Cabotegravir在制备抗牛传染性鼻气管炎药物中的应用的制作方法

本发明属于医药药物技术领域，具体涉及cabotegravir在制备抗牛传染性鼻气管炎药物中的应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

牛传染性鼻气管炎(infectiousbovinerhinotracheitis，ibr)又称坏死性鼻炎、红鼻病，是由牛传染性鼻气管炎病毒(infectiousbovinerhinotracheitisvirus，ibrv)引起的一种急性、热性、接触性传染病，以高热、呼吸困难、流鼻汁、上呼吸道及气管、黏膜发炎等为特征。20世纪50年代早期，美国科罗拉多州某些牧场首次出现以鼻气管炎为症状的传染性牛病，1955年首次报道了该病的临床症状。我国于20世纪70年代首次在进口种牛中鉴定并分离获得，ibrv可导致持续性感染，世界动物卫生组织(oie)将该病列为b类疾病，也是我国进境动物必检疾病之一。

目前ibrv有效的疫苗是灭活疫苗和弱毒疫苗，但存在免疫抑制与潜伏感染等问题。灭活苗免疫后个体无法与自然感染个体进行鉴别诊断，因此会给根除ibr带来一定的障碍。传统弱毒苗存在毒力返强现象，存在一定的安全隐患，。最重要的是ibrv为胞内增殖病毒，灭活疫苗不能清除体内的病毒，只能预防。基于防控的难点和免疫的限制，研发能抑制和杀灭ibrv的药物成为众多研究者的热点之一。

cabotegravir是一种有效的hiv整合酶抑制剂药物，作为口服导入片和长效注射剂用于治疗和预防艾滋病毒感染。迄今尚未有关于其用于预防和治疗牛传染性鼻气管炎病毒中的报道。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明提供cabotegravir在制备抗牛传染性鼻气管炎药物中的应用，本发明首次证实cabotegravir化合物能够有效抑制牛传染性鼻气管炎病毒的增殖，且对细胞的毒性较小，因此具有开发成抗牛传染性鼻气管炎药物的前景。

本发明的目的之一是提供cabotegravir在制备抗牛传染性鼻气管炎药物中的应用。

治疗本发明的目的之二是提供一种抗牛传染性鼻气管炎药物。

为实现上述发明目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供cabotegravir在制备抗牛传染性鼻气管炎药物中的应用。并因此，cabotegravir对于预防和/或治疗牛传染性鼻气管炎病毒相关的疾病是有效的。

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗牛传染性鼻气管炎病毒相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗。

在本发明的意义上，“抗牛传染性鼻气管炎药物”表示一种物质，其对牛传染性鼻气管炎病毒具有明显的抑制杀灭作用，其主要作用于牛传染性鼻气管炎病毒生活周期的早期阶段，且其对病毒的直接杀灭作用好于吸附阻断作用和复制阻断作用。

根据本发明，不仅公开了cabotegravir在制备抗牛传染性鼻气管炎药物中的应用，而且还公开了，施用cabotegravir与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，cabotegravir还可以与其它非药物活性成分组合使用。

有鉴于此，本发明的第二个方面，提供一种抗牛传染性鼻气管炎的药物组合物，所述药物组合物由cabotegravir与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

其中，cabotegravir取不低于半数有效浓度(ec50)的药物浓度，cabotegravir对牛传染性鼻气管炎病毒的半数有效浓度(ec50)为1.419μm；

其他药物活性成分可用于预防和/或治疗牛传染性鼻气管炎病毒相关疾病，优选为牛传染性鼻气管炎。

其他非药物活性成分药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

所述药物组合物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

所述药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

本发明与现有技术相比，具有如下效果和优点：

本发明首次发现化合物cabotegravir能够有效抑制牛传染性鼻气管炎病毒的增殖，且对细胞的毒性较小，经实验证明，cabotegravir对mdbk细胞的半数毒性浓度(cc50)大于100μm，而对牛传染性鼻气管炎病毒的半数有效浓度(ec50)为1.419μm；cabotegravir对牛传染性鼻气管炎病毒的治疗指数大于70.47，表明其具有开发成抗牛传染性鼻气管炎药物的前景，为cabotegravir开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗ibrv药物奠定实验基础并提供新的视野。

附图说明

图1为本发明cabotegravir抗ibrv损伤细胞的作用图；

其中：其中图1a为mdbk正常细胞组；图1b为mdbk感染病毒对照组；图1c为感染细胞药物试验组(施用40μmcabotegravir)；

图2为实施例2中cabotegravir对mdbk细胞的半数细胞毒性浓度(cc50)图；

图3为实施例3中cabotegravir对ibrv的半数有效浓度(ec50)图；

图4为实施例4中cabotegravir不同时间点给药对ibrv抑制的效果图；

图5为实施例5中cabotegravir对ibrv直接杀伤作用效果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；在本发明没有特别限定，均可通过商业途径购买得到。

正如背景技术所介绍的，现有技术中，迄今尚未有关于其用于预防和治疗牛传染性鼻气管炎病毒中的报道。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，cabotegravir在制备抗牛传染性鼻气管炎药物中的应用。并因此，cabotegravir对于预防和/或治疗牛传染性鼻气管炎病毒相关的疾病是有效的。

cabotegravir由英国葛兰素史克公司(gsk)研制的一款hiv整合酶抑制剂药物，其化学结构式如下(casno.1051375-10-0)，其已被证明作为口服导入片和长效注射剂可用于治疗和预防艾滋病毒感染，但对于该药物的其他用途特别是对牛传染性鼻气管炎病毒作用效果尚未有人研究。

本发明中cabotegravir还包括其药学上可接受的盐，cabotegravir药学上可接受的盐为cabotegravir化合物与无机酸形成的盐，或者与有机酸形成的盐；

优选的，所述无机酸为盐酸、硫酸、硝酸或氢溴酸；所述有机酸为甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸。

其中，抗牛传染性鼻气管炎药物中，cabotegravir取不低于半数有效浓度(ec50)的药物浓度，cabotegravir对牛传染性鼻气管炎病毒的半数有效浓度(ec50)为1.419μm；

根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗牛传染性鼻气管炎病毒相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗。

在本发明的意义上，“抗牛传染性鼻气管炎药物”表示一种物质，其所含有的cabotegravir对牛传染性鼻气管炎病毒具有明显的抑制作用，并主要作用于牛传染性鼻气管炎病毒生活周期的早期阶段，具体的，对病毒的直接杀灭作用好于吸附阻断作用和复制阻断作用。

根据本发明，不仅公开了cabotegravir在制备抗牛传染性鼻气管炎药物中的应用，而且还公开了，施用cabotegravir与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，cabotegravir还可以与其它非药物活性成分组合使用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种抗牛传染性鼻气管炎的药物组合物，所述药物组合物由cabotegravir与至少一种其它药物活性成分和/或至少一种其它非药物活性成分构成。

本发明中cabotegravir还包括其药学上可接受的盐，cabotegravir药学上可接受的盐为cabotegravir化合物与无机酸形成的盐，或者与有机酸形成的盐；

优选的，所述无机酸为盐酸、硫酸、硝酸或氢溴酸；所述有机酸为甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸。

本发明的又一具体实施方式中，cabotegravir取不低于半数有效浓度(ec50)的药物浓度，cabotegravir对牛传染性鼻气管炎病毒的半数有效浓度(ec50)为1.419μm；

本发明中cabotegravir还包括其药学上可接受的盐，所述化合物药学上可接受的盐为所述化合物与无机酸形成的盐，或者与有机酸形成的盐；

本发明的又一具体实施方式中，所述无机酸为盐酸、硫酸、硝酸或氢溴酸；所述有机酸为甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸。

其他药物活性成分可用于预防和/或治疗牛传染性鼻气管炎病毒相关疾病，优选为牛传染性鼻气管炎。

其他非药物活性成分药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。例如药学上相容的无机或有机酸或碱、聚合物、共聚物、嵌段共聚物、单糖、多糖、离子和非离子型表面活性剂或脂质、药理上无害的盐例如氯化钠、调味剂、维生素例如维生素a或维生素e、生育酚或维生素原、抗氧化剂，例如抗坏血酸，以及用于延长药物活性成分或配方的使用和保存时间的稳定剂和/或防腐剂，和其它现有技术中公知的常用非药物活性成分或助剂和添加剂，以及它们的混合物。

所述药物组合物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。

所述药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步阐述。

实施例1病毒tcid50的测定

将mdbk细胞消化后以每孔1×10⁵个/ml的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％co2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将ibrv连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10^-1-10^-10)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μl。放入37℃、5％co2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的cpe情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设8个重复，待不再继续发生细胞病变时判定结果。细胞病变孔是以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按karber法计算病毒tcid50。

表1tcid50ofibrv-f9

结果：在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现圆缩坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，5天后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的cpe孔数，并计算出不同浓度的cpe比率，并按karber法计算ibrv的tcid50值：

lgtcid50＝l-d(s-0.5)(l：最高稀释度的对数；d：稀释度对数之间的差；

s：阳性孔比率总和)

lgtcid50＝l-d(s-0.5)＝-1-1×(5.5-0.5)＝-6

tcid50＝10^-6/0.1ml

即将该病毒稀释10⁶接种100μl可使50％的细胞发生病变。

实施例2cabotegravir对mdbk细胞的毒性实验：

mdbk细胞是ibrv的易感细胞。因此，首先检测cabotegravir对mdbk细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：

(1)在96孔板内接种100μl细胞(mdbk5000个/孔)。

(2)培养约12h后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μl含不同药物浓度的2％fbsdmem，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μl含0.9％dmso的2％fbsdmem培养基。调零孔：不铺细胞。

(3)在37℃，5％co2条件下培养48h后，弃去孔内的培养基。用100μlpbs洗涤两遍，排除药物对mtt反应的影响。每孔再补加100μldmem培养基+10μlmtt。

(4)37℃，5％co2条件下继续培养4h后，每孔加入100μlformazan溶解液。37℃，5％co2继续孵育，直至formazan紫色结晶完全溶解。

(5)在570nm测定吸光值。将0.9％dmso处理的细胞的a570nm设为100％细胞对照。

(6)分析数据，利用graphpadprism5计算cabotegravir的半数细胞毒性浓度(cc50)值。其结果如图2所示。

结果：cabotegravir出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定cabotegravir半数中毒浓度为大于100μm，表明其对细胞毒性作用较小。

实施例3cabotegravir对ibrv的抑制实验：

(1)在96孔板的每个孔中接种1×10⁴个mdbk细胞，37℃，5％co2培养箱中过夜培养；

(2)弃去培养基，每孔加入100μl100tcid50的ibrv病毒稀释液(用2％fbsdmem细胞长满后加入病毒稀释液，按照50μm初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％co2培养箱中培养；

(3)48h后，按cck-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的od值。

(4)分析数据，病毒抑制率(％)＝(药物处理组d450nm值一病毒对照组d450nm值)/(正常细胞对照组d450nm值一病毒对照组d450nm值)×100％，用graphpadprism5软件得化合物的半数有效浓度(ec50)值。其结果如图3所示。然后按公式ti＝cc50/ec50，计算相应的治疗指数ti值。

结果：通过cck-8试剂盒检测细胞活力,可以计算出药物对ibrv的有效抑制率。从结果可以看出，cabotegravir在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对牛传染性鼻气管炎病毒的半数有效浓度(ec50)为1.419μm。cabotegravir对牛传染性鼻气管炎病毒的治疗指数大于70.47。

实施例4作用机制的初步研究

通过不同的给药时间，即对应的时刻是先给药后感染病毒(0h之前)、先感染病毒后给药(0h之后)、病毒和药物同时加入细胞(0h)三个时间点，将待测化合物加入到接种了牛传染性鼻气管炎病毒的mdbk细胞中，进而初步判断cabotegravir的作用时期。具体实验步骤如下：

(1)在96孔板的每个孔中接种1×10⁴个mdbk细胞，37℃，5％co2培养箱中培养。

(2)根据已测得的相关药物的药效学评价结果，确定实验所需药物的浓度，并用维持培养基把药物稀释至所需浓度。

(3)细胞过夜培养后，将96孔板中第二列三个复孔的细胞上清吸走，用磷酸缓冲液清洗细胞2遍。然后加入50μl的待测药物，记为-2h。

(4)2h后，将其他孔的细胞上清全部吸走，将稀释好的牛传染性鼻气管炎病毒稀释液加到第2～11列的每孔中，每孔加样体积为50μl。同时在第3列的三个复孔中加入50μl相应待测物，此刻记为0h。

(5)以后每隔一定时间在下一列的三个复孔中加入相应待测化合物，标记好相应时间。以第11列的mdbk细胞作为病毒对照组。

(6)培养48h后，进行od值测定。分析数据，得出结论，其结果如图4所示。

结果：从不同时间点给药实验结果分析可知，cabotegravir在病毒感染细胞0h、2h时加药，对病毒有明显的抑制作用，说明cabotegravir可能主要作用于ibrv生活周期的早期阶段。

实施例5化合物不同时间加入对ibrv复制的影响

将筛选出的效果较好毒性较低的cabotegravir进行了进一步的作用机制研究。分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。

(1)药物对病毒的直接杀伤作用

将等量的100tcid50病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％co2培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μl/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h进行细胞活力检测，用graphpadprism5软件得化合物的ec50。

结果：cabotegravir与ibrv预先作用的给药方式下，各浓度的试验加药组细胞病变较病毒对照组轻微，细胞的变圆、脱落、空泡化等病理现象有所减轻，通过分析软件，cabotegravir对ibrv的作用效果如图5所示。从图中可以看出，在这种作用式下，cabotegravir对ibrv表现出抑制作用，并且药物在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。表明cabotegravir对ibrv具有直接灭活的作用。

(2)药物对ibrv吸附的阻断作用

按每孔个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μl/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用pbs洗两遍，加入等量的100tcid50病毒液置于37℃、5％co2培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h后进行细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。

结果：cpe观察结果显示，药物预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度均没有明显的变化。细胞活力检测结果显示，此种药物对ibrv的有效抑制率在20％以下，表明cabotegravir不能阻止ibrv对细胞的吸附作用。

(3)药物对ibrv复制的阻断作用

按每孔个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的100tcid50病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％co2培养箱中预先作用2h后，然后弃去上清液，pbs将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μl/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％co2培养箱中培养，48h后进行细胞活力检测，分析数据，得出结论。

结果：cpe观察结果显示，病毒预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度均没有明显的变化。检测结果显示，cabotegravir对ibrv的有效抑制率低于20％，表明cabotegravir不能阻断在细胞中的复制作用。

本发明应用实施例以牛肾细胞(mdbk)为载体，在细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现cabotegravir的新型抗病毒作用，对ibrv有一定的抑制作用，且对病毒的直接杀灭作用均好于吸附阻断作用和复制阻断作用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。