用于治疗胆汁淤积性疾病的组合物和方法与流程
本发明涉及用于治疗和预防胆汁淤积性疾病的组合物和方法。
背景技术：
胆汁淤积性疾病是导致胆汁在肝脏中毒性积聚以及如血清中肝酶水平升高所证明的肝功能受损的病状。这可能是由于肝外胆管的直接阻塞(例如，由于胆结石、炎性狭窄、癌症或胰腺炎)或由诸如原发性胆汁性肝硬化(pbc)、原发性硬化性肝硬化(psc)、进行性家族性肝内胆汁淤积症、妊娠胆汁淤积症、胆管炎、肝病(例如肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(nash)和肝细胞癌)以及诸如囊性纤维化和移植物抗宿主病的其他肝硬化原因的病状引起的肝内胆管损害引起的。
熊去氧胆酸(udca)已被报道为胆汁淤积性肝病例如pbc和psc的治疗剂。udca被认为通过其抗胆汁淤积、抗炎、抗凋亡和保护特性来延缓疾病进展(paumgartner等人,hepatology36:525-531,2002)。但是，对于pbc，约40％的患者对udca治疗无应答(parés等人,gastroenterology130:715-720,2006)。此外，所述治疗可能具有严重的副作用，特别是当以高剂量施用时。在psc中，高剂量与重大不良事件的风险有关。奥贝胆酸是一种非天然胆汁酸衍生物，已被批准在对udca应答不足的成年人中与udca组合或在不能耐受udca的成年人中作为单一疗法来治疗原发性胆汁性胆管炎(pbc)，并且在用于治疗psc的临床试验中正处于研究中。但是，此治疗可能与包括严重瘙痒症的不良副作用有关。疾病无法通过药物干预来控制的患者通常需要进行肝移植。
胃肠道(gi)微生物组在胆汁酸代谢中发挥作用，将肝脏合成的缀合初级胆汁酸变为在肝脏和胃肠道(gi)中影响代谢、炎症、免疫力和胆汁酸合成的一系列初级和次级胆汁酸。肝脏合成的胆汁盐包括甘氨酸或牛磺酸缀合胆酸(ca)和鹅去氧胆酸(cdca)，它们是两亲的并具有帮助溶解脂质和其他疏水性分子以进行吸收的洗涤剂特性(ridlon等人,j.lipidres.47:247-259,2006)。缀合的初级胆汁盐(在本文中任选地称为“缀合的初级胆汁酸”)被某些肠细菌去缀合以形成去缀合的初级胆汁酸(在本文中称为“初级胆汁酸”)，其可以通过包括氧化、异构化和7α-脱羟基化的一系列微生物催化的反应进一步代谢为次级胆汁酸(ridlon等人,j.lipidres.47:247-259,2006)。另外，肝脏产生这些胆汁酸代谢产物的缀合形式(在本文中称为“缀合的次级胆汁酸”)。据报道，在人类中总共发现了超过45种胆汁酸(bathena等人,j.chromatographyb942-943:53-62,2013)。胆汁酸含量和信号传导的变化与多种疾病结果有关，包括胆汁淤积性疾病、nash和诸如炎性肠病的炎性疾病(hofmann,archinternmed159:2647-2658,1999；duboc等人,gut63:531-539,2013；kohli等人,dig.dis.33:440-446,2015)。
虽然缀合的初级胆汁盐对于适当的营养吸收是重要的，但是当以高浓度存在时或不能形成胶团时，它们可能对肝细胞和胆上皮细胞造成损害(monte等人,worldj.gastroenterol.15(7):804-816,2009)。还已经表明高水平的胆汁酸在肝脏中引起氧化应激和细胞凋亡(sokol等人hepatology17:869-881,1993；faubion等人,fas.j.clin.invest.103:137-145,1999)且疏水性较强的胆汁酸与结肠癌发生有关(debruyne等人,mutat.res.480-481:359-369,2001)。破坏的fxr信号传导和胆汁酸含量也与肝癌有关(kim等人,carcinogenesis28:940-946,2007)。在人类中，mdr3基因的缺陷导致一类胆汁淤积，称为进行性家族性肝内胆汁淤积症(deleuze等人,hepatology23:904-908,1996)。
鉴于有效治疗选择的有限可用性和疾病的慢性进展，需要改善或预防胆汁淤积性疾病以及它们的体征和症状的治疗。
技术实现要素：
本发明提供了包含多种活细菌的制剂，其中所述制剂包含至少一种细菌otu或物种和药学上可接受的赋形剂，所述至少一种细菌otu或物种可表现出第一胆汁代谢活性(例如，胆汁酸或胆汁盐水解酶活性；还参见下文)。
在一些实施方案中，所述otu或物种的16srdna序列或其片段与图16中的序列或其一部分(例如，参见下文)具有至少95％或至少97％同一性(例如，至少98％、至少99％或100％同一性)。
在一些实施方案中，所述制剂还包含至少一种活细菌otu或物种，其可以表现出选自由特异性不同于第一胆汁酸或胆汁盐水解酶活性的第二胆汁酸或胆汁盐水解酶活性、去缀合、氧化和脱羟基化组成的组的活性。
在一些实施方案中，所述制剂包含至少两种不同的细菌otu或物种。
在一些实施方案中，所述制剂包含两种不同的细菌otu或物种，并且所述制剂可以表现出氧化和二羟基化活性。
在一些实施方案中，所述制剂包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45或50种选自表1的至少两个进化枝的otu或细菌物种。在各种实施例中，表1的组合物的每种otu或细菌物种的16srdna与图16的至少一个序列或其一部分(例如，参见下文)具有至少95％或97％同一性(例如，至少98％、至少99％或100％同一性)。
在一些实施方案中，所述制剂包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40或50种选自表2的至少两个进化枝的otu或细菌物种。
在一些实施方案中，所述制剂包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40或50种选自表1、表2或表3的b或c部分的otu或细菌物种。
在一些实施方案中，所述制剂包含来自5、10、15或20个选自由1、6、86、87、90、100、101、164、195、196、197、203、204和297组成的组的进化枝的一种或多种otu或细菌物种。
在一些实施方案中，制剂中不同otu或物种的数量少于60、50、30、20或15。
在一些实施方案中，使用基于动物的测定法、基于细胞的测定法、体外测定法、通过测序或使用这些类型的测定法的组合检测制剂中一种或多种细菌otu或物种的胆汁酸或胆汁盐水解酶、去缀合、氧化或脱羟基化活性。
在一些实施方案中，制剂的每种细菌otu或物种具有选自由水解、去缀合、氧化或脱羟基化组成的组的胆汁酸或胆汁盐代谢活性。
本发明还包括治疗制剂或组合物，包括上文或本文其他地方描述的制剂。在各种实施方案中，将治疗制剂的活细菌递送至小肠、结肠或两者。
本发明还提供了治疗诊断患有胆汁淤积性疾病或病状或处于其风险下的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用微生物组合物或制剂(参见例如上述制剂)，其中微生物组合物中至少一种细菌otu或物种可以使初级胆汁酸或胆汁盐去缀合。在各种实施方案中，微生物组合物中至少一种otu或细菌物种可以将初级胆汁酸或盐代谢为次级胆汁酸或盐。在各种实施方案中，otu的16srdna序列与图16中的序列或其一部分(例如，参见下文)具有至少95％同一性(例如，至少98％、至少99％或100％同一性)。
本发明进一步提供了治疗诊断患有胆汁淤积性疾病或病状或处于其风险下的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用如上文或本文其他地方所述的制剂。
在本文所述方法的各种实施方案中，受试者被诊断患有普通胆汁淤积(gc)、原发性硬化性肝硬化(psc)、原发性胆汁性肝硬化(pbs)、进行性家族性肝内胆汁淤积(pfic)、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、妊娠胆汁淤积症、胆管炎、肝炎、酒精性肝病、肝细胞癌、肝硬化、囊性纤维化、移植物抗宿主病(gvhd)或肝外胆管阻塞或处于其风险下。在各种实施方案中，肝外胆管阻塞是由于胆结石、炎性狭窄、癌症或胰腺炎。
本发明还提供了治疗诊断患有胆汁淤积性疾病或病状(参见，例如，上文列出的列表)或处于其风险下并且开了奥贝胆酸(oca)、熊去氧胆酸(udca)或奥贝胆酸或udca的衍生物的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用：(i)包含cdca、具有bsh活性的细菌或可以抑制一种和/或两种活性的化合物中的一种或多种的组合物；和(ii)药学上可接受的赋形剂。
本发明另外包括含有猪胆酸或可增加猪胆酸浓度的细菌的组合物。
本发明还包括治疗诊断患有胆汁淤积性疾病或病状(参见，例如，上文列出的列表)或处于其风险下的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用udca和包含具有bsh活性但不增加石胆酸(lca)水平的细菌的组合物。在各种实施方案中，所述组合物还包含可将初级胆汁酸或盐代谢为次级胆汁酸或盐的细菌。
本发明还提供了包含具有bsh活性的细菌的组合物，其用于治疗正用udca治疗的受试者，其中所述细菌不增加lca水平。在各种实施方案中，所述组合物还包含可将初级胆汁酸或盐代谢为次级胆汁酸或盐的细菌。
在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用oca。
在本文所述的任何制剂和方法的一些实施方案中，微生物组合物直接源自人粪便，是一种设计组合物，包含细菌孢子或包含产孢子(sporeforming)细菌。
本发明进一步提供了包含如上文和本文其他地方所述的制剂的组合物，其用于治疗诊断患有胆汁淤积性疾病或病状(参见，例如，上文列出的列表)或处于其风险下的受试者。
另外，本发明提供了用于鉴定在用于改变受试者的胆汁酸代谢的组合物中使用的细菌物种的方法。这些方法包括将细菌菌株的蛋白质编码序列与催化所需胆汁酸活性的蛋白质数据库中的参考序列进行比较，其中鉴定包括与参考序列具有同源性的序列的细菌菌株指示鉴定用于组合物的细菌菌株。
在各种实施方案中，所述方法还包括使用体外测定法或基于动物模型的测定法测试细菌物种的胆汁酸代谢活性。
在进一步的实施方案中，序列同源性水平为至少75％、80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。
如本文所用，“增强”是指(i)治疗性微生物组合物中不存在或不可检测(如通过诸如基因组测序或微生物技术的方法所确定)，(ii)在施用微生物组合物之前宿主生态位(niche)(例如，胃肠(gi)道，例如胃肠道内腔、胃肠道粘膜、结肠、小肠)中不存在、不可检测或以低频率存在，以及(iii)在施用微生物组合物之后可检测，或者在施用之前微生物以低频率存在，在施用微生物组合物后显著增加的情况下的一种或多种类型的微生物(例如细菌)的建立或显著增加；例如2倍、5倍、1×102倍、1×103倍、1×104倍、1×105倍、1×106倍、1×107倍或大于1×108倍。包含增强生态学的微生物可以源自诸如食物或其他环境来源的外源性来源，或者可以源自它们以低频率驻留的宿主中的生态位。所述增加可以是特定类型细菌的数目、类型多样性(例如进化枝、otu或细菌物种)的增加或两者。在一些实施方案中，建立参考水平用于比较以确定“不可检测”或“低”频率。
“进化枝”是指在系统发生树中统计学上有效的节点下游的操作分类单元(otu或系统发生树的成员)。进化枝是基于使用最大似然法由全长16srdna序列构造的系统发生树的拓扑来定义的。进化枝被构造成确保给定进化枝中的所有otu在指定数目的彼此自展支持的节点内，并且具有基于全长16srdna序列的遗传相似性。可以基于例如16srdna序列将同一进化枝内的otu区别为在遗传和系统发生上与不同进化枝中的otu不同。因此，单个进化枝内的物种可能具有保守的生态功能，并且在组合物中可以互换。
“生态失调”是指受试者的胃肠道或其他身体区域(包括粘膜或皮肤表面)的微生物群的状态，其中微生物生态网络的正常或健康多样性和/或功能被破坏。破坏导致微生物组的不健康状态，这可能是由于例如微生物组多样性的降低、一种或多种病原体或病理生物(pathobiont)的过度生长、仅在某些遗传和/或环境条件存在于受试者中时才能够引起疾病的共生生物的存在、或向不再为宿主受试者提供一种或多种基本功能且因此不再促进健康的微生物组的转变、或一种或多种代谢功能的平衡的变化。生态失调可例如通过使用抗生素来治疗或预防感染而引起。在一些情况下，生态失调与宿主生理学的改变相关，例如，由于例如肝胆系统功能病症而导致的肝肠胆循环减少。在一些情况下，例如在psc或溃疡性结肠炎中，生态失调与炎性状态有关。
“植入”是指存在于治疗组合物中的细菌类型(例如，细菌进化枝、otu或物种)在用组合物治疗的宿主的靶标生态位如胃肠道(例如，小肠或大肠)中的建立，并且其中在治疗前细菌类型在治疗宿主中不存在或未检测到。植入物种或otu可以如从施用最终剂量或治疗所测量来建立(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、8周、12周、3个月或6个月)。检测方法在本领域中是已知的，并且包括qpcr、16sv4下一代测序(ngs)和全宏基因组测序(wholemetagenomicsequencing；wms)以及其他高通量测序方法。检测限可以是例如在10e6中检测到一个细菌、在10e7中检测到一个细菌或在10e8中检测到一个细菌。在一些实施方案中，检测方法可以选择性地检测组合物中提供的细菌菌株。在一些实施方案中，检测方法可以选择性地检测组合物中提供的细菌的物种或otu。在不束缚于任何特定理论的情况下，植入的微生物群体可引起靶标生态位的环境改变，从而促进共生微生物的生长的有利条件，所述共生微生物能够催化从生态失调的生态向更代表健康状态的生态的改变。
如本文所用，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指将剂、组合物或制剂施用给被诊断患有疾病或预计处于其风险下的个体，以预防或改善疾病的至少一种体征或症状。术语“病症”和“疾病”在本文中可互换使用。术语“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指将剂或组合物施用给易患特定不良病状、病症或疾病的临床上无症状的个体，并且因此涉及预防疾病的至少一种体征或症状的发生。如本文所用，除非另有说明，否则术语“症状”包括体征和症状。
剂、组合物、制剂或其组合的“治疗有效量”或“有效量”为剂、组合物、制剂或其组合足以预防或改善病症的至少一种症状的量。本文所述的治疗组合物的治疗有效量可以根据以下因素而变化，所述因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及治疗组合物在个体中引起所需应答的能力，所述所需应答例如至少一种病症参数的改善或病症的至少一种体征或症状的改善(以及任选地，所施用的任何其他剂的作用)。治疗有效量还为治疗上有益的作用超过组合物的任何毒性或有害作用的量。如本文所述的组合物通常以治疗有效量施用。胆汁淤积性疾病的症状或与其相关的症状在本领域中是已知的。例如，普通胆汁淤积的症状在本领域中是已知的，并且可以包括例如瘙痒、黄疸、肝和脾肿大、疲劳、恶心和呕吐、肝硬化、肝衰竭、肝癌、胆结石和此类症状的生化标记。
细菌的“类型”是指按菌株、物种、进化枝、科或其他组织类别分组的细菌。在一些实施方案中，细菌物种被定义为具有与参考细菌的16srdna序列具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的至少一个16srdna序列的细菌。在一些情况下，细菌物种被定义为具有与参考细菌的对应16srdna可变区具有至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的至少一个16srdna序列可变区(v1-v8)(例如v4或v6区)的细菌。
本文中提及的每个专利文件和科学文章以及由此引用的那些专利文件和科学文章的全部公开内容都出于所有目的而以引用的方式明确地并入本文。
下面更具体地描述本发明的另外特征和优点。
附图说明
图1a和图1b描绘了体外筛选人细菌分离株和设计组合物用于胆汁酸代谢的结果。图1a描绘了说明细菌物种和单个菌株中酶活性和底物特异性的多样性的数据。每行对应于测试的单个菌株。列描绘了筛选方法涵盖的五类酶活性，以及用于筛选的胆汁酸底物。深色方形指示在指示的底物上存在酶活性，而空白指示无活性。图1b描绘了设计组合物及其构成菌株和胆汁酸活性。行指示所指示的组合物内的各个菌株。列指示每种菌株的酶活性和底物特异性。还以完整组合物的混合物的形式测试菌株以确认活性。可用于鉴定物种的至少一个16srdna序列提供于图16中。
图2描绘了来自用无ba组合物定殖无菌小鼠的实验的ngs数据。通过下一代测序(ngs)分析了在给药前和给药“无胆汁酸活性”组合物后1天、3天和7天收集的来自五只小鼠的粪便样品。y轴指示每个样品观察到最多20,000个读数的读数数目。各个进化枝由条形图中的不同阴影表示。属于“无胆汁酸”组合物中细菌的三个进化枝显示为深灰色、白色和浅灰色。
图3描绘了测试用设计组合物定殖是否可以改变无菌小鼠中的粪便胆汁酸含量的实验的数据。数据说明了用‘无胆汁酸(无ba)活性’组合物、‘仅bsh活性’组合物、‘最大ba活性’组合物或‘常规化’(小鼠源fmt)定殖的无菌小鼠的粪便胆汁酸概况。每次处理测试五只小鼠，并且胆汁酸概况描绘为总测定胆汁酸池的百分比(测定胆汁酸池意指样品中所有检测到的胆汁酸的总和)。*指示基于双因素anova和tukey多重比较检验的与常规化小鼠相比的显著差异。p值指示如下：**p≤0.01，****p≤0.001。
图4描绘了检查细菌对缀合的初级胆汁盐的分解代谢是否可以减少肝胆汁酸池的实验的结果在野生型、常规化和无菌小鼠以及用‘无ba活性’、‘仅bsh活性’或‘最大ba活性’组合物定殖的小鼠中测量了总肝胆汁酸池。每组测试五只小鼠，使用lc-ms测定总肝胆汁酸，并将结果归一化为样品组织重量(nm/mg)。将总胆汁酸池测定为肝脏组织中所有检测到的胆汁酸的总和，并使用以纯标准品的校准曲线进行定量。*指示基于配对t检验的与无菌小鼠相比的总胆汁酸水平的显著差异。p值指示如下：***p≤0.001，****p≤0.001。
图5a示出了检查了用具有不同胆汁酸分解代谢活性的细菌组合物定殖无菌小鼠是否可以显著改变回肠fxr基因表达的实验的结果。在用无胆汁酸活性(无ba活性)、仅bsh活性或最大ba活性组合物定殖的无菌小鼠中通过taqmanqpcr评估基因表达。对照包括通过口服管饲法(“fmt”)用鼠粪定殖的前无菌小鼠和用鼠微生物群定殖的常规小鼠。表达以相对于管家基因β-肌动蛋白的形式显示。****p≤0.0001，通过tukey多重比较(n＝4-8)。
图5b示出了说明用具有不同胆汁酸活性的细菌组合物定殖的无菌小鼠差异地影响回肠fgf15基因表达的实验的结果。在无菌小鼠、常规圈养的小鼠、用鼠源性fmt定殖的无菌小鼠以及用‘无ba活性组合物’、‘仅bsh活性’组合物或‘最大ba活性’组合物定殖的小鼠中评估回肠fgf15表达。表达以相对于管家基因β-肌动蛋白的形式显示。****p<0.0001，通过tukey多重比较(n＝4-8)。
图6a至图6d描绘了在cdca存在下测试奥贝胆酸(oca)介导fxr激活的基因表达的能力的实验的结果。在cdca存在下，奥贝胆酸(oca)刺激下游靶基因表达的能力增强了20倍。图6a：将hfxr报告细胞与cdca(0-100μm)、oca(0-10μm)或具有恒定浓度50μmcdca的oca(0-10μm)的连续稀释液一起孵育24小时。通过测量荧光素酶活性来评估fxr激活，并表示为相对于媒介物对照(0.2％dmso)的倍数变化。每个剂量重复进行三次。图7b：用胆酸饮食进行饮食补充导致体内fxr信号传导增加。图7c和图7d。oca以剂量依赖性方式激活fxr信号传导并调节fxr依赖性基因的表达。通过测量下游基因(包括肝脏中的cyp7a1和回肠中的fgf15)的表达来评估fxr信号传导。
图7a描绘了说明cdca而不是hca激活体外fxr信号传导的实验的结果。在hfxr荧光素酶细胞报告基因测定中单独所选胆汁酸的剂量反应曲线指示对于fxr信号传导，cdca具有完全激动剂活性，lca和dca(测试的最大浓度为100μm)具有低激动剂活性并且猪胆酸(hca；高达200μm)不具有激动剂活性。
图7b描绘了说明在基于荧光素酶的体外fxr激活测定中，在50μmcdca(如图7a所示，cdca的ec50＝50μm)存在下，猪胆酸(hca)对fxr的协同激活的实验的结果。dca和lca与hca显示出无显著的协同作用。由于对细胞的毒性增加，具有50μmcdca的100μmlca显示出倍数激活无差异。数据表示为相对于单独50μmcdca的倍数变化。
图8a和图8b描绘了显示了患有原发性硬化性胆管炎(psc)的患者的总胆汁酸水平和胆汁酸组成的变化的实验的结果。图8a：患者显示胆汁中总胆汁酸水平降低，总门静脉血和外周血胆汁水平对应增加。图8b：psc患者显示通常由肠道微生物组产生的次级胆汁酸和缀合的次级胆汁酸的比例降低，对应的上游缀合的初级胆汁酸显著增加。胆汁酸浓度使用lc-ms测量并使用适当的参考标准品进行定量。数据描绘为平均值±标准偏差。*指示基于双因素anova和tukey多重比较检验的psc与健康患者之间的显著差异。p值指示如下：*p≤0.1，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。
图9a至图9g显示了实验结果，在所述实验中与健康对照相比，以ddc-饮食诱导的胆汁淤积性疾病处理的常规圈养的小鼠显示出胆汁酸含量和肠道微生物概况改变。图9a：在ddc处理的常规圈养的瑞士白化病小鼠的血清生物标记物水平显著增加，包括碱性磷酸酶(alp)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、总胆红素(tbil)和胆固醇(chol)，证实存在胆汁淤积性肝病。图9b至图9d：与未处理的对照相比，患有ddc-饮食诱导的胆汁淤积性疾病的小鼠的2°和缀合2°胆汁酸水平降低，上游缀合1°胆汁酸对应增加。图9e：α多样性和β多样性指数显示在ddc处理以诱导胆汁淤积性疾病之前(d0)和之后(d21)的小鼠中不同的微生物群体。α多样性(左图)是基于shannon多样性指数的物种丰富度的量度，而β多样性(右图)基于主坐标分析(pcoa)被描述为两个加权轴上的分开距离。图9f：在用ddc处理以诱导胆汁淤积性疾病之前(d0)与之后(d21)的小鼠之间的显著不同的患病率(p≤0.2)的物种清单。图9g：在常规瑞士白化病小鼠中，具有已知7α-脱羟基化活性的菌株随胆汁淤积性疾病进展的显著损失。*指示ddc处理小鼠与对照小鼠(a-d)或ddc处理之前(d0)与之后(d21)的小鼠之间的显著差异。显著性分析基于双因素anova和tukey多重比较检验。p值指示如下：*p≤0.1，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001
图10a至图10e显示，在瑞士白化病小鼠中肠道微生物组不存在导致对ddc-饮食诱导的胆汁淤积性疾病的易感性增加，这种情况可以通过用小鼠源fmt逆转。与用ddc饮食处理时的常规圈养(ch)小鼠相比，无菌(gf)小鼠显示出更快的体重减轻(图10a)和显著更高的血清生物标记物水平，例如碱性磷酸酶(图10b)、丙氨酸氨基转移酶(图10c)和总胆红素(图10d)。在gf小鼠中用瑞士白化病小鼠源自身fmt定殖4周逆转这种对ddc诱导的疾病的易感性，体重减轻并且alp、alt和tbil的水平降低至与给予ddc-饮食的ch小鼠相当的水平。图10e示出了胆汁酸概况分析的结果，所述胆汁酸概况分析确定了与无菌小鼠相比，fmt处理足以恢复肠道中的胆汁酸组成。*指示相对于ddc处理的gf小鼠的显著差异。显著性分析基于双因素anova和tukey多重比较检验。p值指示如下：*p≤0.1，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001
图11a至图11e显示微生物组合物影响对ddc-饮食诱导的胆汁淤积性肝病的易感性。图11a至图11b：无菌c57bl/6和瑞士白化病小鼠显示出对肝病诱导的体重减轻的易感性，但常规瑞士白化病小鼠对疾病的抗性显著。图11c：在ddc饮食下，用常规c57bl/6供体小鼠fmt定殖无菌瑞士白化病小鼠与接受来自常规瑞士白化病供体小鼠的fmt的瑞士白化病小鼠相比导致更快的体重减轻。图11d：血清alp水平在用来自不同供体的fmt定殖的小鼠之间仍然相当，但在最终收集之前体重减轻方面有所不同。图11e：与瑞士白化病供体fmt定殖的小鼠相比，c57bl/6供体fmt定殖的小鼠具有明显更高水平的1°胆汁酸和更低水平的2°胆汁酸。(*注意，对于图11a，gf-c57小鼠是与其他三个组分开的实验的一部分。)
图12a至图12c显示，恢复微生物组拯救无菌小鼠对ddc饮食诱导的肝病的易感性。在无菌瑞士白化病小鼠中，用复杂常规瑞士白化病小鼠来源的fmt或恢复胆汁酸代谢的不太复杂的设计组合物(最大ba)进行处理响应于ddc饮食减轻了体重减轻(图12a)并且降低了alp水平(图12b)。图12c：在无菌小鼠中用常规小鼠来源的fmt或设计组合物(最大ba)定殖恢复了大部分粪便胆汁酸子集。*指示相对于ddc处理的gf小鼠的显著差异。显著性分析基于双因素anova和tukey多重比较检验。p值指示如下：*p≤0.1，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001
图13说明了饮食补充次级胆汁酸(去氧胆酸+石胆酸)对于对ddc-饮食诱导的胆汁淤积性疾病的易感性的有益影响。与暴露于ddc饮食时的未处理的无菌小鼠相比，接受dca+lca补充饮食的无菌瑞士白化病小鼠的体重减轻速率降低。
图14为显示了将bsh活性的生物信息学预测与体外测定的活性进行比较的结果的图和表。
图15为显示了将7α-脱羟基化活性的生物信息学预测的与体外测定的活性进行比较的结果的图和表。
图16为可用于本发明的各种组合物和方法的示例性细菌的全长16srdna序列的列表。
具体实施方式
本发明提供了用于预防、改善和治疗胆汁淤积性疾病的方法和组合物。根据本发明的方法，通过施用细菌组合物(例如本文所述的组合物)来改变治疗受试者的微生物组以影响胆汁酸代谢。在一些实施方案中，细菌组合物与药物组合使用。在一些实施方案中，与单独用药物进行治疗相比，当与组合物一起施用时，药物剂量或方案的量减少。在一些实施方案中，通过用本发明的组合物进行治疗，增加了药物的功效且/或减少了副作用。
胃肠道中微生物组介导的胆汁酸代谢涉及缀合的初级胆汁酸的去缀合，通过这个过程将极性牛磺酸或甘氨酸基团从缀合的初级胆汁盐中去除，生成初级胆汁酸(ridlon等人,j.lipidres.47:247-259,2006)。缀合的初级胆汁盐的浓度降低可以显著影响胆汁淤积性疾病的作用和/或进展，在所述胆汁淤积性疾病中，患者具有不期望的缀合的胆汁酸水平。此外，由于在例如上皮细胞、免疫细胞和肝脏中具有信号传导特性的初级和/或次级胆汁酸水平的增加，组合物可引起另外的作用。操纵胆汁酸途径可以具有治疗益处，如通过oca可对胆汁淤积患者具有治疗益处的报道所证明。如下所述，在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种可表达至少一种胆汁盐水解酶(bsh)的细菌物种或otu。
初级胆汁酸为缀合的初级胆汁盐的去缀合产物。初级胆汁酸的实例为胆酸(ca)和鹅去氧胆酸(cdca)。ca和cdca为类法尼醇x受体(farnesoidxreceptor；fxr)的配体，类法尼醇x受体为一种在肝脏中调控胆汁酸产生的核激素受体。fxr通过下调胆汁酸合成酶cyp7a1和cyp8b1来调控胆汁酸稳态(sinal等人,cell102:731-744,2000)。fxr信号传导的激活抑制了胆汁酸合成并增加了胆汁酸从肝脏的输出，从而减少了肝积累和潜在毒性胆汁酸对肝脏的损害(chiang,compr.physiol.3:1191-1212,2013)。胆汁酸合成的减少可以在肝脏中被直接介导并且可以通过胃肠道被fxr-fgf15/19-fgf4r途径间接介导，两者均由胆汁酸信号传导介导。fgf19为鼠fgf15的人直系同源物。fxr信号传导还通过其对nf-kb信号传导的作用而被认为具有抗炎成分(chiang,compr.physiol.3:1191-1212,2013)。正在开发用于治疗胆汁淤积性肝病(例如oca)的靶向核激素受体fxr(nr1h4)的分子。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物和方法涉及包括一种或多种细菌的组合物，所述一种或多种细菌可以将缀合的初级胆汁盐代谢为初级胆汁酸并且还可以任选地将初级胆汁酸代谢为次级胆汁酸。
在一些实施方案中，微生物组合成的初级胆汁酸，例如胆酸(ca)和鹅去氧胆酸(cdca)，是fxr的主要内源性配体并且因此在降低缀合的初级胆汁酸的浓度及其合成中起重要作用。所得的初级胆汁酸和次级胆汁酸可用以防止缀合的胆汁酸的肝积累以及来自潜在毒性胆汁酸的损害。因此，本发明提供了细菌组合物，包括设计组合物，其沿着影响回肠和肝脏中的内源性信号传导的靶向途径改变胆汁酸代谢。如下更详细地描述了本发明的组合物和方法。
组合物
本发明的组合物包含已经在例如人的健康哺乳动物的胃肠道中鉴定的微生物，例如细菌。在一些实施方案中，可用于组合物中的细菌的类型是在小肠(例如，人小肠)中鉴定的类型。在一些情况中，细菌的类型为主要在结肠中鉴定的那些。一些实施方案包括细菌(例如，小肠和结肠来源的细菌)的混合群体。在一些情况中，组合物来源于粪便制备物，例如直接来源于人粪便的制备物。“直接来源”于人粪便意指组合物的细菌是从人粪便中分离出的而几乎不培养此类细菌。
在一些实施方案中，组合物包含来源于单一物种的无菌培养物的细菌。将从此类培养物中选择的物种合并以产生组合物。这种组合物在本文中称为“设计组合物”。在一些情况中，对来自培养物的细菌进行诱导以形成孢子，并将此类孢子用于组合物中。设计组合物中的细菌通常是已在健康人粪便中鉴定出的物种。下文描述了设计组合物的实例。
在一些实施方案中，组合物包含：可以通过去除牛磺酸和/或甘氨酸缀合而将一种或多种缀合的初级胆汁盐代谢为初级胆汁酸的细菌；和/或可以通过胆汁酸的水解、氧化、还原、羟基化、差向异构化、7-α-脱羟基化(通过一系列coa连接、氧化和/或脱水反应)、脱硫以及二聚化而将一种或多种初级胆汁酸代谢为次级胆汁酸的细菌。例如，本发明的某些组合物包括可表达胆汁盐水解酶(bsh)活性并且因此可用于例如在胃肠道中增加缀合的初级胆汁盐的去缀合的细菌。其他组合物包括具有不仅包括胆汁盐水解酶活性，而且还包括胆汁酸氧化和7-α-脱羟基化的活性的细菌。可以选择能够表达特定功能的细菌以实现所需的胆汁酸改变。例如，可以针对细菌表达功能性bsh、7α-脱羟基酶、α-羟基类固醇脱氢酶(α-hsdh)、β-羟基类固醇脱氢酶或其他能够代谢胆汁酸的酶的能力来选择细菌。应注意，在一些情况中，所述活性是通过具有多于一种特定活性的操纵子来实现的，例如7α-脱羟基化，从而导致羟基胆汁酸代谢成脱羟基胆汁酸。针对细菌或细菌组合例如减少一种或多种缀合的初级胆汁盐(例如，甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺-α-鼠胆酸或牛磺-β-鼠胆酸)的量的能力来选择细菌或细菌组合。在一些实施方案中，针对细菌或细菌组合降低或增加一种或多种初级胆汁酸或次级胆汁酸(例如，胆酸、去氧胆酸、氧代胆酸(3-氧代胆酸、7-氧代胆酸或12-氧代胆酸)、异胆酸、鹅去氧胆酸、石胆酸、氧代鹅去氧胆酸(3-氧代鹅去氧胆酸或7-氧代鹅去氧胆酸)、异鹅去氧胆酸、α-鼠胆酸、β-鼠胆酸、γ-鼠胆酸(也称为猪胆酸)的量的能力来选择细菌或细菌组合。胆汁酸可使用本文所述且本领域中已知的lc-ms、薄层色谱法、gc-质谱法或本领域中已知的其他方法来测定。
本文所述的组合物通常包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45或50种类型的细菌。细菌类型可以是科、属、进化枝、物种或菌株。在一个实例中，组合物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45或50种不同的细菌物种。在另一个实例中，组合物包含来自至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个不同进化枝的细菌。在更具体的实例中，组合物包含来自表1、表2或表3的b或c部分的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45或50种不同物种；或来自表1中所列的以下每个进化枝中的至少5、10、15或全部18个的物种：1、6、86、87、90、100、101、164、195、196、197、203、204和297。在一些实施方案中，通过与参考序列(例如，16srdna序列)的同源性鉴定细菌物种。通常，与物种参考序列的16srdna序列(整个序列或一个或多个可变区如v4或v1-3)具有至少97％同一性(例如，至少98％、至少99％或100％同一性)的细菌菌株是与参考物种相同的物种。在图16中提供了此类参考序列的示例性列表。在一些实施方案中，组合物中不同otu或物种的数量少于60、50、30、20或15。通常，将组合物在药学上可接受的赋形剂中配制(见下文)。
出于本文所述的本发明的目的，进化枝是进化相关细菌物种的分组。由于它们的相关性，在进化枝内的细菌有较高的可能性共享诸如胆汁酸代谢的功能特征。进化枝是基于系统发生树的拓扑定义的，系统发生树是使用系统发生学领域中的普通技术人员熟悉的最大似然法由全长16s序列构建而成的。进化枝被构造成确保给定进化枝中的所有otu：(i)在指定数目的彼此自展支持的节点内，以及(ii)在5％遗传相似性之内。可以基于16s-v4序列数据将同一进化枝内的otu区别为在遗传和系统发生上与不同进化枝中的otu不同，而同一进化枝内的otu则密切相关。一个物种或otu被来自同一进化枝的另一个替换的组合物可能具有保守的生态功能，且因此可用于本发明。在一些实施方案中，可基于存在于包含一种或多种被证明表现出特定功能的细菌的进化枝中以及如本领域中已知并在本文中例示的进一步测试来选择可用于本发明的细菌。在一些实施方案中，组合物包含来自表1中五个、十个、十五个或全部18个进化枝的一种、两种或三种物种。进化枝中物种的示例性列表在表2中提供。表3是不同细菌物种的列表以及每种细菌物种的胆汁酸代谢活性的指示。当本文中指示本发明的组合物或制剂中包含表3的物种时，所述物种任选地包括一种或多种表3中指出的指示的胆汁代谢活性。也可以通过基于进化枝选择相关生物，然后根据表3中用于鉴定细菌的方法测试它们的所需活性来鉴定组合物。应注意，在表3中，空白单元指示对于对应菌株未测试到活性。
表1
表2：细菌进化枝中的示例性物种
在一些实施方案中，组合物中的所有生物都是专性厌氧菌。在一些实施方案中，组合物中的细菌是可以在体外培养以形成孢子的物种，并且此类孢子可以在体外发芽。在一些实施方案中，组合物中的细菌是孢子。在一些实施方案中，组合物中的细菌为营养形式。应当理解，细菌孢子的组合物或营养细菌的组合物是指尽管大多数细菌为特定形式(即，孢子或营养形式)，但是少数细菌可为不同形式，例如就孢子而言，组合物中的一些细胞可为营养形式，而就营养细菌而言，一些细胞可能呈孢子的形式。例如，组合物可以是100％、至少99％、至少97％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的孢子，或者组合物可以是100％、至少99％、至少97％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的营养细菌。在一些实施方案中，单个物种是以营养细菌和孢子的混合物的形式存在的。在一些实施方案中，使用菌落形成单位(cfu)测定法测定组合物中使用的物种的数量，但是可以使用本领域中已知的其他方法。在制备剂型中的组合物之日前或在施用剂型之日前可参考对以营养或孢子特定形式的细菌的百分比的评估。制备孢子的方法在本领域中已有描述，例如美国专利号9,011,834。
不仅在组合物中所提供的物种的多样性方面，而且在提供的生物总数方面，在治疗中有效的细菌的总数远低于健康人胃肠道中的生物的总数，即，没有必要施用完整的健康微生物组来达到治疗效果。
应当理解，如果在本申请中将组合物指示为“由特定类型的细菌组成”，则这仅指代组合物中存在的这些细菌类型。“由特定细菌列表组成”的细菌制剂可以包含其他非细菌材料例如一种或多种赋形剂(包括例如一个或多个胶囊)、水性或非水性介质(例如甘油、聚乙二醇、可可脂、水和/或缓冲液)以及一种或多种益生元或小分子药物。
同一性的测定
在一些实施方案中，进化枝、操作分类单元(otu)、物种和菌株是通过一个或多个16srdna序列鉴定的。进化枝、otu、物种和菌株的相关性可以通过进化枝、otu、物种或菌株之间的同一性百分比来确定。在一些情况下，同一性百分比是使用16srdna序列测定的。16srdna序列可以是全长序列、一个或多个可变区并且来自单个序列或衍生自来自菌株、物种或otu的多个16srdna序列的复合物。参考与查询序列之间的同一性百分比可以使用本领域中已知的方法测定。下面提供了用于此类测定的方法的非限制性实例。如本文所用，两个核苷酸序列之间的相关性是由参数“同一性”描述的。通常，如果两种细菌的16srdna同一性为至少95％，例如97％、98％、99％或100％，那么它们是相同的otu或物种。在一些实施方案中，测定全长16srdna分子的16srdna同一性。在一些实施方案中，测定16srdna分子的片段例如可变区(例如，v4)的16srdna同一性。在一些实施方案中，测定例如至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、300或更多个核苷酸长度(或本文所列任何数值之间的范围；或此类范围内的特定值)的片段的同一性。
在一个实施方案中，查询序列与参考序列之间的序列同一性程度是通过以下测定的：1)使用默认评分矩阵和默认空位罚分，通过任何合适的比对程序对两个序列进行比对，2)鉴定精确匹配的数目，其中精确匹配为在比对中比对程序在两个比对序列中的给定位置处鉴定出相同核苷酸，以及3)将精确匹配的数目除以参考序列的长度。
在另一个实施方案中，查询序列与参考序列之间的序列同一性程度是通过以下测定的：1)使用默认评分矩阵和默认空位罚分，通过任何合适的比对程序对两个序列进行比对，2)鉴定精确匹配的数目，其中精确匹配为在比对中比对程序在两个比对序列中的给定位置处鉴定出相同核苷酸，以及3)将精确匹配的数目除以两个序列中最长序列的长度。
在另一个实施方案中，查询序列与参考序列之间的序列同一性程度是通过以下测定的：1)使用默认评分矩阵和默认空位罚分，通过任何合适的比对程序对两个序列进行比对，2)鉴定精确匹配的数目，其中精确匹配为在比对中比对程序在两个比对序列中的给定位置处鉴定出相同氨基酸或核苷酸，以及3)将精确匹配的数目除以“比对长度”，其中比对长度为整个比对的长度，包括序列的空位和突出部分。
序列同一性比较通常是借助序列比较程序进行的。这些可商购或公开获得的计算机程序使用复杂的比较算法来比对两个或更多序列，以最好地反映可能导致两个或更多序列之间的一个或多个差异的进化事件。因此，这些算法使用评分系统进行操作，所述评分系统对相同或相似氨基酸的比对奖励分并且对空位插入、空位延伸和非相似氨基酸的比对罚分。比较算法的评分系统包括：
i)每次插入空位时分配罚分(空位罚分)，
ii)每次将现有空位延伸额外位置时分配罚分(延伸罚分)，
iii)在比对相同氨基酸时分配高分，以及
iv)在比对不同氨基酸时分配变量分数。
通常，将比对程序的默认值用于序列比较。可用于测定同一性的合适的计算机程序包括例如blast(blast.ncbi.nlm.nih.gov)。
在本发明的一个实施方案中，比对程序在所选序列的全长(例如全长、v1-3、v4或v616srdna序列)上优化比对。16srdna序列可以是单个序列或来自所选菌株、物种或otu的多个16srdna序列的复合物。例如，全局比对程序基于needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443-453,1970)。此类程序的非限制性实例是embossneedle和embossstretcher程序，可从ebi.ac.uk/tools/psa/获得。
在一个实施方案中，通过全局比对程序比对序列，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配的数目除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对长度是整个比对的长度，包括序列的空位和突出部分。在另一个实施方案中，全局比对程序使用needleman-wunsch算法，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配的数目除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对长度是整个比对的长度，包括序列的空位和突出部分。
在又另一个实施方案中，全局比对程序选自由embossneedle和embossstretcher组成的组，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配的数目除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对长度是整个比对的长度，包括序列的空位和突出部分。
一旦软件产生比对，就有可能计算相似性百分比(％)和序列同一性百分比。
制剂
在一些实施方案中，治疗包括将组合物施用于受试者，例如处于胆汁淤积性疾病或病状风险下、最近针对胆汁淤积性疾病或病状进行治疗或已经被诊断患有胆汁淤积性疾病或病状的患者。在一些实施方案中，组合物为口服剂型。在一些实施方案中，组合物包含作为活性组分的如本文所述的细菌聚生体与一种或多种药学上可接受的载体(赋形剂)的组合。在制备本发明的组合物时，细菌通常与赋形剂混合，被赋形剂稀释或被封闭在以例如胶囊、小药囊、纸或其他容器的形式的这种载体中。当赋形剂充当稀释剂时，它可为充当活性组分的媒介物、载体或介质的固体、半固体或液体材料。因此，制剂可以是以片剂、丸剂、粉剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气溶胶(以固体形式或在液体介质中)、包含例如最多10重量％的活性组分的软膏剂、软胶囊、硬胶囊、凝胶帽、片剂、栓剂、溶液或包装粉剂的形式。合适的赋形剂包括例如pbs、甘油、可可脂或聚乙二醇。
在制备制剂时，可以在与其他成分混合之前将固体形式的组合物研磨以提供合适的粒度。此外，可以通过使用本领域中已知的方法和形式来配制组合物，以便在向患者施用后提供活性组分的快速、持续或延迟释放，例如在结肠中的释放。
可以将组合物配制成单位剂型，每种剂型包含约102至约109个活otu，例如约104至约108个otu。在一些实施方案中，基本上所有细菌都为孢子形式。在一些实施方案中，细菌为孢子和营养形式。术语“单位剂型”是指适合作为用于人类受试者和其他哺乳动物的单元剂量的物理上离散的单位，每个单位包含经过计算以产生所需治疗效果的预定量活性成分以及合适的药物赋形剂。在一些情况下，多于一个单位剂型构成一个剂量。例如，单一剂量可以是一个单位剂型、两个单位剂型、三个单位剂型、四个单位剂型、五个单位剂型或更多。在一些情况下，构成单一剂量的单位剂型的数量为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30个单位剂型。单一剂量可以是例如103至约109个孢子，例如约104至约108个孢子。在一个实例中，剂量为1、2、3或4个在剂量中总共包含在102与108之间个孢子的胶囊。在具有多个剂型的单一剂量的情况下，剂型通常在规定的时间内例如在1小时、2小时、5小时、10小时、15小时或24小时内递送。
本文所述的组合物可以在宽剂量范围内有效，并且通常以药学有效量施用。
可以将包含本文所述的组合物的片剂或丸剂包衣或以其他方式配混以提供例如便于向胃肠道的目标区域例如结肠的递送(例如，通过改善可吞咽性)或改善向其递送的剂型。
在一些实施方案中，片剂或丸剂包含围绕组合物的内部组分和外部组分，外部组分用作内部组分的包封物。两种组分可由肠溶层分开，所述肠溶层可抵抗胃中的崩解并且允许内部组分完整进入十二指肠或延迟释放。
在一些实施方案中，通过鼻胃途径、通过内窥镜检查或在所需部位例如上肠道(例如，胃和/或十二指肠)或下肠道(例如，小肠和/或大肠)处或附近递送制剂的其他合适方法来施用包含本发明的组合物的制剂。有效剂量可以从由体外或动物模型测试系统导出的剂量-反应曲线或从临床研究外推而来。
此外，制剂可以任选地与本领域中已知的抗酸剂组合施用。
治疗方法
本文所述的组合物可用于施用于受试者，例如需要治疗的哺乳动物(例如人)，例如以预防或治疗胆汁淤积性疾病或病状。此类疾病的实例包括普通胆汁淤积(gc)、原发性硬化性肝硬化(psc)、原发性胆汁性肝硬化(pbs)、进行性家族性肝内胆汁淤积(pfic)、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、妊娠胆汁淤积症、胆管炎、肝炎、酒精性肝病、肝细胞癌、肝硬化、囊性纤维化和移植物抗宿主病(gvhd)。另外，可以通过本发明的方法治疗由于例如胆结石、炎性狭窄、癌症或胰腺炎而患有肝外胆管阻塞的受试者。例如，可以提供bsh、7α-脱羟基化和羟基类固醇脱氢活性(与具有低活性的参照物相比，活性升高)的maxba活性组合物可用于治疗显示胆汁酸组成异常(例如缀合的初级胆汁酸异常积累)的胆汁淤积性疾病患者。
在一些实施方案中，对oca和/或udca治疗有反应但是经历不良副作用(例如，严重的(不可忍受的)瘙痒、肝脏相关的不良反应和/或与oca治疗相关的生化检查的升高、或不期望的hdl-c的降低)的患者可以用仅bsh组合物或本文所述的具有至少bsh活性的其他组合物治疗，从而允许oca和/或udca的施用量或施用频率减少；或增加患者对正常或升高剂量的oca和/或udca的耐受性。在不束缚于任何特定理论的情况下，可以通过改变此类患者中的胆汁酸水平，初级胆汁酸和/或次级胆汁酸例如cdca与oca或udca协同作用，从而改善了患者的肝病(例如pbc)的治疗。
本发明的方法和组合物可用于通过改善胆汁酸代谢来改善这些疾病和病状中的一种或多种症状。尽管这些方法不一定解决胆汁淤积性疾病的病因病理，但通过减少总胆汁酸池并将缀合的初级胆汁盐转化为初级胆汁酸和/或次级胆汁酸来消除胆管损伤的根源可对疾病进展和患者健康具有重大影响，包括在不存在重大替代方法的情况。此方法的优点可包括：治疗其他难治性疾病；与目前可用的治疗相比治疗具有较少的不期望的副作用；或例如通过减少可用治疗的有效剂量，与目前可用的治疗相关的不良副作用减少。除非另有说明，否则本文所用的术语“总胆汁酸”意指在动物中检测到的主要胆汁酸的总和。在人类中，这通常至少指胆酸、甘氨胆酸、去氧胆酸、牛磺胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和石胆酸。在一些实施方案中，这还包括α-鼠胆酸、β-鼠胆酸、γ-鼠胆酸(猪胆酸)、氧代-胆汁酸和异-胆汁酸。在一些实施方案中，哺乳动物受试者为患有胆汁淤积性疾病或病状的一种或多种症状的人类受试者。在一些实施方案中，可以通过测量胆汁酸组成来评估组合物的功效，例如，选择的胆汁酸与彼此相比的相对水平或者一种或多种胆汁酸与参考相比的浓度。可以使用例如粪便或血清胆汁酸水平来进行此类测量。在一些实施方案中，可以测定治疗的代谢指征。在一些实施方案中，可以测定组合物中施用的细菌物种的存在或不存在。此类测量还可用于监控患者治疗，例如以确定患者是否需要用组合物进行额外治疗。鉴定适当参考的方法是本领域中的技术人员已知的，并且包括例如健康患者群体中一种或多种胆汁酸的水平、被诊断患病的未治疗患者群体中一种或多种胆汁酸的水平或与治疗前水平相比治疗后患者中一种或多种胆汁酸水平的改善。
在一些实施方案中，有效治疗与治疗前患者体内的alp活性或浓度相比，降低了例如肝脏、血液或血清中碱性磷酸酶(alp)活性或浓度；或与参考相比，降低了浓度或活性。与
在一些实施方案中，可以通过与治疗前胆红素水平相比胆红素的减少来评估组合物的功效。例如，在一些实施方案中，有效的治疗导致患者尿液中的胆红素水平降低至每分升25毫克以下。也可以在血液中测定胆红素，例如总胆红素小于1.0mg/dl。测定胆红素水平的方法在本领域中是已知的。
在一些情况下，用本发明的组合物进行的有效治疗导致以下中的至少一种：碱性磷酸酶水平降低至<1.67x正常值上限(uln)；总胆红素降低至≤uln；或碱性磷酸酶从基线降低了≥15％。
施用给患者的治疗组合物的量和频率将根据所施用的内容、诸如预防或治疗的施用目的、患者的状态、施用方式等而变化。在治疗应用中，组合物可以足以治愈或至少部分遏止疾病的症状和其并发症的量施用给已经罹患所述疾病的患者。有效剂量将取决于正治疗的疾病病状以及主治临床医师根据诸如疾病严重性、患者年龄、体重和一般病状等因素所作的判断。参考上文在有关制剂的部分中提到的剂量信息。
在一些实施方案中，受试者在施用组合物之前接受抗生素治疗。在一些实施方案中，受试者接受抗生素治疗并且直到自抗生素治疗以来经过至少一天、两天、三天、五天、一周、两周、三周或四周且在施用组合物之前才接受所述组合物。在一些实施方案中，受试者接受多剂量的组合物以确保覆盖给药期。在一些实施方案中，受试者在施用组合物之前具有胆汁淤积性疾病的症状。在其他实施方案中，受试者在施用组合物之前没有表现出胆汁淤积性疾病的症状，例如，预防性地施用组合物以降低胆汁淤积性疾病导致临床症状的风险。
在一些实施方案中，在疾病、病症或病状改善之前仅施用一次组合物。在一些实施方案中，以多于两天的间隔施用治疗组合物，例如每三、四、五或六天一次、或者每周一次或频率低于每周一次，例如每两周一次、每三周一次、每4周一次、每6周一次、每8周一次、每12周一次、每月一次、每两月一次、每三月一次、每四月一次或每六月一次。在一些情况下，根据设定的时间表间歇性地施用组合物，例如每天一次、每周一次或每月一次，或者当受试者从原发性疾病复发时。在另一个实施方案中，将组合物长期施用给处于胆汁淤积性疾病风险下的个体。
在一些实施方案中，组合物通常是肠道施用的。例如，施用可以是通过吞咽形式(例如，丸剂、小药囊、胶囊、糖浆等)或通过口服或鼻管(包括鼻胃、鼻空肠、口腔胃或口腔空肠)口服施用的。在其他实施方案中，施用包括直肠施用(例如，通过灌肠剂、栓剂或结肠镜检查)。可以将组合物施用于胃肠道的至少一个区域，包括口腔、食道、胃、小肠、大肠或直肠。组合物可以以药物的形式口服施用，例如粉剂、一个或多个胶囊、一个或多个片剂、凝胶或液体。组合物还可以通过口服途径或通过鼻胃管以凝胶或液体形式、或通过直肠途径以凝胶或液体形式、通过结肠镜进行灌肠或滴注或通过栓剂来施用。
在施用组合物之前，受试者可以进行结肠清洁准备。结肠清洁的方法在本领域中是已知的，例如用于为受试者准备结肠镜检查的那些方法。而且，如本领域中已知的并且确定为适合于受试者，可以在施用组合物时任选地用抗酸剂或缓冲剂治疗受试者以增加胃ph。
组合疗法
如上所讨论，本发明的组合物或制剂(例如本文所述的那些)可以与可用于治疗或预防胆汁淤积性疾病的另一种剂组合施用。因此，例如，本发明的组合物或制剂可以与以下一种或多种剂组合施用：
测试候选组合物的方法
鼠模型
胆汁酸代谢受到不利影响的动物模型可用于测试候选组合物改善胆汁淤积性疾病的症状的能力。使用此类模型，将候选组合物施用于此模型，并且疾病的至少一种体征或症状的改善或疾病进展速率降低指示候选物可以用于治疗胆汁淤积。
这种模型的一个实例是多药耐药性2敲除(mdr2-/-)小鼠。mdr2是人mdr3的小鼠同源物，是一种将磷脂酰胆碱(pc)从肝脏输出到肝小管中的转运体。pc不存在被认为导致在没有被适当地隔绝在胶团中的初级胆汁盐中胆汁组成异常高。这种初级胆汁盐过量被认为导致胆管损伤，从而引起这些动物的胆汁淤积。(smit等人,cell75:451-462,1993；fickert等人,gastroenterology127:261-274,2004)。mdr2-/-敲除小鼠发展为胆管损伤，其特征与被诊断患有原发性硬化性胆管炎(psc)和其他与胆汁酸异常有关的病症的人中的特征相似，特别是在胆管狭窄和肝纤维化方面。这些小鼠缺乏胆管磷脂，这导致由胶团胆汁酸过多引起的胆管炎症和损伤并发展为模仿原发性硬化性胆管炎的病理生理。
基于以下观察结果，larusso和同事报告了mdr2-/-模型的进一步发展，即具有mdr2-/-遗传背景和升高的无菌水平(gf)的小鼠与常规饲养(ch)的mdr2-/-小鼠相比发展出更严重的疾病形式(tabibian等人,hepatology2015)。在此模型中，gf升高的mdr2-/-小鼠在与gf状态相关的肠组织中表现出典型的变化，例如结肠隐窝变浅、回肠绒毛长度减小以及上皮紧密连接蛋白闭锁小带蛋白(zonulaoccluden)的表达减弱。但是，与常规喂养的mdr2-/-小鼠相比，在60天龄时观察到肝胆疾病的血清生化标记物的差异，包括天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶和胆红素的增加。胆管细胞衰老是通过肝组织中的p16ink4a原位杂交来评估的，并且在无菌小鼠中显著增加。这些生化和组织化学标记物通过组织病理学测量得到进一步证实。此外，对胆汁酸组成的分析显示不存在来源于微生物活性的初级胆汁酸或次级胆汁酸，如针对无菌小鼠所预期的。在gfmdr2-/-小鼠中血清生化指标(biochemistry)(包括碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶和胆红素)均显著较高。较年轻的gfmdr2-/-小鼠(30天龄)也表现出血清生化标记物的改变，这指示与常规喂养的mdr2-/-队列相比，肝胆疾病更为严重。
fickert等人在2007年所开发的胆汁淤积性疾病的第二模型(fickert等人,am.j.pathol.171(2):525-536,2007)使用引起胆管炎和肝纤维化的化合物3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢可力丁(ddc)诱导胆管损伤和梗阻。在传统瑞士白化病(swissalbino)小鼠中，ddc治疗导致炎症、纤维化、胆管梗阻和慢性胆管炎，伴有诸如碱性磷酸酶和丙氨酸转移酶水平升高等症状，诸如在psc患者中见到的那些。在4周的时间段内可见症状，这使其成为研究胆汁淤积性疾病的快速模型。然而，尚未探究微生物组在此化学模型中的作用，并且在此专利中阐明了微生物胆汁酸代谢对无菌小鼠对ddc-饮食诱导的肝病的易感性的影响。
据报道，就初级胆汁酸(通过hplc)而言，胆汁酸分布在gf与chmdr2-/-小鼠之间没有显示出显著差异。但是，总血清胆汁酸水平在mdr2-/-小鼠中显著较高。同样，总血清胆汁酸在胆汁淤积的ddc-饮食模型中升高，但胆管胆汁酸水平并未随疾病而改变。由于缺乏微生物活性，无菌小鼠不能产生次级胆汁酸。因此，无菌模型能够评估被设计成突出特定的胆汁酸酶活性的各种细菌组合，例如初级胆汁酸的去缀合或初级胆汁酸向次级胆汁酸的转化。另外，此筛选还能够评估特定的初级胆汁酸或次级胆汁酸或胆汁酸的组合，以鉴定可以介导体内疾病表型变化的那些。在一些实施方案中，在此模型或本文所述的其他模型中测试的细菌组合物改变初级胆汁酸和次级胆汁酸的总水平，从而能够测量改变胆汁酸组成对疾病表型的影响。
在鼠psc/胆汁酸疾病模型中评估组合物功效的其他方法包括：使用tabibian等人所述的方法，与无菌同窝仔相比，用限定的微生物组合物常规化后对小鼠进行组织学评估。(hepatol.63:185-196,2015)。据报道，与chmdr2-/-小鼠相比，无菌mdr2-/-患有晚期肝纤维化的比例显著较高，并且在一些情况下，到60天时表现出肝硬化，而chmdr2-/-小鼠没有发展肝硬化的报道。因此，用本文所述的组合物治疗的gfmdr2-/-小鼠的肝纤维化的减少指示组合物可用于治疗psc或与胆汁酸信号传导有关的其他病症，例如nafld或nash。使用gfmdr2-/-小鼠评估候选组合物效果的其他方法包括检测在可用于治疗psc或其他胆汁酸代谢病症的组合物存在下胆管反应和胆管缺失的减少以及衰老胆管细胞比例的降低，以及血清中肝酶如alp和胆红素的减少。
如上所述，可以在mdr2-/-gf模型或ddc-饮食诱导的胆汁淤积性疾病模型的无菌版本中测试候选组合物。也可以使用例如在实施例(下文)中描述的适当的胆汁酸代谢病症的任何其他合适的模型。可用于治疗此类病症的候选组合物(即治疗组合物)是在施用合适的一段时间时，与没有接受候选组合物的动物相比，使所述病症的动物模型中的疾病的至少一种体征或症状减少的组合物。
鉴定疾病的体征和症状的方法及其改善在本领域中是已知的。例如，可以使用比色法来测定血清中的胆汁酸浓度(例如，来自trinitybiotech(jamestown，ny)的试剂盒)。还可使用薄层色谱法、高效液相色谱法(hplc)、气相色谱法或液相色谱法与串联质谱法的组合(gc-ms或lc-ms/ms)来检测胆汁酸代谢酶的活性和胆汁酸组成的变化。
在疾病的动物模型中预防或改善与所选胆汁酸病症有关的至少一种体征或症状的组合物被称为“治疗组合物”，并且可用于治疗所述病症。
等效方案
所有技术特征可以以此类特征的所有可能组合的形式个别地组合。
在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明能以其他具体形式来实施。因此，前述实施方案在所有方面都应被视为说明性的，而非是对本文中描述的本发明的限制。
实施例
以下非限制性实施例进一步说明了本文所述的本发明的实施方案。
实施例1：材料和方法
材料
牛磺胆酸(t-ca)、牛磺鹅去氧胆酸(t-cdca)、甘氨胆酸(gca)、甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)、胆酸(ca)、鹅去氧胆酸(cdca)、去氧胆酸(dca)、石胆酸(lca)和3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢可力丁(ddc)购自sigma-aldrich(st.louis,mo)。β-鼠胆酸(bmca)、7-氧代胆酸、7-氧代鹅去氧胆酸和牛磺-β-鼠胆酸(t-mca)购自santacruzbiotechnology(dallas,tx)。α-鼠胆酸(amca)、牛磺-α-鼠胆酸(t-mca)、12-氧代胆酸、12-氧代去氧胆酸、3-异去氧胆酸(3α12β)、猪去氧胆酸(3α6α)、猪胆酸(hca)和3-氧代去氧胆酸购自steraloids(newport,ri)。通过将化合物溶解在乙醇中来制备基于lc-ms的酶法测定中所用的胆汁酸储备液。将用于基于细胞的测定的鹅去氧胆酸(cdca；sigma-aldrich)和奥贝胆酸(oca；medchemexpress,nj)溶解在dmso中以制成储备液。
定殖
无菌和常规小鼠购自taconicbiosciences(hudson,ny)，并在6-10周龄之间(包括端值)使用。通过口服管饲法向无菌小鼠给药100μl7.5％碳酸氢钠以中和胃肠道酸并改善所施用的细菌的存活能力。接受碳酸氢钠约10-30分钟后，通过口服管饲法向小鼠给药200μl特定细菌组合物。以无菌方式处理小鼠，将其圈养于无菌隔离笼(isolator)中，并提供无菌食物和水。所有研究均得到每个研究地点的各个动物管理和使用委员会的批准。
粪便收集
在给药前即刻直接收集小鼠的新鲜粪粒，然后在给药后1天、3天，7天或每周收集。在每个时间点，将两个粪粒收集到无菌的1.7ml微量离心管中。将一个粪粒在-80℃下冷冻以用于通过lc-ms进行分析。将第二个粪粒在100μlpbs中的15％甘油(v/v)中均质化，然后在-80℃下冷冻以用于微生物学和序列分析。
序列分析
使用16srdnav4序列、使用下一代测序(ngs；高通量测序)分析序列，并作图以鉴定最接近的对应otu。所有物种调用(call)的序列同一性为至少97％(精确到0.1％)。将内部专有的人工管理的参考otu数据库用于分配物种同一性。
胆汁盐水解酶(bsh)活性的测定
将在pbs中的细菌全细胞悬浮液与缀合的胆汁酸的混合物一起孵育，每种缀合的胆汁酸的最终浓度为150μg/ml。将在96孔板中的反应混合物在厌氧条件下于37℃下孵育4小时。孵育后，从厌氧室中取出样品。将等体积的乙腈添加到样品中以提取胆汁酸，将板离心以沉淀细菌，并且将所得上清液通过0.2μm过滤器过滤，从而得到用于lc-ms分析的样品。
羟基类固醇脱氢酶和7α-脱羟基化活性的测定
为了测定羟基类固醇脱氢酶(hsdh)和7α-脱羟基化活性，将在脑心浸液(bhi)培养基中的细菌悬浮液个别地与各自浓度为100μm的胆酸或鹅去氧胆酸在厌氧室中在37℃下孵育4小时。孵育后，从厌氧室中取出样品。将等体积的乙腈添加到样品中以提取胆汁酸，将板离心以沉淀细菌，并且将所得上清液通过0.2μm过滤器过滤，从而得到用于lc-ms分析的样品。
设计组合物
使用研究细胞库(rcb)的集合来创建用于体内研究的设计组合物(de)。使用每个细胞库的营养滴度(cfu/ml)来计算创建针对每种剂量具有最终滴度1.00e+07cfu/菌株的设计组合物所需的每个体积。要添加到设计组合物中的单个rcb的体积计算如下：
[所有剂量所需的总营养滴度(例如，对于10个以1.00e+07的剂量＝总计1.00e+08cfu)]/[rcb营养滴度，以cfu/ml为单位]＝对于10个剂量1.00e+07cfu/剂量所需的体积
对定义的de中的每个rcb重复此操作以确定体积，然后将计算体积的每个rcb在厌氧室中合并以配制rcb，涡旋，离心分离并且重悬于最终体积的15％甘油-pbs中。
从小鼠粪便和肝脏样品中提取胆汁酸
称量小鼠粪粒，在10xw/v提取缓冲液(50％甲醇的水溶液)中均质化，并在冰上提取1小时。类似地称量肝组织样品，在2xw/v提取缓冲液(50％甲醇的水溶液)中均质化，并在冰上提取1小时。孵育后，用等体积的冷乙腈进一步提取样品，离心，并通过0.22μm过滤器过滤上清液，然后负载在lc-ms上以用于分析。
从门静脉、血清和胆汁样品中提取胆汁酸
将外周血清样品在乙腈中1:1稀释，离心并且将上清液通过0.22μm过滤器过滤，然后负载在lc-ms上以用于分析。将门静脉血清样品在乙腈中1:10稀释，并进行类似的离心和过滤，然后进行lc-ms分析。最后，将胆汁样品在乙腈中1:100稀释，离心并且通过0.22μm过滤器过滤以用于lc-ms分析。对人和小鼠样品都采用了相同的程序。
胆汁酸的lc-ms分析
使用在0.2μm柱前过滤器后配备了microsolv双齿c18柱的agilent1260hplc分离胆汁酸。使用含0.1％甲酸的水和乙腈梯度以0.4ml/min的流速实现分离。以5μl的体积注入样品。hplc系统与使用agilent低质量调谐混合物校准到质量范围为50至1700m/z的brukercompasstmqtof质谱仪联接。另外，将每次运行校准到在每次运行开始时注入的参考质量溶液。胆汁酸以阴性模式检测，并通过独特的m/z和与已知纯标准品相比的保留时间以及使用布鲁克(bruker)数据分析软件确定的峰下面积进行鉴定。使用由在pbs中的纯标准品(浓度范围为0.001μm至100μm)生成的校准曲线对代谢物进行定量。对于粪便样品，单个胆汁酸被描述为总胆汁酸池的百分比，其中将总胆汁酸池测定为样品中所有检测到的胆汁酸的总和。对于肝脏样品，将总胆汁酸水平测定为所有检测到的胆汁酸的总和，归一化至样品组织重量(nm/ng)。通过lc-ms所检测的胆汁酸列于如下表4中。
表4
基因表达谱
将在给药后3天取自小鼠的远端回肠样品在收集时快速冷冻。通过均质化，然后按照制造商的说明书使用qiagen
hfxr荧光素酶报告基因测定
通过indigobiosciences、如serestherapeutics所指示、使用indigo的fxr报告基因cho细胞系进行fxr报告基因细胞测定，所述细胞系表达fxr受体杂合体，其中天然n端dna结合结构域(dbd)已被酵母gal4dbd替换。报告基因萤火虫荧光素酶在功能上与gal4上游激活序列(uas)连接。简而言之，将报告基因细胞进行cdca、oca或媒介物(0.2％dmso)的系列稀释曲线，并在37℃下在高湿度、5％co2箱中孵育24小时。与底物和检测试剂一起孵育后测定发光。此外，使用活细胞多重(livecellmultiplex；lcm)测定法(indigobiosciences)在测定中测定活细胞计数。将数据显示为归一化为媒介物组(图7)。
血清碱性磷酸酶水平(alp)的分析
将全血或血清样品用于alp测量。将100μl样品负载到vetscan哺乳动物肝轮廓盘(profiledisc)(abaxis)上，并使用vetscanvs2系列化学分析仪(abaxis)进行分析。打印出alp水平以及其他血清生化分析报告以用于比较。
此实施例中描述的方法可用于鉴定具有特定胆汁酸代谢特征的细菌。其他此类方法是本领域中的技术人员已知的。
实施例2：设计组合物证明体外特定胆汁酸活性
在无菌小鼠模型中，申请人证明了使用设计的细菌组合物既可靶向降低总胆汁酸水平，又可特定地将初级胆汁酸转化为其次级对应物。申请人还证明了肠中的胆汁酸特定信号传导受设计组合物对次级胆汁酸途径的靶向恢复的影响。这些实验在下面进一步详细描述。
为了产生具有特定代谢活性的细菌菌株的组合，设计了用于表征各个细菌菌株的体外胆汁酸代谢活性的方法。因此，使用了基于lc-ms的筛选方法。筛选了近200株菌株，导致在多种人细菌分离株中鉴定出多种胆汁酸代谢活性，包括去缀合、氧化和7-α脱羟基化(7α-deoh)；实例显示于图1a(还参见表3)。胆汁酸去缀合受到胆汁盐水解酶(bsh)催化。不同的bsh可以表现出对不同的缀合的初级胆汁盐活性的偏好。在一些情况下，细菌具有多于一种bsh，其中至少两种的底物比活性彼此不同。例如，申请人查询了在人微生物组项目数据库中代表的1129个基因组的bsh序列，并且发现43％的基因组具有与bsh序列对应的序列且这些基因组具有在1个与6个之间的此类序列。因此，在一些情况下，选择de的物种的标准是存在多于一种bsh，例如，代谢多种类型的缀合的初级胆汁盐的能力。在其他情况下，针对特异性选择物种，例如，仅裂解一种特定的缀合的胆汁盐的能力。氧化反应受到羟基类固醇脱氢酶(hsdh)催化，而7α-脱羟基化是由bai操纵子促进的多步过程。令人惊讶的是，对于那些测试了一个属内的多个菌株的情况，对于测试的三个反应中的任一个，都没有明显的底物特异性或酶活性模式。另外，在来自不同供体的同一物种的多个分离株之间也见到了活性水平的特异性变化。
如先前所提及的，进化枝内的物种具有相似功能的可能性仍然很高，从而提供了可用于产生具有特定功能的组合物的物种池。但是，物种和otu和菌株之间的活性变化(表3)使得可以通过体外测定或基因组分析来确认感兴趣的菌株中的活性，这是构建具有目标胆汁酸代谢能力的组合物的必要条件。
然后，对已确定胆汁酸代谢活性的细菌菌株以设计成具有特定胆汁酸代谢特征的组合形式进行测试。设计并制备了三种具有特定胆汁酸代谢活性的组合物(图1b)。对照‘无ba活性’组合物由以单一菌株的形式当如本文所述进行测试时不显示胆汁酸代谢活性的菌株组成。此外，当在上述测定中使用时，混合的组合物没有表现出任何可检测的胆汁酸代谢活性，表明彼此组合的这些菌株相对于胆汁酸代谢活性没有互补的特征。第二组合物‘仅具有bsh活性的组合物’由唯一检测到的胆汁酸代谢活性为bsh活性的菌株组成，导致组合物限于初级胆汁盐的去缀合并且不能将去缀合的初级胆汁酸进一步修饰为其次级衍生物。测试的缀合的胆汁盐包括甘氨酸和牛磺酸缀合的胆酸和鹅去氧胆酸以及牛磺酸缀合的α-鼠胆酸和β-鼠胆酸。最终组合物‘最大胆汁酸’(最大ba活性)组合物被设计成涵盖bsh介导的去缀合活性以及上述两种次级胆汁酸酶活性氧化和7α-去羟基化。在体外测定中证实了组合的活性(图1b)。
这些数据表明，可以使用体外方法来构建对改变胆汁酸代谢有效的组合物。
定殖的无菌小鼠迅速植入组合物中的物种
将细菌胃肠定殖的无菌小鼠模型用于表征体内特定细菌组合物的胆汁酸代谢活性。无菌小鼠不携带任何微生物。因此，只要将小鼠保持在无菌环境中，将特定的细菌组合物引入无菌小鼠中就实现组合物的胆汁酸代谢活性的直接分析。
将五只无菌小鼠用由前文所述的体外实验中所使用的三种细菌菌株组成的“无胆汁酸活性”组合物定殖。在给药组合物之前和给药后6小时、1天、3天和7天收集粪便样品，并通过ngs分析以检测定殖微生物。以下定殖数据是以细菌进化枝水平报告的。16sv4ngs测序实现用推断的物种鉴定来准确鉴定细菌进化枝。这是可能的，因为‘无胆汁酸’组合物中的三个物种属于不同的进化枝；在这种情况下，在进化枝水平的分析提供了与定殖后小鼠中存在的菌株有关的准确数据。
基于使用ngs没有观察到细菌计数，确认了在实验开始时所有五只小鼠都是无菌的(见图2)。从小鼠处理前的粪便中未培养出细菌，进一步证实了它们的无菌状态。到24小时为止，处理小鼠的微生物组只具有来自组合物细菌所属的进化枝的序列。后来的时间点(3天和7天)也发现仅包含“无胆汁酸”组合物中的细菌所属的三个进化枝。这指示仅组合物中的细菌稳定地定殖于无菌小鼠的胃肠道。这些数据说明了，无菌模型可用于测试定殖实验以测定组合物。
定殖的无菌小鼠显示出特定的粪便胆汁酸概况
为了进一步检查鼠定殖模型对于测试与胆汁酸代谢有关的组合物的合适性以及细菌组合物以靶向方式改变胆汁酸代谢的能力，分析了用设计组合物定殖的无菌小鼠的粪便样品的胆汁组成，并与无菌和常规化对照小鼠进行比较。
在无菌小鼠的粪便中仅检测到缀合的初级胆汁盐。缀合的初级胆汁盐是由肝脏合成的，并且它们在粪便中的流行说明缺乏由胃肠道细菌催化以产生(未缀合的)初级和次级胆汁酸的胆汁酸代谢。同样，用无胆汁酸活性组合物定殖的小鼠显示在粪便样品中完全缺乏可检测的初级胆汁酸和次级胆汁酸(图3)，其胆汁酸概况与未处理的无菌小鼠相同。相比之下，常规化小鼠(其为用来自无特定病原体小鼠(spf小鼠)的粪便制备物定殖的无菌小鼠，即图3中的“常规化”小鼠，在本文中称为粪便微生物组移植(fmt)的过程)显示出与未处理的野生型小鼠相似的不同粪便胆汁酸概况(图3)，包括一系列初级胆汁酸和次级胆汁酸。
微生物组介导的胆汁酸代谢中的第一步为去缀合，通过bsh从缀合的初级胆汁盐中去除牛磺酸或甘氨酸残基，以释放出游离胆汁酸(ridlon等人,jlr47:247-259,2006)。用限于仅bsh活性的细菌组合物定殖无菌小鼠导致小鼠粪便样品中除先前检测到的缀合的初级胆汁盐外还包含去缀合的初级胆汁酸(初级胆汁酸)，但不包含下游的次级胆汁酸(图3)。在一种情况下，一只小鼠具有低水平的小鼠鼠胆酸衍生物异-胆汁酸(3α,6α鼠胆酸)。在一只小鼠中检测到的这种异常胆汁酸的水平比常规野生型小鼠中通常观察到的水平低10倍，并且可能是肝脏中不完全鼠胆酸合成的副产物。
此实施例的数据说明，通过引入具有bsh活性的细菌组合物，可以在体内使缀合的初级胆汁盐去缀合。此外，这说明体内活性可以对应于组合物的体外活性(图1b)。
将缀合的初级胆汁盐去缀合后，胃肠道微生物组将所得初级胆汁酸进一步修饰成一系列次级胆汁酸，这些胆汁酸可影响信号传导和肝脏中胆汁酸代谢的调控。用最大ba活性组合物定殖无菌小鼠7天产生了许多去缀合初级胆汁酸和次级胆汁酸，其水平与用小鼠spf/fmt小鼠粪便样品定殖的常规化小鼠中观察到的水平相似(图3)。在最大ba定殖的小鼠中恢复的次级胆汁酸包括7α-脱羟基化胆汁酸(dca和lca)和氧代-胆汁酸(7-氧代ca、3-氧代cdca、12-氧代dca、3-氧代lca)和异-胆汁酸(udca)，说明微生物胆汁酸代谢的很大一部分可用设计细菌组合物恢复。唯一观察到的例外是异-胆汁酸3β,12α-dca，其在最大ba活性定殖小鼠中未检测到。在不束缚于任何特定理论的情况下，3β,12α-dca的形成需要由7β-hsdh酶催化的对dca具有特异性的胆汁酸异构化活性，此实验中未选择所述酶用于细菌组合物。最大ba活性组合物中可能不存在此活性。
tcdca在常规化小鼠中检测到，而在最大ba小鼠中未检测到(图3)。这指示最大ba组合物将所有tcdca完全转化为dca和氧代-胆汁酸，而常规化小鼠则没有，即与常规化小鼠的微生物组合物相比更有效地转化缀合的胆汁酸。这进一步说明，de可以在体内选择性地形成胆汁酸池，并且这种特征可用于患有与胆汁酸代谢或信号传导缺陷相关的疾病的患者。
此外，如图3所示，最大ba组合物显示出hca活性的存在，而在常规化小鼠中未检测到。在这种情况下，有可能的是，最大ba组合物不像常规化组合物那样完全代谢hca。这些数据进一步说明，具有选定胆汁酸活性的设计组合物对于改变患者的胆汁酸池的组成以选择性地正常化或以其他方式调节池以改善胆汁酸相关疾病的有用性。
恢复胃肠道中的细菌胆汁酸代谢降低了总肝胆汁酸池
在本发明的一些方面，胆汁淤积性疾病患者可受益于胆汁酸池的减少。初级胆汁酸和次级胆汁酸通过fxr进行信号传导以调控肝脏中的胆汁酸合成，从而调控cyp7a1和其他胆汁酸合成基因的表达以减少胆汁酸产生(当存在时)(hylemon等人,jlf50:1509-1520,2009)。据报道，与常规化小鼠相比，缺少初级和次级胆汁酸池的无菌小鼠的胆汁酸产生增加并且总胆汁酸水平较高(sayin等人,cellmetab.17:225-2235,2013)。为了确定设计细菌组合物对胆汁酸合成的影响，使用前述方法测定了无菌小鼠、用设计组合物定殖的小鼠和常规化小鼠的总肝胆汁酸池。
在这些研究中，与fmt/常规化小鼠和野生型小鼠相比，无菌小鼠的肝胆汁酸池增加(图4)。用无ba活性组合物定殖对总胆汁酸池没有影响，总胆汁酸池保持升高并且与未处理的无菌小鼠相当。用仅bsh或最大ba组合物定殖导致总肝胆汁酸池显著下降，达到与野生型小鼠相当的水平(图4)，即，初级胆汁酸和次级胆汁酸都通过胆汁酸受体进行信号传导，从而影响肝脏中的胆汁酸池。
fgf15响应于具有特定胆汁酸活性的细菌组合物受到差异调控
已报道，胆汁酸，特别是未缀合的初级胆汁酸cdca，通过类法尼醇x受体fxr(nr1h4)在回肠进行信号传导，导致fgf15上调。fgf15作用于肝脏以减少胆汁酸合成，并且因此减少了肠肝系统中的总胆汁酸。因此，fgf15基因表达被用作测试由设计细菌组合物诱导的胆汁酸概况的变化是否可以改变功能特别是fxr信号传导的生物标记物。如文献中所报道，期望fxr水平本身不改变(sayin等人,cellmetab.17:225-235,2013；song等人,tox.appl.pharmacol.283:57-64,2015)。
在这些实验中，与无菌动物相比，用鼠源粪便微生物组移植(fmt)定殖的无菌动物显著上调了fgf15基因表达(200x-300x)(图5b)。这些常规化小鼠的fgf15水平与在野生型常规小鼠中观察到的水平相当。这些数据证实了复杂的胃肠微生物组在调控fxr信号传导中的作用。与无菌小鼠相比，用含有最大胆汁酸活性的限定细菌组合物定殖的小鼠的fgf15水平也增加。这些数据说明在次级胆汁酸存在下fxr信号传导的恢复(图5b)。出人意料的是，给予无胆汁酸活性的组合物的动物显示fgf15水平少量增加(约8倍)，指示一些fgf15活性可通过微生物组的存在来诱导，而与次级胆汁酸代谢无关(图5)。但是，在用无胆汁酸组合物定殖的小鼠中的fgf15的水平保持显著低于在常规或最大胆汁酸活性定殖的小鼠中观察到的水平。相比之下，用仅bsh活性组合物定殖的小鼠产生了初级胆汁酸，但不产生次级胆汁酸，且预计可以激活fxr，显示fgf15表达没有变化(图5b)。
与初级胆汁酸cdca共同处理增强oca的体外活性
奥贝胆酸(oca)已获fda批准用于治疗原发性胆汁性胆管炎(pbc)，通常与熊去氧胆酸组合或在一些患者中作为单一治疗方案。它也正在临床开发中作为psc和nash的治疗剂。但是，oca可能具有不良的副作用。奥贝胆酸(一种fxr激动剂)是cdca的合成衍生物，据报道，与cdca相比，其在激活人fxr方面的功效高100倍。
使用人fxr报告基因细胞系进行实验，以确认所报告的oca和cdca相对于媒介物的差异效力(图6)。在基于荧光素酶的测定中，将报告细胞与oca或cdca的系列稀释液一起孵育，并读出fxr活性。fxr与胆汁酸结合，然后作为转录调节因子变为活性的。与cdca相比，oca的功效几乎高100倍。然后，我们测定了cdca与oca的共同孵育对fxr激活的影响。令人惊讶的是，添加ec50(50um)的cdca影响了oca对fxr的活性。在cdca存在下，oca剂量-反应曲线左移约20倍，指示将cdca添加到oca可增加oca效力(图6a)。
考虑到与当前oca给药标准相关的副作用，较低剂量的oca可以显著改善患者体验，同时仍提供有效治疗。为了确定胆汁酸共同治疗是否改善体内oca功效，我们首先鉴定了小鼠模型中oca和感兴趣的胆汁酸的有效fxr信号传导的剂量范围。在小鼠中，鹅去氧胆酸占胆汁酸池的很小一部分，而胆酸(ca)似乎是fxr的更有效的配体(song等人,tox.appl.pharmacol.283:57-64,2015)。因此，我们测试了剂量范围的oca以及固定浓度的ca对小鼠中fxr信号传导的影响。基于cyp7a1(肝脏)和fgf-15(回肠)的表达监测回肠和肝脏fxr信号传导。oca施用导致cyp7a1表达的剂量依赖性降低和fgf-15水平的增加(图6c-d)，表明在肝脏和回肠中通过fxr的有效信号传导。补充胆酸的饮食还降低了cyp7a1表达并增加了回肠中的fgf-15水平，表明补充ca时激活fxr(图6b)。
接下来，我们确定了胆酸与oca的共同治疗是否可以通过fxr改善oca信号传导的功效，因此降低有效治疗所需的oca的有效浓度。在对udca治疗有应答的pbc患者中，建议oca为5mg的单一日剂量，其中在3个月后不存在反应的情况下，选择增加给药至10mg。以这些浓度给药与副作用特别是瘙痒有关。用产生初级胆汁酸如胆酸(ca)或鹅去氧胆酸(cdca)的微生物组组合物增加oca的功效可以在较低剂量下产生等效的功效，并可以减轻与oca相关的副作用，同时仍实现有效治疗。给药量或频率的减少也可能增加能够成功耐受用oca治疗的患者数量，从而为更广泛的人群提供治疗。
根据这个发现，在一些实施方案中，本发明涉及一种细菌组合物，当将其施用于经历oca治疗的患者时，其可以增加cdca和/或胆酸。在一些情况下，组合物还可以调节(例如，降低)hsdh和7α-脱羟基化活性。
cdca以剂量依赖性方式增强非活性猪胆酸的功效
猪胆酸(hca；为6-α-羟基鼠胆酸；oca为6-α-乙基胆酸)是一种胆汁酸，据报道在胎儿胆汁中以中等水平存在，而在成年人中则以较低水平存在(setchell等人,j.biol.chem.263:16637-16644,1988)。hca没有已知的功能特性。使用前文所述的体外报告基因测定，申请人测试了hca是否具有hfxr激动剂活性。结果如图8所示。
在这些实验中，与cdca相比，单独的hca在高达200um的浓度下不具有人fxr激动剂活性，并且甚至活性低于相对较弱的激动剂lca和dca(图7a)。令人惊讶地，在50umcdca存在下，hca以剂量依赖性和协同方式激活人fxr(图7b)。用cdca与dca或lca的组合未见此效果，其以更加成的方式上调了hfxr激动剂活性；但是与lca的组合在较高浓度(100μm)下显示出毒性(下图)。在不束缚于任何特定理论的情况下，cdca可能增强6-α位修饰的胆汁酸。
这些数据指示可以上调cdca和/或hca的细菌组合物可以用于增强内源性fxr信号传导以治疗胆汁淤积性疾病。
实施例3：胆汁淤积性疾病的鼠模型的治疗
缺乏mdr2基因的小鼠发展胆汁淤积性疾病(tabibian等人,hepatology63(1):185-196,2016)。无菌mdr2-/-小鼠发展更快且更严重的胆汁淤积，大概是由于除缺乏微生物组合成的初级胆汁酸和次级胆汁酸之外来自缺乏适当量的磷脂酰胆碱的胆汁的胆管细胞毒性。用不能去缀合初级胆汁盐或不能形成次级胆汁酸的细菌(如上所述的无bsh和仅bsh的组合物)定殖这些小鼠，并与用能够形成一整套的次级胆汁酸的微生物组(如上的最大ba)定殖的小鼠比较疾病进展，证明了通过干预微生物组来控制胆汁淤积进展的能力。
无菌mdr2-/-小鼠也可用于模拟特定组合物对于改善胆汁淤积性疾病或胆汁淤积性疾病症状的功效。与用可增强胆汁酸代谢的组合物(例如仅bsh活性组合物或最大ba活性组合物)定殖此类小鼠相比，预期用保护性较差的微生物组(例如无ba活性组合物)定殖的小鼠模型更快或更广泛地发展疾病。使用小鼠模型评估此类组合物，监测可增加初级和/或次级胆汁酸代谢的组合物对胆汁淤积性疾病的进展和严重性的影响。可用于此类组合物的评估的无菌干预小鼠模型包括无菌mdr2-/-缺失模型或在野生型小鼠中的胆汁淤积性疾病的ddc诱导的化学模型(例如，fickert等人,am.j.pathol.171:525-536,2007)。常规mdr2-/-小鼠中的抗生素治疗可以用作其他模型；使用抗生素清除功能异常的微生物组，然后用保护性组合物代替。可以改善次级胆汁酸代谢的微生物组(例如仅bsh或最大ba组合物)可以减慢疾病进展并降低已有的胆汁淤积性疾病的严重性。
实施例4：
psc患者中次级胆汁酸水平降低
在原发性硬化性胆管炎(psc)中，胆管阻塞被认为会导致患者的肝胆系统和外周组织中胆汁酸浓度的显著变化，从而导致肝脏中信号传导和组织损伤的改变(chazouillers,clin.res.hepatol.gasteroentrology36:s21-s25,2012)。trottier等人的工作(trottier等人,dig.liverdis.44:303-310,2012)显示，在psc患者的外周血清中的总胆汁酸显著增加，伴有次级胆汁酸的下降。但是，与肝胆循环有关的系统中的胆汁酸水平的变化(如胆汁或门静脉血清)没有被充分地表征。在这里，我们分析了7名psc(晚期肝病)患者的门静脉、胆汁和外周血清中的25种独特胆汁酸。将这些测量值与12名健康供体进行比较，并且显示胆汁淤积性肝病患者中胆汁酸的总水平和组成发生了显著变化。
与健康供体相比，外周血清中总胆汁酸水平显著升高，并且门静脉血中的水平也升高(图8a)。相比之下，psc患者的胆汁中的总胆汁酸水平显著较低，表明胆汁从肝脏胆囊的流动减少并指示胆管阻塞(图8a)。因此，血清中胆汁酸的对应增加可反映肝脏中胆汁酸的积累，这些胆汁酸泄漏到血清中。当分解成其构成胆汁酸基团时，外周和门静脉血清和胆汁中缀合的和未缀合的微生物源次级胆汁酸的水平降低(图8b)。这包括通过微生物催化的活性(例如7α-脱羟基化和hsdh)产生的胆汁酸。未缀合的初级胆汁酸(也通过肠道中的微生物bsh活性产生)在外周血清中减少，且在门静脉血清中的含量也较小。这些变化伴随着由肝脏合成的上游缀合的初级胆汁酸的增加，表明肠道微生物组催化的初级和次级胆汁酸代谢途径的损害。微生物组合成的胆汁酸的这种下降表明肝病患者的微生物组发生了变化，并可能损害了肝脏中的信号传导。
胆汁淤积性疾病的小鼠模型显示出与人psc患者相当的胆汁酸概况变化
目前，将两种小鼠模型(在一年内发展疾病的mdr2-/-缺失模型(参见上文)以及更快速的ddc-饮食诱导的胆汁淤积模型)用于研究胆汁淤积性肝病的进展。最近发表了ddc-饮食模型作为胆汁淤积性疾病的遗传mdr2-/-敲除模型的替代(fickert等人,am.j.pathol.171(2):525-536,2007)。这个模型说明在psc患者中通常见到的胆管阻塞并显示了升高的alp和alt血清水平也与psc中的胆汁淤积性疾病有关。然而，ddc-饮食诱导的胆汁淤积性疾病对小鼠胆汁酸代谢的影响仍然未知。
为了评估胆汁酸含量的变化，将常规圈养的c57bl/6小鼠置于ddc-饮食中并监测体重减轻。基于体重减轻、血清生物化学和整体健康评估疾病严重性。在治疗21天后，接受ddc饮食的小鼠显示alp、alt、总胆红素和胆固醇的水平升高(图9a)，证实胆汁淤积性疾病的发展。然后，与健康的未治疗对照相比，评估这些小鼠的粪便、肝脏和门静脉血样本的胆汁酸含量。
用ddc饮食处理的小鼠显示在粪便、肝脏和门静脉样本中未缀合和缀合的次级胆汁酸的相对丰度的降低(图9b-d，
微生物组不存在增加对胆汁淤积性疾病的易感性
先前的研究显示，在mdr2-/-缺失模型中，微生物组不存在导致胆汁淤积性肝病的更快速发展。因此，我们首先在ddc饮食诱导的胆汁淤积性疾病模型中评估了微生物组对疾病发展的重要性。将无菌瑞士白化病小鼠置于无菌补充ddc的饮食中并监测疾病发展。将体重减轻、血清生物化学和整体健康用于监测疾病进展。同时，也将常规圈养的瑞士白化病小鼠置于ddc饮食中。与常规小鼠相比，无菌小鼠显示出快速的体重减轻(图10a)和对肝脏生物化学的更严重改变(图10b-d)，表明微生物组在抵抗肝病中起着至关重要的作用。
用小鼠来源的fmt定殖恢复无菌小鼠的胆汁酸代谢和胆汁淤积性疾病抗性
为了进一步证明微生物组在抵抗胆汁淤积性疾病中的重要性，我们用来源于常规圈养的瑞士白化病小鼠的小鼠fmt定殖无菌瑞士白化病小鼠。使无菌小鼠定殖4周，然后用补充ddc的饮食处理以诱导胆汁淤积性肝病。与无菌小鼠相比，用fmt处理的小鼠发展疾病的速率较慢，并且在对ddc-饮食的应答方面与常规小鼠相当(图10)。与无菌瑞士白化病小鼠相比，fmt定殖小鼠的体重减轻和血清alp水平均较低，表明恢复健康的微生物组足以扩大对ddc诱导的胆汁淤积性肝病的抗性。胆汁酸概况分析还确定，与无菌小鼠相比，fmt处理足以恢复肠道中的胆汁酸组成(图10e)。
微生物组成决定了对胆汁淤积性疾病的易感性
当将常规瑞士白化病和c57bl/6背景小鼠置于补充ddc的饮食中时，与瑞士白化病小鼠相比，来自c57bl/6背景的小鼠更易患饮食诱导的肝病(图11a至图11b)。与相同年龄的瑞士白化病小鼠相比，c57bl/6小鼠显示更快的体重减轻。然而，血清alp水平仍然相当。但是，在微生物组不存在的情况下，无菌瑞士白化病小鼠不再具有抗性，并且以与c57bl/6小鼠相当的速度发展疾病(图11a至图11b)，表明微生物组组成而不是遗传背景可能决定小鼠对肝病的易感性。无菌瑞士白化病和c57bl/6小鼠体重减轻的速率相似，并且显示血清中的alp水平升高。c57bl/6小鼠的alp水平略高，表明在那个遗传背景下疾病的一些进一步发展。
为了进一步比较微生物组在两个遗传上不同的菌株之间的作用，我们测定了c57bl/6来源的微生物组对于瑞士白化病小鼠对ddc饮食诱导的胆汁淤积性疾病的易感性的影响。用c57bl/6来源或瑞士白化病来源的粪便微生物组移植(fmt)处理无菌瑞士白化病小鼠，并使其定殖4周。然后将小鼠置于补充ddc的饮食(0.1％)中，并监测胆汁淤积性疾病的发展。体重减轻和血清生物化学是疾病的主要标记物，而胆汁酸代谢和肝脏组织学被用作微生物组功能和疾病发展的其他标记物。
与用瑞士白化病来源的fmt定殖的小鼠相比，用c57bl/6来源的fmt定殖的瑞士白化病小鼠显示出更快的早期体重减轻(图11c)，但血清alp水平相当(图11d)。c57bl/6定殖的小鼠对ddc饮食的应答看上去与无菌小鼠更相似，而瑞士白化病定殖小鼠的应答类似于常规小鼠，表明它们的起始微生物组与疾病进展之间的联系。为了进一步评估不同微生物组的潜在作用，我们在ddc处理之前比较了用c57bl/6来源的fmt定殖的小鼠与用瑞士白化病来源的fmt定殖的小鼠的粪胆汁酸概况。与在基线时用瑞士白化病来源的fmt治疗的小鼠相比，用c57bl/6来源的fmt处理的小鼠的初级胆汁酸水平明显较高，而7-α脱羟基化和异构化的次级胆汁酸水平较低(图11e)。这说明两个微生物组(c57bl/6对瑞士白化病)之间的代谢活性存在显著差异，并且可以解释这两个小鼠品系之间的易感性差异。在更易感的c57bl/6fmt定殖小鼠中次级胆汁酸的消耗模拟了在psc患者(图8)和胆汁淤积的小鼠模型(图9)中见到的次级胆汁酸的损失，再次指出了微生物胆汁酸代谢在胆汁淤积性肝病进展中的作用。
用设计组合物恢复微生物胆汁酸代谢拯救无菌小鼠对胆汁淤积性疾病的易感性
上文结果指示，微生物组在预防ddc-饮食诱导的肝病中具有重要作用。特别是，胆汁酸代谢随肝病进展的变化以及次级胆汁酸水平降低的小鼠对肝病的易感性增加表明微生物胆汁酸代谢和胆汁酸本身在对胆汁淤积性肝病的应答中具有作用。
如图3所示，可以设计细菌组合物以特定地恢复微生物胆汁酸代谢，从而重构小鼠肠的胆汁酸。我们测试了一种这样的组合物最大ba(图2和图3)在ddc-饮食诱导的胆汁淤积模型中保护无菌小鼠免受肝病的功效。最大ba组合物被设计成恢复所有主要的胆汁酸代谢活性，包括bsh、7α-脱羟基化和hsdh(图1)。用最大ba组合物处理无菌小鼠，并使其定殖4周。然后将定殖的小鼠暴露于补充ddc的饮食中，并与暴露于ddc饮食的无菌和常规对照相比，监测肝病的发展。与ddc饮食中未定殖的无菌小鼠相比，用最大ba组合物处理的小鼠显示较慢的体重减轻速率并维持较低的血清alp水平(图12a至图-12b)，表明在最大ba组合物存在下疾病进展较慢。在用ddc处理降低肝病进展速度方面，用设计细菌组合物定殖与fmt处理一样有效，并且与常规小鼠相当。
根据这个发现，在一些实施方案中，本发明涉及一种细菌组合物，当施用于被诊断为胆汁淤积性疾病的患者时，其可以恢复初级和次级胆汁酸的水平，例如，用这种组合物处理可以导致初级和次级胆汁酸水平在健康人体内观察到的范围内。
用mfmt定殖拯救无菌mdr2-/-c57bl/6小鼠的早期致死性。
tabiban等人(tabiban等人,hepatol.63:185-196,2015)先前显示，与常规mdr2-/-小鼠相比，在fvb遗传背景下的无菌mdr2-/-小鼠发展肝病的速率较快且严重性较高。我们选择使用具有mdr2-/-缺失的c57bl/6小鼠，这种遗传背景已被证明在ddc饮食诱导的胆汁淤积性疾病模型中对胆汁淤积性疾病更敏感(图11)。在c57bl/6背景下的mdr2-/-缺失突变体的无菌衍生导致早期致死性，其中存活的幼崽在达到4周龄之前显示出严重的疾病和致死性。
鉴于在ddc-饮食诱导的胆汁淤积性疾病模型中小鼠源fmt在拯救无菌小鼠的易感性中的有效性(图10)，我们确定了fmt处理对在c57bl/6遗传背景下的无菌mdr2-/-小鼠的存活的影响。当幼崽2周龄时，用小鼠fmt定殖养母，连同它们的铺垫和笼子。fmt定殖导致处理的mdr2-/-幼崽存活超过12周达到100％，而保持无菌的未处理的幼崽在4周龄内显示出致死性。定殖对mdr2-/-无菌小鼠存活的显著影响进一步指出了微生物组在改善胆汁淤积性肝病中的作用。与构成肠道中大部分胆汁酸活性的组合物(最大ba)相比，缺乏胆汁酸活性的测试组合物(无ba)将提供胆汁酸在调节胆汁淤积性肝病进展中的特定作用的细节。
胆汁酸补充足以增加无菌小鼠对ddc-饮食诱导的肝病的抗性
接下来，我们探讨了在微生物组不存在的情况下，初级和次级胆汁酸补充对ddc-饮食诱导的肝病进展的具体作用。将无菌小鼠喂食补充有初级(ca+cdca)或次级(dca+lca)胆汁酸的饮食，持续1周，然后暴露于ddc处理。胆汁酸补充与ddc处理一起继续进行以维持信号传导。基于与接受ddc饮食的无菌和常规对照相比的体重减轻和血清生物化学监测小鼠的肝病发展速率。
在ddc暴露后7天，初步体重分析显示，与接受ddc饮食的常规小鼠相比，喂食补充dca+lca的饮食的小鼠的体重减轻的速率明显更慢(图13)。接受补充dca+lca的饮食的小鼠显示平均体重减轻87％，相比之下接受ddc饮食的常规小鼠为77％。在接受ddc的更易感的无菌小鼠中，这也构成了体重减轻速率的显著改善。这说明即使在微生物组不存在的情况下，次级胆汁酸信号传导在调节对肝病的易感性中也具有重要作用。通过专门恢复肠道中dca和lca水平来模仿这些作用的组合物可以显著降低肝病进展。正在进行的分析将评估dca+lca饮食以及补充了初级胆汁酸、胆酸和鹅去氧胆酸的饮食的持续影响。
根据这个发现，在一些实施方案中，本发明涉及一种细菌组合物，当将其施用于被诊断为胆汁淤积性疾病的患者时，其可以增加dca和lca水平和/或胆酸。
微生物胆汁酸活性有助于对ddc-饮食诱导的胆汁淤积性肝病的抗性
为了确定恢复次级胆汁酸代谢的能力对于微生物组对于对肝病的易感性的有益影响是否必要，用由缺乏所有微生物胆汁酸活性的细菌组成的设计组合物处理小鼠(无ba，图1)。这种组合物不能改变肠道中的胆汁酸，并且定殖的小鼠将保留与无菌小鼠相同的胆汁酸组成。在这些实验中，用无ba组合物、最大ba组合物(恢复
实施例5：使用基因同源性搜索方法鉴定具有胆汁酸代谢活性的菌株
下面介绍了两个可用于基于菌株的全基因组序列鉴定具有胆汁酸代谢活性潜能的菌株的基因同源性搜索方法的实施例。在一种方法中，利用blastp将菌株全基因组序列的蛋白质编码区与催化所需胆汁酸活性的已知表征蛋白的数据库进行成对比较；包含与数据库中任何蛋白质具有足够相似性的蛋白质的菌株被鉴定为推定具有所需胆汁酸活性。在第二种方法中，将菌株的全基因组序列的蛋白质编码区与由催化所需胆汁酸活性的已知特征蛋白的多序列比对得到的序型隐蔽马尔科夫模型(profilehiddenmarkovmodel；hmm)进行比较；包含与序型hmm具有足够相似性的蛋白质的菌株被鉴定为推定具有所需胆汁酸活性。序列数据库的详细信息、序型hmm和适当的相似性截止在要查询的胆汁酸活性之间有所不同，如下所述。
图14显示了将bsh活性的生物信息学预测与体外测定的活性进行比较的结果。考虑所有已在体外筛选且全基因组序列可供使用的菌株。左图考虑了通过lc-ms体外筛选的菌株，而右图考虑了通过tlc筛选的菌株。这两个图都显示了菌株基因组中与bshhmm最显著比对的e值。基因组比对的显著性与体外筛选的结果显著相关(mann-whitneyu检验；对于lc-ms，p＝0.02，对于tlc，p＝0.0005)。e值的截止＝1e-40可用于预测哪些菌株将具有或不具有bsh活性(虚线)；显示了用于此分类截止的所得混淆矩阵(对于lc-ms，测定灵敏度＝0.86，特异性＝0.5，准确度＝0.88，p＝0.01；对于tlc，测定灵敏度＝0.77，特异性＝0.63，准确度＝0.74，p＝0.0002)。应注意，由于tlc测定本身的灵敏度较低，所以基因组预测的假阳性率可能被高估。此外，由于lc-ms测定中真阴性的数量少，所以基因组预测的特异性可能被低估。
图15显示了将7α-脱羟基化活性的生物信息学预测与体外测定的活性进行比较的结果。考虑所有已在体外筛选且全基因组序列可供使用的菌株。箱形图考虑了通过lc-ms体外筛选的菌株(没有通过tlc筛选菌株)。这两个图都显示了菌株基因组中与baiehmm最显著比对的e值。基因组比对的显著性与体外筛选的结果显著相关(mann-whitneyu检验；p<1e-8)。e值的截止＝1e-40可用于预测哪些菌株将具有或不具有7α-脱羟基化活性(虚线)；显示了用于此分类截止的所得混淆矩阵(灵敏度＝1.0，特异性＝1.0，准确度＝1.0，p<1e-5)。应注意，由于真阳性的数量少，所以真实的灵敏度、特异性和准确度可能被高估。
其他实施方案在以下权利要求的范围内。
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