，例如可以列举xmab20717(pd－1×ctla－4)。
在本发明中，作为通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的给予日的每1天的给予量，从通式(i)所示的氮杂双环式化合物所带来的免疫检查点分子调节剂的抗肿瘤效果的增强效果的观点考虑，在单独给予通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的情况下，优选为推荐用量的50～200％，更优选为87.5～112.5％，特别优选为100％。人的推荐用量优选为80～320mg/人/天，更优选为140～180mg/人/天，特别优选为160mg/人/天。
在本发明中，作为免疫检查点分子调节剂的给予日的每1天的给予量，从通式(i)所示的氮杂双环式化合物所带来的免疫检查点分子调节剂的抗肿瘤效果的增强作用的观点考虑，在单独给予免疫检查点分子调节剂的情况下，优选为推荐用量的50～100％，更优选为100％。
具体而言，关于单独给予纳武单抗时的推荐用量，根据在日本被批准的给予量1次2mg/kg(体重)或1次3mg/kg(体重)，本发明的纳武单抗的给予日的每1天的给予量优选为1次1～3mg/kg(体重)，更优选为1次2mg/kg(体重)或1次3mg/kg(体重)。
关于单独给予派姆单抗时的推荐用量，根据在日本被批准的给予量1次2mg/kg(体重)或1次200mg，本发明的派姆单抗的给予日的每1天的给予量优选为1次1～2mg/kg(体重)或1次100～200mg，更优选为1次2mg/kg(体重)或1次200mg。
关于单独给予阿特珠单抗时的推荐用量，根据在美国被批准的给予量1次1200mg，本发明的阿特珠单抗的给予日的每1天的给予量优选为1次600～1200mg，更优选为1次1200mg。
关于单独给予阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗时的推荐用量，根据在美国被批准的给予量1次10mg/kg(体重)，本发明的阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗的给予日的每1天的给予量优选为1次5～10mg/kg(体重)，更优选为1次10mg/kg(体重)。
在单独给予伊匹单抗时的推荐用量，根据在日本被批准的的给予量1次3mg/kg(体重)，本发明的伊匹单抗的给予日的每1天的给予量优选为1次1.5～3mg/kg(体重)，更优选为1次3mg/kg(体重)。
其中，在本发明中“推荐用量”是指通过临床试验等确定的、在不发生严重的副作用而能够安全使用的范围内获得最大的治疗效果的给予量，具体可以列举：由日本药品与医疗器械管理局(pmda：pharmaceuticalsandmedicaldevicesagency)、美国食品药物管理局(fda：foodanddrugadministration)、欧洲药品管理局(ema：europeanmedicinesagency)等公共机构或团体承认、推荐、建议并且记载在附属文件、说明书(interviewform)、治疗方案等中的给予量，优选由pmda、fda或ema的任意的公共机构承认的给予量。
本发明的抗肿瘤剂的治疗方案可以根据癌症种类和病期等适当选择。
在通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的情况下，优选重复进行连续给予5天和停药2天的给予日程，具体而言，优选如下日程：在1周之内，给予5天后停药2天，将使用这样的给予法3周的给予作为1个周期，重复进行这样的周期。
在纳武单抗的情况下，优选以2周或3周间隔给予的给予日程。
在派姆单抗、阿特珠单抗或伊匹单抗的情况下，优选以3周间隔给予的给予日程。
本发明的抗肿瘤剂的1天的给予次数可以根据癌症种类和病期等适当选择。
在通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的情况下，优选1天1次或1天2次，更优选1天1次。在纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗或伊匹单抗的情况下，优选1天1次。
本发明的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐和免疫检查点分子调节剂的给予顺序可以根据癌症种类和病期等适当选择，先给予任一种或并用给予均可。在此，在不并用给予两种制剂的情况下，关于两种制剂的给予间隔，只要能够发挥抗肿瘤效果的增强效果就能够适当选择，优选1～14天，更优选1～7天，进一步优选1～5天，特别优选1～3天。
关于本发明中的对象肿瘤，只要在能够发挥抗肿瘤效果的增强效果的范围内就没有特别限制，优选通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐能够发挥抗肿瘤效果的肿瘤，更优选hsp90参与的恶性肿瘤。
作为本发明的对象癌，具体可以列举头颈部癌、消化器官癌(食道癌、胃癌、十二指肠癌、肝癌、胆道癌(胆囊、胆管癌等)、胰腺癌、小肠癌、大肠癌(结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌等)、胃肠道间质瘤等)、肺癌(非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌(子宫颈癌、子宫体癌等)、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌等。其中，这里的癌不仅包括原发灶，也包括转移到其他脏器(肝脏等)的癌。其中，从抗肿瘤效果和副作用的观点考虑，优选头颈部癌、消化器官癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、皮肤癌，更优选消化器官癌、肺癌或乳癌，进一步优选大肠癌、胃癌、胃肠道间质瘤、肺癌或乳癌，特别优选大肠癌。并且，本发明的抗肿瘤剂既可以用于在通过外科手术摘除肿瘤后防止复发而进行的术后辅助化学疗法，也可以用于为了通过外科手术摘除肿瘤而事先进行的术前辅助化学疗法。
如后述实施例所示，通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐具有免疫赋活作用。在本说明书中，“免疫赋活作用”意指使免疫细胞活化、诱导细胞分裂和产生各种细胞因子的作用。通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐具有使免疫细胞中的特别是t细胞赋活化的作用。在此，使t细胞赋活化的作用例如可以列举：肿瘤浸润白细胞中的cd8阳性细胞的比例增加和/或肿瘤浸润白细胞中t细胞中的抑制性t细胞的比例降低。
因此，本发明涉及以通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐为有效成分的免疫赋活剂、用于免疫赋活的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐、以及包括对需要免疫赋活的患者给予有效量的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的步骤的免疫赋活方法。免疫赋活的对象可以列举人和其他的哺乳动物，例如猴、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、羊等。
根据通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的免疫赋活作用，能够予防和/或治疗各种感染症、免疫缺陷疾病、因随着年龄增长的免疫功能下降而引起的疾病、与病毒有关的肿瘤等能够通过免疫赋活而改善的疾病。
作为上述感染症，例如可以列举寄生虫感染(例如锥体虫原虫、疟原虫、弓形虫)、细菌感染(例如肺炎球菌、结核菌、黄色葡萄球菌、炭疽菌、霍乱菌、支原体、幽门菌(幽门螺旋杆菌))、以及病毒感染(例如人t细胞白血病病毒(htlv－1)、人免疫缺陷病毒(hiv)、人乳头瘤病毒(hpv)、爱泼斯坦-巴尔病毒毒(ebv)、巨细胞病毒(cmv)、流感病毒(flu)、乙型肝炎病毒(hbv)、单纯疱疹病毒、丙型肝炎病毒(hcv)、sars冠状病毒、mers冠状病毒、登革热病毒、埃博拉病毒)。
本发明的另一方面涉及包含通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的用于通过免疫赋活来予防和/或治疗感染症的医药组合物、用于通过免疫赋活来予防和/或治疗感染症的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐、以及包括对需要予防和/或治疗的患者给予有效量的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的步骤的通过免疫赋活来予防和/或治疗该患者的感染症的方法。
作为上述免疫缺陷疾病，例如可以列举先天性免疫缺陷疾病和后天性免疫缺陷疾病，特别是由于感染人免疫缺陷病毒(hiv)而造成的后天性免疫缺陷疾病。
本发明的又一方面涉及包含通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的用于通过免疫赋活来予防和/或治疗免疫缺陷疾病的医药组合物、用于通过免疫赋活来予防和/或治疗免疫缺陷疾病的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐、以及包括对需要予防和/或治疗的患者给予有效量的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的步骤的通过免疫赋活来予防和/或治疗该患者的免疫缺陷疾病的方法。
作为因随着年龄增长的免疫功能下降而引起的疾病的具体例，可以列举肺炎。
本发明的另一方面涉及包含通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的用于通过免疫赋活来予防和/或治疗因随着年龄增长的免疫功能下降而引起的疾病的医药组合物、用于通过免疫赋活来予防和/或治疗因随着年龄增长的免疫功能下降而引起的疾病的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐、以及包括对需要予防和/或治疗的患者给予有效量的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的步骤的通过免疫赋活来予防和/或治疗该患者的因随着年龄增长的免疫功能下降而引起的疾病的方法。
作为上述与病毒有关的肿瘤、即因病毒感染而发病的肿瘤的具体例，可以列举burkitt淋巴瘤、肝细胞癌、子宫颈癌、成人t细胞白血病、kaposi's肉瘤、头颈部癌。
本发明的又一方面涉及包含通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的用于通过免疫赋活来予防和/或治疗与病毒有关的肿瘤的医药组合物、用于通过免疫赋活来予防和/或治疗与病毒有关的肿瘤的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐、以及包括对需要予防和/或治疗的患者给予有效量的通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的步骤的通过免疫赋活来予防和/或治疗该患者的与病毒有关的肿瘤的方法。
在本发明中，作为用于免疫赋活的、通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的给予日的每1天的给予量，从免疫赋活作用的观点考虑，在单独给予通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的情况下，优选为推荐用量的50～200％，更优选为87.5～112.5％，特别优选为100％。人的推荐用量优选为80～320mg/人/天，更优选为140～180mg/人/天，特别优选为160mg/人/天。
在本发明中，通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐、和免疫检查点分子调节剂可以基于各有效成分的给予形态和给予日程将各有效成分分成多种剂型制剂化，也可以合并成一种剂型制剂化(即，以配合剂的形态制剂化)。另外，可以将各制剂合并在适合并用的1个包装中制造销售，还可以将各制剂分成单独的包装制造销售。
作为本发明的抗肿瘤剂和免疫赋活剂的给予形态，没有特别限制，可以根据治疗目的适当选择，具体可以例示口服剂(片剂、包衣片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液剂等)、注射剂、栓剂、贴敷剂、软膏剂等。
在通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的情况下，优选口服剂。
在抗pd－1抗体、抗pd－l1抗体或抗ctla－4抗体的情况下，可以列举上述的给予形态，优选注射剂。
关于本发明的抗肿瘤剂和免疫赋活剂，对于通式(i)所示的氮杂双环式化合物和免疫检查点分子调节剂，均根据其给予形态使用药学上可接受的载体，利用通常公知的方法制备。作为这种载体，可以例示通常的药剂通用的各种载体，例如赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、稀释剂、溶解辅助剂、悬浮剂、等渗剂、ph调节剂、缓冲剂、稳定化剂、着色剂、矫味剂、矫臭剂等。
本发明还涉及用于增强免疫检查点分子调节剂对癌症患者的抗肿瘤效果的、含有通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐作为有效成分的抗肿瘤效果增强剂。该抗肿瘤效果增强剂具有上述抗肿瘤剂的制剂形态。
本发明还涉及用于增强通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐对癌症患者的抗肿瘤效果的、含有免疫检查点分子调节剂作为有效成分的抗肿瘤效果增强剂。该抗肿瘤效果增强剂具有上述抗肿瘤剂的制剂形态。
本发明还涉及用于对给予了免疫检查点分子调节剂的癌症患者进行治疗的、含有通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的抗肿瘤剂。该抗肿瘤剂具有上述的制剂形态。
本发明还涉及用于对给予了通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的癌症患者进行治疗的、含有免疫检查点分子调节剂的抗肿瘤剂。该抗肿瘤剂具有上述的制剂形态。
“治疗”包括用于在通过外科手术摘除肿瘤后防止复发而进行的术后辅助化学疗法、为了通过外科手术摘除肿瘤而事先进行的术前辅助化学疗法。
本发明还涉及特征在于对癌症患者与免疫检查点分子调节剂并用的、含有通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的抗肿瘤剂。该抗肿瘤剂具有上述的制剂形态。
本发明还涉及特征在于对癌症患者与通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐并用的、含有免疫检查点分子调节剂的抗肿瘤剂。该抗肿瘤剂具有上述的制剂形态。
本发明还涉及包括含有通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐的抗肿瘤剂、以及记载了对癌症患者并用给予通式(i)所示的氮杂双环式化合物或其盐和免疫检查点分子调节剂的使用说明书的试剂盒制剂。
在此，“使用说明书”只要记载了上述给予量即可，不管是否具有法律约束力，但优选推荐上述给予量。具体可以列举附属文件、小册子等。另外，包括使用说明书的试剂盒制剂可以是在试剂盒制剂的包装内印刷、附带了使用说明书的产品，也可以是试剂盒制剂的包装内同时封入了抗肿瘤剂和使用说明书的产品。
实施例
下面列举实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明完全不受这些实施例的限定，本领域的技术人员可以在本发明的技术思想内进行多种变形。
实施例1大肠癌细胞移植模型中的化合物1与抗小鼠pd－1抗体的组合效果
小鼠大肠癌细胞株mc38从dr.yoshihirohayakawa(富山大学，富山，日本)获得。在包含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640(sigma－aldrich)培养基(培养液)中进行培养。mc38在37℃、5％co2孵箱中以每周1～2次、1∶3～1∶5的比率传代。
在6周龄的c57bl/6jjcl小鼠(cleajapan,inc.)的右侧最后位肋骨附近的皮下以每只小鼠2×106细胞/0.1ml的量移植细胞悬浮液。
在移植后使肿瘤增殖，直至50～300mm3的肿瘤体积(tv)。肿瘤直径测定使用电子数显卡尺，测定肿瘤的长径和短径，按照以下式算出tv。
tv(mm3)＝长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2
按照以tv为指标的分层随机分配法，将动物分成每组6只。将实施分组(n＝6)那日设为day0。
根据tv算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume：rtv)和相对肿瘤体积变化率(t/c)。
rtv和t/c按照以下式算出。
rtv＝测定日的tv/分组日的tvt/c(％)＝(各药剂给予组的平均rtv)/(对照组的平均rtv)×100
另外，体重的测定使用动物用电子天平。按照以下式根据第n日的体重(bwn)算出第n日的体重变化率(bwcn)。
体重变化率bwcn(％)＝(bwn－bw0)/bw0×100
添加适量的日本药典注射用水使得羟丙甲纤维素的浓度达到0.5w/v％后，使用搅拌器进行搅拌使其完全溶解，由此制备0.5％羟丙甲纤维素水溶液。利用玛瑙研钵将化合物1粉碎后，利用0.5％羟丙甲纤维素水溶液悬浮为规定的浓度，进行超声波处理制成均匀的悬浊液。将该悬浊液作为化合物1，以10mg/kg/天或14mg/kg/天、1天1次连续口服给予5天后，停药2天，重复该步骤3次。
关于抗小鼠pd－1抗体(anti－mpd－1ab)，在即将给予之前使用大塚生理盐水将invivomabanti－mousepd－1(cd279)(clone：rmp－1－14、bioxcell公司)稀释成规定的浓度而制备。在给予首日(day1)，作为抗小鼠pd－1抗体以0.05mg/只腹腔内给予。
将结果示于图1和表1。
[表1]
**：与对照组相比，aspin-welch的t-检验的p<0.01。
##：与抗小鼠pd－1抗体(anti－mpd－1ab)组相比，aspin-welch的t-检验的p<0.01。
$$：与化合物1组相比，aspin-welch的t-检验的p<0.01。
sd：标准差
通过aspin－welch的t-检验对各组的day22的rtv进行解析，结果，化合物1组或抗小鼠pd－1抗体组的单独药剂组、以及化合物1+抗小鼠pd－1抗体的并用给予组与对照组相比，rtv有意义地降低，表现出了抗肿瘤效果。并且，化合物1+抗小鼠pd－1抗体的并用给予组与化合物1组或抗小鼠pd－1抗体组的单独药剂组相比，rtv有意义地降低，表现出了更强的抗肿瘤效果。
并用给予组的平均体重变化率与化合物1组或抗小鼠pd－1抗体组的单独药剂组相比，并未伴有毒性增强。
实施例2大肠癌细胞移植模型中的化合物1的免疫赋活作用
小鼠大肠癌细胞株mc38使用含有10％fbs的rpmi1640(和光纯药株式会社)培养基进行培养。mc38在37℃、5％co2孵箱中以每周1～2次、1∶5～1∶10比率传代。
在6周龄的c57bl/6njcrl小鼠(charlesriverlaboratoriesinternational,inc.)的右侧最后位肋骨附近的皮下以每只小鼠2×106细胞/0.1ml的量移植细胞悬浮液。
在移植后使肿瘤增殖，直至110～360mm3的肿瘤体积(tv)。肿瘤直径测定使用电子数显卡尺，测定肿瘤的长径和短径，按照以下式算出tv。
tv(mm3)＝长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2
按照以tv为指标的分层随机分配法，将动物分成每组5只。将实施分组(n＝5)那日设为day1。
将按照与实施例1同样的方法制得的药剂用于给药。关于抗小鼠pd－1抗体(anti－mpd－1ab)，将cd279(pd－1)单克隆抗体(rmp1－14)、ebioscience(thermofisherscientific)在给予首日(day1)作为抗小鼠pd－1抗体以0.05mg/只腹腔内给予。化合物1在day1－5和8－9以14mg/kg/天1天1次口服给予。
为了检测免疫相关因子的表达，进行流式细胞分析，实施免疫监控。在day10采集肿瘤后，使用tumordissociationkit、小鼠(miltenyibiotec)制备肿瘤浸润淋巴细胞。之后，使用foxp3/transcriptionfactorstainingbufferset(thermofisherscientific)进行抗体染色后，使用流式细胞仪facsverse(bdbioscience)进行解析。染色使用cd45单克隆抗体(30－f11)，efluor450，ebiosciencetm(thermofisherscientific)、foxp3单克隆抗体(fjk－16s)，pe，ebiosciencetm(thermofisherscientific)、cd4单克隆抗体(gk1.5)，pe－cyanine7，ebiosciencetm(thermofisherscientific)和cd25单克隆抗体(pc61.5)，apc，ebiosciencetm(thermofisherscientific)、brilliantviolet510tmanti－mousecd90.2抗体(biolegend)以及cd8a单克隆抗体(53－6.7)，fitc，ebiosciencetm(biolegend)。
将结果示于图2。
通过dunnett-检验对各组的day10的白细胞(cd45阳性细胞)中的cd8阳性细胞(cd45阳性、cd90.2阳性和cd8阳性细胞)比例进行解析，结果确认与day10的对照组相比，化合物1给予组的白细胞中的cd8阳性细胞比例有意义地增加。另外，通过dunnett-检验对各组的day10的t细胞(cd45阳性和cd90.2阳性细胞)中的抑制性t细胞(cd45阳性、cd90.2阳性、cd4阳性、cd25阳性和foxp3阳性细胞)比例进行解析，结果确认与day10的对照组相比，化合物1给予组的t细胞中的抑制性t细胞比例有意义地降低。
根据以上结果可以确认化合物1具有免疫赋活作用。
实施例3大肠癌细胞移植模型中的化合物1与抗小鼠pd－l1抗体或抗小鼠ctla－4抗体的组合效果
除了使用抗小鼠pd－l1抗体或抗ctla－4抗体代替抗小鼠pd－1抗体以外，与实施例1相同。
关于抗小鼠pd－l1抗体(anti－mpd－l1ab)，在即将给予之前使用大塚生理盐水将invivomabanti－mousepd－l1(b7－h1)(clone：10f.9g2、bioxcell公司)稀释成规定的浓度而制备。在给予首日(day1)，作为抗小鼠pd－l1抗体以0.05mg/只腹腔内给予。另外，关于抗小鼠ctla－4抗体(anti－mctla－4ab)，在即将给予之前使用大塚生理盐水将invivomabanti－mousectla－4(cd152)(clone：9h10、bioxcell公司)稀释成规定的浓度而制备。在给予首日(day1)，作为抗小鼠ctla－4抗体以0.05mg/只腹腔内给予。
将结果示于图3、图4和表2。
[表2]
**：与对照组相比，aspin-welch的t-检验的p<0.01。
##：与抗小鼠pd－l1抗体(anti－mpd－l1ab)组相比，aspin-welch的t-检验的p<0.01。
&&：与抗小鼠ctla－4抗体(anti－mctla－4ab)组相比，aspin-welch的t-检验的p<0.01。
$$：与化合物1组相比，aspin-welch的t-检验的p<0.01。
se：标准误差
通过aspin－welch的t-检验对各组的day22的rtv进行解析，结果，化合物1组、抗小鼠pd－l1抗体组或抗小鼠ctla－4抗体组的单独药剂组、以及化合物1+抗小鼠pd－l1抗体或化合物1+抗小鼠ctla－4抗体的并用给予组与对照组相比，rtv有意义地降低，表现出了抗肿瘤效果。并且，化合物1+抗小鼠pd－l1抗体的并用给予组与化合物1组或抗小鼠pd－l1抗体组的单独药剂组相比，rtv有意义地降低，表现出了更强的抗肿瘤效果。另外，化合物1+抗小鼠ctla－4抗体的并用给予组与化合物1组或抗小鼠ctla－4抗体组的单独药剂组相比，rtv有意义地降低，表现出了更强的抗肿瘤效果。
并用给予组的平均体重变化率与化合物1组、抗小鼠pd－l1抗体组或抗小鼠ctla－4抗体组的单独药剂组相比，并未伴有毒性增强。
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