灵芝中对酒精性肝损伤有保护作用成分的分离及应用的制作方法

本发明涉及一种从灵芝中提取、分离出对酒精性肝损伤有保护作用成分的方法及其应用，属于天然产物领域。
背景技术：
：现在社会各种各样的应酬越来越多，常常出现饮酒过度的现象，严重者会导致酒精中毒，经常过量饮酒必然会伤害肝脏，甚至出现酒精肝。酒精可引起消化、循环系统等多器官损伤，其中肝损伤最为常见。近年来，过量摄入酒精已成为仅次于病毒性肝炎后肝损害的首要原因。大量饮酒致急性肝损伤病例逐年增多，酒精性肝病是严重危害公共卫生的常见病。不仅如此，大量饮酒还会导致神志不清、行动迟缓、学习记忆能力下降等醉酒症状，从而带来很多社会问题。酒精性肝病(alcoholicliverdisease，ald)是由于长期大量饮酒所致的肝脏疾病，初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化，严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死甚或肝功能衰竭。至今临床上还没有有效防治其发生发展的理想药物。因此，能够快速解酒还能够保护肝脏不受损伤的解酒护肝类产品是十分重要的研究方向。现有的解酒饮料多为解酒护肝效果不佳，口感单一，含有防腐剂，长期饮用会导致肝脏受到2次伤害。目前，还没有关于如何有效提取灵芝成分以提高酒精性肝损伤保护作用的研究。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种灵芝中对酒精性肝损伤有保护作用成分的分离方法及应用。本发明所采取的技术方案是：灵芝成分在制备防治或辅助防治酒精性肝损伤产品中的应用；所述灵芝成分的制备方法包括以下步骤：1)灵芝醇提取物制备：加入灵芝药材重量7～9倍的60～100％v/v乙醇溶液，加热至沸提取0.8～1.2h，过滤，收集滤液；将滤渣重复前述提取过程1～2次；合并各次收集的滤液，60～70℃减压浓缩，烘干，得灵芝醇提取物；2)灵芝醇提取物的层析：将上步所得灵芝醇提取物用有机溶剂溶解，加入柱层析硅胶，混匀，干燥，装入填好柱的层析柱中；然后进行洗脱，洗脱流程如下：收集上述编号为11的洗脱液样品，即得。优选的，所述防治酒精性肝损伤产品包括能够降低酒精性肝损伤中tg、mda含量、和/或提高gsh含量的产品。优选的，所述产品包括保健品、药剂。优选的，步骤1)中烘干的温度为78～82℃。优选的，步骤1)中，乙醇溶液浓度为70～95％。优选的，步骤1)中灵芝醇提取物的制备方法还包括回流法、超声法、煎煮法、浸渍法、渗漉法。优选的，步骤2)中，所述的有机溶剂包括甲醇、乙腈、乙醇中的至少一种。优选的，步骤2)中，灵芝醇提取物与加入柱层析硅胶的质量比为1：0.3～3；步骤2)中，加入灵芝醇提取物之前，柱层析硅胶需先于100～110℃干燥25～35min。优选的，步骤2)中，加入灵芝醇提取物中的柱层析硅胶大小为100～400目；步骤2)中，所述层析柱包括正相硅胶柱、反相硅胶柱。优选的，步骤2)中，所述干燥温度为60～80℃；干燥方法包括常压干燥、减压干燥。本发明的有益效果是：本发明通过特定的分离方法，分离出了对酒精性肝损伤有显著保护作用的灵芝成分，其在降低tg、mda含量，提高gsh含量等方面均具有显著效果，优于其他分离成分和灵芝醇提取物。附图说明图1各组小鼠酒精肝损伤模型实验中tg含量对比图；注：@@表示p<0.01(vs空白组)；#表示p<0.05，##表示p<0.01(vs模型对照组)；！表示p<0.05(vs样品i组)；图2各组小鼠在酒精肝损伤模型实验中的mda含量；注：$$表示p<0.01(vs空白组)；％表示p<0.05，％％表示p<0.01(vs模型对照组)；图3各组小鼠在酒精肝损伤模型实验中的gsh含量；注：^^表示p<0.01(vs空白组)；&表示p<0.05，&&表示p<0.01(vs模型对照组)；图4灵芝醇提取物、11号洗脱液样品与对照品高效液相对比图，注：图中由上、中、下曲线分别为：最上方为灵芝酸c2、灵芝酸g、灵芝酸b、灵芝酸a、灵芝酸d5种对照品成分的混标样品的高效液相色谱曲线；中间为灵芝醇提取物样品的高效液相色谱曲线；最下方为表1中编号为11的洗脱液样品的高效液相色谱曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1一种灵芝中对酒精性肝损伤有保护作用成分的分离方法1)灵芝醇提取物的制备：称取2000g灵芝药材，粉碎，加入8倍重量的95％乙醇，加热回流提取1h，过滤，收集滤液，滤渣加入8倍重量的95％乙醇，加热回流提取1h，过滤，收集滤液。合并两次提取的醇提滤液，65℃减压浓缩，80℃烘干，得到120g灵芝醇提取物。2)灵芝醇提取物的层析：称取经前处理(105℃干燥30min)的柱层析硅胶(300-400目)30.0g，采用湿法装柱，1个柱体积约为8000ml。取上述制备的灵芝醇提取物100g，用甲醇超声溶解，加入30.0g经105℃干燥30min的柱层析硅胶(300-400目)，混匀，在旋转蒸发仪上干燥，装入填好柱的层析柱(为正相硅胶层析柱，采用湿法装柱，1个柱体积为8000ml)中，洗脱过程见表1。表1：灵芝醇提取物层析洗脱流程收集表1中编号为11的洗脱液样品，即得的灵芝中对酒精性肝损伤有保护作用的成分。实施例2动物酒精肝损伤模型实验实验动物：昆明小鼠，雌雄各半，体重18-22g，购于南方医科大学实验动物中心。试剂盒：丙二醛(mda)测定试剂盒(tba法)南京建成生物工程研究所；甘油三酯(tg)测定试剂盒(单试剂gpo-pap法)南京建成生物工程研究所；还原型谷胱甘肽(gsh)测定试剂盒(微板法)南京建成生物工程研究所；实验样品：样品i：灵芝醇提取物，见实施例1步骤1)中制备的产物，即未层析前的提取物；样品ⅱ：表1中编号为第1-10号洗脱液样品的混合物，减压浓缩干燥得固体样品；样品ⅲ：表1中编号为第11号洗脱液样品，即本发明灵芝中具有对酒精性肝损伤有保护作用的成分，减压浓缩干燥得固体样品；样品ⅳ：表1中编号为第12-13号洗脱液样品的混合物，减压浓缩干燥得固体样品。实验方案：选健康昆明小鼠72只，随机分成6组，每组12只，分别为：空白组、模型对照组、实验样品i组、实验样品ⅱ组、实验样品ⅲ组、实验样品ⅳ组，每组给药量为0.9g/kg，给药方式为灌胃给药，正常对照组和模型组给同体积的水，每天上午1次，连续30d，每周称重2次，调整给药剂量。实验结束时，将模型对照组及各给药组一次灌胃给予50％乙醇12ml/kgbw，空白组给蒸馏水，禁食16h处死动物，用试剂盒检测肝组织中tg(甘油三酯)、mda(丙二醛)、gsh(还原型谷胱甘肽)含量。(1)tg检测从图1和表2中可以看出：模型对照组tg含量显著高于空白组(p<0.01)，表明模型成功建立。给药组中，样品i组与样品ⅲ组的tg含量明显低于模型对照组(p<0.05，p<0.01)，表明样品i组与样品ⅲ组均能降低tg含量，而且，样品ⅲ组降低tg的效果要优于样品i组(p<0.05)。样品ⅱ组与样品ⅳ组相比模型对照组无显著差异。表2各组小鼠在酒精肝损伤模型实验中的tg含量组别tg含量mmol/gprot空白组0.61±0.11模型对照组1.62±0.09样品i组1.35±0.11样品ⅱ组1.50±0.18样品ⅲ组1.11±0.27样品ⅳ组1.40±0.27(2)mda检测从表3和图2可以看出：模型对照组mda含量显著高于空白组(p<0.01)，表明模型成功建立。给药组中，样品i组与样品ⅲ组的mda含量明显低于模型对照组(p<0.05，p<0.01)，表明样品i组与样品ⅲ组均能有降低mda含量，其中，样品ⅲ组的显著性比样品i组强。样品ⅱ组与样品ⅳ组相比模型对照组无显著差异。表3各组小鼠在酒精肝损伤模型实验中的mda含量(3)gsh检测从表4和图3可以看出：模型对照组gsh含量显著低于空白组(p<0.01)，表明模型成功建立。给药组中，样品i组与样品ⅲ组的gsh含量明显高于模型对照组(p<0.05，p<0.01)，表明样品i组与样品ⅲ组均能提高gsh，其中，样品ⅲ组的显著性比样品i组强。样品ⅱ组与样品ⅳ组相比模型对照组无显著差异。表4各组小鼠在酒精肝损伤模型实验中的gsh含量组别gsh含量umol/mg空白组30.13±4.47模型对照组21.03±2.68样品i组26.05±3.58样品ⅱ组21.20±5.37样品ⅲ组30.00±4.74样品ⅳ组18.10±3.58综上所述，本发明实施例中的样品ⅲ组(即本发明灵芝中对酒精性肝损伤有保护作用的成分)对酒精肝损伤具有很好的保护作用，可以显著抑制tg、mda含量，显著提高gsh含量，且该效果显著优于样品ⅰ组(即灵芝醇提取物)。依据保健食品检验与评价技术规范(2003版)可判定该受试样品具有对酒精性肝损伤有保护作用。实施例3本发明灵芝中具有护肝功效成分的高效液相色谱检测高效液相色谱检测方法：流动相：如下表5比例，梯度洗脱。表5高效液相方法流动相洗脱比例对照品溶液制备方法：分别称取灵芝酸a、灵芝酸b、灵芝酸c2、灵芝酸d、灵芝酸g对照品5mg，置于同一容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10ml，摇匀，过0.22μm微孔滤膜。供试品制备方法：称取0.05g灵芝醇提取物及相当于0.05g灵芝醇提取物的层析后11号样品的固体，分别用2ml甲醇溶解，摇匀，过0.22um微孔滤膜。检测结果下图4所示，从中可以看出，灵芝醇提取物(即样品i)和11号样品(即样品ⅲ，即本发明灵芝中对酒精性肝损伤有保护作用的成分)中均含有灵芝酸c2、灵芝酸g、灵芝酸b、灵芝酸a、灵芝酸d。但从上述实验结果中可以看出11号样品(即样品ⅲ，即本发明灵芝中对酒精性肝损伤有保护作用的成分)对酒精性肝损伤的保护作用(如抑制tg、mda含量，提高gsh含量)显著优于灵芝醇提取物(即样品i)。实施例4一种灵芝中对酒精性肝损伤有保护作用成分的分离方法1)灵芝醇提取物的制备：称取2000g灵芝药材，粉碎，加入9倍重量的60％v/v乙醇，加热回流提取1.2h，过滤，收集滤液，滤渣加入9倍重量的60％v/v乙醇，加热回流提取1.2h，过滤，收集滤液。合并两次提取的醇提滤液，70℃减压浓缩，82℃烘干，得到灵芝醇提取物。2)灵芝醇提取物的层析：称取经前处理(105℃干燥30min)的柱层析硅胶(300-400目)100.0g，采用湿法装柱，1个柱体积约为8000ml。取上述制备的灵芝醇提取物100g，用甲醇超声溶解，加入100.0g经105℃干燥30min的柱层析硅胶(300-400目)，混匀，在旋转蒸发仪上于60℃干燥，装入填好柱的层析柱(为正相硅胶层析柱，采用湿法装柱，1个柱体积为8000ml)中，洗脱过程见表6。表6：灵芝醇提取物层析洗脱流程收集表6中编号为11的洗脱液样品，即得的灵芝中对酒精性肝损伤有保护作用的成分。实施例5一种灵芝中对酒精性肝损伤有保护作用成分的分离方法1)灵芝醇提取物的制备：称取2000g灵芝药材，粉碎，加入7倍重量的100％v/v乙醇，加热回流提取0.8h，过滤，收集滤液，滤渣加入7倍重量的100％v/v乙醇，加热回流提取0.8h，过滤，收集滤液。合并两次提取的醇提滤液，60℃减压浓缩，78℃烘干，得到灵芝醇提取物。2)灵芝醇提取物的层析：称取经前处理(110℃干燥25min)的柱层析硅胶(100目)200.0g，采用湿法装柱，1个柱体积约为8000ml。取上述制备的灵芝醇提取物100g，用甲醇超声溶解，加入200.0g经110℃干燥25min的柱层析硅胶(100目)，混匀，在旋转蒸发仪上于80℃常压干燥，装入填好柱的层析柱(为反相硅胶层析柱，采用湿法装柱，1个柱体积为8000ml)中，洗脱过程见表7。表7：灵芝醇提取物层析洗脱流程收集表7中编号为11的洗脱液样品，即得的灵芝中对酒精性肝损伤有保护作用的成分。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12