AMPK激动剂MK-8722在制备治疗过敏性疾病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药领域，具体涉及ampk激动剂mk-8722在制备治疗过敏性疾病的药物中的应用。

背景技术：

随着人类生活质量的不断提高，过敏性疾病的发病率迅速增高，成为了一个世界性的难题。临床上常见的一些过敏性疾病如过敏性皮炎、哮喘、鼻炎等有关，是人类的重大疾病之一，其发病率约占世界人口的30％～40％，而且正以每年大于1％的速度増加，以儿童的患病率上升最为明显。随着我国生活方式的西方化，过敏性疾病的发病率也逐年上升。因此，对于其发病机制、影响因素与防治的研宄也再度成为热点。目前抗过敏活性的研究方法主要为体外抑制实验、被动皮肤过敏反应、动物模型等。

过敏反应的发生一般分为三个阶段，分别为致敏阶段、激发阶段、效应阶段。致敏阶段指过敏原进入机体后可选择诱导过敏原特异性b细胞产生抗体应答，此类抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的表面结合，而使机体处于对该过敏原的致敏状态；激发阶段是指相同的过敏原再次进入机体时，通过与致敏的肥大细胞和嗜碱性粒细胞表明的抗体特异性结合，使这种细胞释放生物活性介质的阶段：效应阶段指生物活性介质作用于效应组织和器官，引起局部或全身过敏反应的阶段。

噁唑酮和fitc是一种常见的过敏原，基于其易于获得，免疫原性强和相关试剂选择性大等优点，噁唑酮和fitc成为建立过敏动物模型中常用的过敏原。balb/c小鼠较易出现强烈的th2型细胞因子免疫反应，遗传背景清楚，故采用balb/c小鼠作为过敏动物模型。过敏反应发生时，th2免疫应答增强，th2细胞通过释放il-4,il-5和il-13细胞因子，从而诱导b淋巴细胞产生ige抗体。因此血清中ige含量,耳组织中il-4,il-5和il-13的含量是过敏动物模型中的重要考察指标。

科学家不断探寻高效低毒的抗过敏药物，副作用较小的天然产物，以及靶向性较好的小分子化合物，在抗过敏药物逐渐占据重要地位。ampk激动剂mk-8722是一种有效的全身性泛ampk激活剂。有报道表明，在体外mk-8722是所有12种哺乳动物ampk复合物的有效的、直接的变构激活剂。在db/db小鼠(瘦素受体缺陷型t2dm模型)中评估mk-8722的慢性抗高血糖功效。但是长期服用mk-8722会引起心肌肥大。由于目前ampk激动剂mk-8722的生物活性研究主要集中在机体代谢方面，尚未出现其在过敏性疾病中的应用。本发明首次验证了ampk激动剂mk-8722的抗过敏作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种ampk激动剂mk-8722在治疗过敏性疾病的药物中的应用。

ampk激动剂mk-8722的结构如下：

mk-8722

本发明所述的过敏性疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮肤病等。所述过敏性皮肤病包括皮炎、湿疹、荨麻疹、面部糠疹、风疹、过敏性结膜炎。进一步的，所述皮炎包括脂溢性皮炎、瘙痒性皮肤病、接触性皮炎、水田皮炎、植物日光性皮炎、药物皮炎、神经性皮炎。

本发明所述药物为外用制剂或口服制剂。所述外用制剂选自软膏剂、贴膏剂、散剂、酊剂、搽剂、涂膜剂、喷雾剂。所述外用制剂中ampk激动剂mk-8722的质量百分含量为1％～10％。优选2.5％。所述口服制剂中ampk激动剂mk-8722的质量百分含量为0.1％～1％。优选0.6％。

本发明在体内外模拟了ampk激动剂mk-8722对th2型的过敏性皮炎的影响。结果表明，ampk激动剂mk-8722可以显著抑制th2型炎症反应的启动因子tslp的产生。同时，本发明从小鼠耳组织切片、免疫器官质量、血清中ige含量以及耳组织匀浆中il-4含量等几个方面对ampk激动剂mk-8722的抗过敏活性进行验证，并取得了显著效果。实验结果证明，ampk激动剂mk-8722可以显著的改善过敏性皮炎的病征。提示ampk激动剂mk-8722能够有效治疗过敏性疾病，如过敏性皮炎、过敏性鼻炎、哮喘、湿疹、食物过敏、药物过敏和严重过敏反应等。

附图说明

图1为ampk激动剂mk-8722对hacat细胞活力的影响。

图2为ampk激动剂mk-8722对hacat细胞释放tlsp的影响。

图3为ampk激动剂mk-8722对过敏性皮炎小鼠体重的影响示意图一。

图4为ampk激动剂mk-8722对过敏性皮炎小鼠体重的影响示意图二。

图5为ampk激动剂mk-8722涂抹给药对过敏性皮炎小鼠耳厚度和耳重量的影响示意图一。

图6为ampk激动剂mk-8722涂抹给药对过敏性皮炎小鼠耳厚度和耳重量的影响示意图二。

图7为ampk激动剂mk-8722涂抹给药对过敏性皮炎小鼠耳厚度和耳重量的影响示意图三。

图8为ampk激动剂mk-8722涂抹给药对过敏性皮炎小鼠耳厚度和耳重量的影响示意图四。

图9为ampk激动剂mk-8722灌胃给药对过敏性皮炎小鼠耳厚度和耳重量的影响示意图一。

图10为ampk激动剂mk-8722灌胃给药对过敏性皮炎小鼠耳厚度和耳重量的影响示意图二。

图11为ampk激动剂mk-8722灌胃给药对过敏性皮炎小鼠耳厚度和耳重量的影响示意图三。

图12为ampk激动剂mk-8722灌胃给药对过敏性皮炎小鼠耳厚度和耳重量的影响示意图四。

图13为过敏性皮炎小鼠耳组织he染色切片以及甲苯胺蓝染色切片镜下观察代表图一。

图14为过敏性皮炎小鼠耳组织he染色切片以及甲苯胺蓝染色切片镜下观察代表图一。

图15为ampk激动剂mk-8722对过敏性皮炎小鼠耳组织肥大细胞浸润情况的影响示意图一。

图16为ampk激动剂mk-8722对过敏性皮炎小鼠耳组织肥大细胞浸润情况的影响示意图二。

图17为ampk激动剂mk-8722对过敏性皮炎小鼠耳组织炎性评分影响示意图一。

图18为ampk激动剂mk-8722对过敏性皮炎小鼠耳组织炎性评分影响示意图二。

图19为ampk激动剂mk-8722对过敏性皮炎小鼠脾脏和胸腺质量和大小的影响示意图一。

图20为ampk激动剂mk-8722对过敏性皮炎小鼠脾脏和胸腺质量和大小的影响示意图二。

图21为ampk激动剂mk-8722对过敏性皮炎小鼠血清中th2相关细胞因子ige、il-4等含量的影响示意图一。

图22为ampk激动剂mk-8722对过敏性皮炎小鼠血清中th2相关细胞因子ige、il-4等含量的影响示意图二。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1ampk激动剂mk-8722膏剂的制备

本实施例提供一种ampk激动剂的外用乳膏，由下述原料组分制成：

ampk激动剂mk-78722的制备方法参考文献(myersrw,etal.systemicpan-ampkactivatormk-8722improvesglucosehomeostasisbutinducescardiachypertrophy.science.2017aug4；357(6350):507-511.)。外用乳膏其中mk-8722250重量份，硬脂酸1000重量份，硬脂酸甘油酯200重量份,蜂蜡200重量份，棕榈油600重量份，丁二醇600重量份,乙醇200重量份,水8400重量份，卡波姆3重量份，三乙醇胺2重量份。

按上述原料组分，制备本发明的中药外用乳膏：

(1)按比例称取硬脂酸，硬脂酸甘油酯，蜂蜡，棕榈油，水浴加热至熔化后过滤，70-80℃恒温保存；

(2)按比例称取丁二醇，乙醇，水，卡波姆，三乙醇胺油相加入到上述溶液中并水浴加热搅拌，保温乳化10-20min；

(3)加入称取好的mk-8722原料，边加边搅拌至溶液冷凝成乳膏状。

实施例2ampk激动剂mk-8722的体外实验

(一)细胞毒性试验

hacat细胞株，使用hyclonedmem培养基培养(含10％胎牛血清)。设空白组，对照组和药物组。药物组加入ampk激动剂mk-8722的浓度依次为120、60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375μm。药物和细胞作用48h后，加入mtt作用4h。去除上清，用dmso溶解，酶标仪测定吸光度。细胞活力(％)＝(药物组od值-空白组od值)/(对照组od值-空白组od值)×100％。(空白组：不铺细胞；对照组：细胞不加药；药物组：细胞加药)。

mtt实验结果见图1。结果表明，一定浓度的ampk激动剂mk-8722对hacat细胞的细胞活力没有明显影响。根据实际需求，选择0.9735-15μm的浓度范围进行tlsp含量水平检测。

(二)tslp含量的检测

hacat细胞在24孔板中培养24h,根据mtt实验结果，在poly(i:c)100ug/ml刺激hacat细胞24h后，再加入1μm、10μmmk-8722作用细胞24h,取作用后的细胞上清液每孔100μl，按elisa试剂盒说明进行操作，检测tlsp含量的变化，用酶标仪测定吸光度值。(对照组：细胞不致敏不加药；模型组：细胞致敏不加药；药物组：细胞致敏加药)。

tslp含量检测实验结果见图2。如图所示，ampk激动剂mk-8722显著抑制了tlsp的释放。并且随着药物浓度的升高，ampk激动剂mk-8722对tslp的抑制也变得极其显著。结果表明，ampk激动剂mk-8722可以抑制过敏早期标志物的tslp的产生。

实施例3ampk激动剂mk-8722的体内实验

动物实验设计：

分组：

6～8周的雌性balb/c小鼠，体重18-22g，购自维通利华有限责任公司。小鼠饲养采取常规分笼方式，饮水和采食自由，温度25±2℃，相对湿度40-80％。实验在中国药科大学动物中心的指导下完成。小鼠饲养一周适应环境后进行实验。共80只小鼠，分为系统灌胃和局部涂抹两种给药方式，系统给药和局部涂抹均分为4组：空白对照组，模型组，地塞米松组，mk-8722组、苯乙双胍组、aicar组。

造模：

各小鼠于第0天在背部用剃毛器剃去毛3.5cmx3.5cm，模型组、地塞米松组及mk-8722组第1天和第2天在背部无毛部位涂0.5％fitc溶液(溶剂为丙酮：邻苯二甲酸二丁醋＝1:1)或0.5％噁唑酮溶液(溶剂为丙酮：橄榄油＝4:1)40μl，第6天用0.5％fitc溶液或0.5％噁唑酮溶液40μl分别涂于小鼠背部和右耳激发，左耳涂相同体积的溶剂(丙酮：橄榄油＝4:1或丙酮：邻苯二甲酸二丁酯＝1:1)。空白对照组第1天和第2天在背部无毛部位涂40μl溶剂(丙酮：橄榄油＝4:1或丙酮：邻苯二甲酸二丁酯＝1:1)，第6天用40μl溶剂(丙酮：橄榄油＝4:1或丙酮：邻苯二甲酸二丁酯＝1:1)分别涂于小鼠背部及右耳激发。

给药：

(1)局部涂抹给药：为预防性给药，边造模边给药。空白对照组组、模型组、地塞米松组和mk-8722组、苯乙双胍组、aicar组均采用局部涂抹的给药方式，实验中所用到的mk-8722为实施例1制备所得，ampk激动剂苯乙双胍和aicar购于mce公司。在造模的第1、2、3、4、5、6天，mk-8722组、苯乙双胍组、aicar组局部涂抹相应浓度的ampk激动剂mk-8722、苯乙双胍、aicar膏剂，包括耳部和无毛的背部皮肤，每天涂抹两次，模型组和空白组涂抹空白膏剂，地塞米松组涂抹市售的醋酸地塞米松软膏。

(2)系统灌胃给药：空白组、模型组、地塞米松组、mk-8722组、苯乙双胍组、aicar组均采用灌胃给药的方式，在造模的第1、2、3、4、5、6天，mk-8722组、苯乙双胍组、aicar组按体重分别灌胃给药60mg/kg的ampk激动剂mk-8722、苯乙双胍、aicar，模型组和空白组灌胃给药溶剂1％的cmcna，地塞米松组灌胃给药2.5％的地塞米松溶液。

体重检测：

给药过程中检测小鼠体重变化，局部涂抹给药小鼠体重变化结果见图3、图4。相比于空白对照组和模型组，阳性药地塞米松组小鼠的体重显著下降，而mk-8722组苯乙双胍组、aicar组小鼠的体重没有明显变化，且变化趋势与空白对照组一致。

耳组织肿胀度：

处死小鼠后，取小鼠耳组织，螺旋测微器测耳厚度，打孔器取耳组织圆片称重，耳厚度和耳质量，计算耳肿胀度(右耳厚度一左耳厚度、右耳重量一左耳重量)。

耳肿胀度结果见图5-图12，图5-图8为局部涂抹给药实验结果，图9-图12为系统灌胃给药实验结果。相比于空白对照组，模型组的耳组织耳厚度以及耳重量显著增加，而相比于模型组，地塞米松组、mk-8722组小鼠的耳组织的耳厚度、耳重量显著减小，而苯乙双胍组、aicar组的小鼠没有显著变化，结果表明，ampk激动剂mk-8722对过敏性皮炎病症的治疗作用，而苯乙双胍和aicar没有显著的效果，因此在后续的实验结果中不再做陈述。同时由图5-图8、图9-图12可发现局部涂抹给药和系统灌胃给方式，ampk激动剂mk-8722均有效，并且局部涂抹给药的药效更优于系统灌胃给药，因此后续实验结果只考察局部涂抹给药方式的结果。

耳组织免疫组化：

处死小鼠后，取小鼠耳组织用4％中性甲醛固定，4℃保存。将固定好的耳组织清洗干净，脱水处理，制作石蜡切片，h&e染色以及甲苯胺蓝染色切片，使用显微镜观察切片拍照。

耳组织切片结果见图13、图14和图15-图20。相比于对照组，模型组的组织中表皮和真皮厚度显著增加，且有明显的炎症细胞及肥大细胞浸润，说明动物模型建立成功；而相比于模型组，mk-8722组表皮和真皮厚度明显变薄，炎性浸润明显改善，且肥大细胞浸润也显著减少。该结果比较直观的说明了ampk激动剂mk-8722对过敏性皮炎的治疗作用。

ampk激动剂mk-8722对小鼠脾脏和胸腺质量的影响：

胸腺和脾脏是重要的免疫器官，影响细胞免疫和体液免疫。当过敏反应发生时，免疫细胞的增殖能力受到影响，从而影响免疫器官质量。

胸腺和脾脏的质量见图19、图20。结果显示，相比于对照组，模型组的脾脏质量明显升高，而胸腺质量明显降低。mk-8722组抑制了脾脏质量上升和胸腺质量降低。说明ampk激动剂mk-8722对免疫系统有调节作用。

ampk激动剂mk-8722对小鼠血清中ige及耳组织匀浆中il-4的影响:

于第6天最后一次激发24h后，进行小鼠摘眼球取血，获得血液。室温放置30min后，4℃放置过夜，离心制备血清。使用elisa试剂盒检测血清中ige及耳组织中il-4含量。血清中ige和耳组织匀浆中il-4结果见图21、图22。结果显示，相比于模型组，mk-8722组血清中ige以及耳组织中的il-4的含量显著降低。由此证明，ampk激动剂mk-8722可以抑制th2免疫应答，从而治疗过敏性疾病。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。