本发明涉及党参多糖对肠道菌群的调节领域，特别涉及党参多糖作为调节人体肠道菌群药物的应用。
背景技术：
：：肠道菌群作为构成人体胃肠道必不可少的一部分，是由100万亿古细菌和细菌组成的复杂社区，代表了1000多种物种，其中超过90％的物种分属于拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门。大量的人体及啮齿类动物试验证明：肠道菌群是维持宿主健康不可或缺的“器官”。炎症性肠病(inflammatoryboweldisease,ibd)是一类由饮食、感染、代谢、易感基因、免疫、肠道菌群等多种因素共同介导的自身免疫性疾病，其主要发病特征是胃肠黏膜中持续、反复且不可控的炎症反应。按照其病发部位和特征的差异：可以细分为溃疡性结肠炎(uc)和克罗恩病(cd)。表1ibd的治疗进展table1treatmentprogressofibd补充替代疗法(complementaryandalternativemedicine,cam)是指主流医学以外，一系列能帮助并弥补主流医学不足的诊断和防治措施的总称，主要分为替换医学诊疗、意念疗法、生物学补给疗法和能量疗法等几大类。不同于传统的西方医学，cam因其作用温和、效果好、且副作用远低于传统药物等优点，逐渐受到患者的欢迎和接受。cam法常用的有益生菌，益生元及中草药(hm)等。党参性味甘平、是健脾养血、益肺生津的经典中药材，主要用于防治脾肺气虚、食少倦怠、气血不足、内热消渴等。以党参为主要成分的四君子汤已广泛用于临床医治脾虚引起的疾病。党参多糖具增强抗应激能力、调节机体免疫及抗氧化等活性。研究表明：党参水煎液通过灌胃及肌肉、静脉或腹腔注射，均可不同程度增加小鼠巨噬细胞数量、增强吞噬能力。同时，可显著增强细胞内核苷酸、糖类及部分酶类的活性。党参皂苷在肠道菌群的代谢作用下可发挥抗肿瘤、抗菌及抑制相关炎症因子的表达等药理作用。supriyar.等研究党参皂苷在2,4,6-三硝基苯磺酸(tnbs)诱导的小鼠结肠炎中的作用时发现：轮叶党参皂苷a主要是经肠道菌群将其代谢为次级皂苷类活性小分子物质，进而由肠上皮细胞吸收，进入血液发挥全身性功效；其不仅可抑制与th17/treg平衡相关炎症因子il-1β、tnf-α和il-6的表达，还可缓解结肠炎小鼠粘膜组织的损伤。目前为止，党参在肠道疾病的防治中并未得到充分利用。加之，在长期的临床应用中，党参主要是以水煎剂的形式制备并口服给药；因中药(西药化学成分是单纯、明确的)材组分的复杂性(通常含有多种已知或未知成分)，及各组分之间的互作关系尚不清楚；其对寻找疾病治疗过程中起有效作用的组分，追踪有效组分之间的相互机制带来了困难。所以深入研究党参有效成分之间的互作关系、及其在胃肠道消化系统疾病中发挥药效时的互作机制具有重要意义。技术实现要素：为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供党参多糖作为调节人体肠道菌群药物的应用，在ibd的治疗过程中，党参多糖可作为益生元直接或间接诱导ibd肠道菌群的有利变化，而变化了的肠道菌群将促进党参皂苷转化为活性药理分子苷元，进而发挥疾病治疗作用(图1)。本项目建立dss诱导的急性结肠炎小鼠模型，通过高通量测序技术，探究党参多糖对结肠炎小鼠肠道菌群结构的调节及菌群影响党参皂苷代谢的机制。应用gc测定粪便中scfas的含量；elisa检测ibd中与th17/treg平衡相关细胞因子的分泌；采用超高效液相-质谱联用技术结合代谢组学方法分析血液和盲肠中党参皂苷的代谢变化；阐明党参多糖通过改变肠道菌群作用于党参皂苷代谢，进而影响其发挥疾病治疗作用的机制，为临床预防、治疗ibd奠定基础、提供新思路。为达到上述目的，本发明的技术方案为：党参多糖用于调节人体肠道菌群的应用，党参多糖作为预防结肠炎的药物，食物或保健品的应用。党参多糖用于调节人体肠道菌群的应用，党参多糖作为治疗结肠炎的药物，食物或保健品的应用。党参多糖用于调节人体肠道菌群的应用，党参多糖通过作用于皂苷代谢调节人体肠道菌群。进一步的，党参多糖通过下调与th17/treg平衡相关促炎细胞因子：白细胞介素[il]-17a，il-17f，il-6，il-22和肿瘤坏死因子[tnf]-α的分泌，上调抗炎因子il-10和转化生长因子[tgf]-β的表达，调节人体肠道菌群。进一步的，党参多糖通过选择性刺激三种重要益生菌属bifidobacteriumspp.,akkermansiaspp和lactobacillusspp的生长，下调有害菌属desulfovibiospp.,alistipesspp和helicobacterspp的丰度，调节肠道菌群的紊乱。进一步的，党参多糖增加了结肠炎小鼠肠道内scfas的含量，而且通过选择性富集具有促scfas产生的blautia，prevotellaceaeucg-001，oscillibacter和quinella菌属的生长，改善了scfas的系统和局部能量供应情况。进一步的，所述党参多糖为药品，食品或保健品。进一步的，所述党参多糖为内服或外用剂型。进一步的，所述党参多糖为片剂，丸剂，分散剂，颗粒剂，中药饮片，喷雾剂，或是膏药贴剂。相对于现有技术，本发明的有益效果为：结果表明：低聚果糖、党参多糖和党参皂苷干预防治均可不同程度改善dss诱导的结肠炎小鼠的宏观病理状况；下调与th17/treg平衡相关促炎细胞因子：白细胞介素[il]-17a，il-17f，il-6，il-22和肿瘤坏死因子[tnf]-α的分泌，上调抗炎因子il-10和转化生长因子[tgf]-β的表达。16srrna高通量测序结果显示：三种药物防治可不同程度改善结肠炎小鼠肠道菌群的结构和多样性。其中，低聚果糖效果最优，但与党参多糖之间并无显著差异。同时，党参多糖通过选择性刺激三种重要益生菌属bifidobacteriumspp.,akkermansiaspp和lactobacillusspp的生长，下调有害菌属desulfovibiospp.,alistipesspp和helicobacterspp的丰度，改善了结肠炎小鼠肠道菌群的紊乱。gc结果显示：低聚果糖、党参多糖和党参皂苷不仅增加了结肠炎小鼠肠道内scfas的含量，而且通过选择性富集具有促scfas产生的blautia，prevotellaceaeucg-001，oscillibacter和quinella菌属的生长，改善了scfas的系统和局部能量供应情况。此外，研究发现：三种药物防治后，通过缓解结肠炎小鼠肠道菌群的失调，提高了党参皂苷中暴露量最高的单体化合物cs-415.2在结肠炎小鼠体内的吸收率，其中，低聚果糖作用最优，党参多糖次之。综上所述：党参多糖具有良好的益生元特性，在急性结肠炎的防治过程中显示出良好的应用前景。本发明一方面证实了党参多糖的潜在益生元效应，另一方面也揭示了党参中共存的多糖通过恢复结肠炎小鼠肠道菌群的紊乱进而影响皂苷代谢的机制。为以党参多糖作为益生元开发新型微生态制剂奠定基础，同时也为发现中药药效物质提供理论依据。附图说明图1为本发明实验设计流程图。图2为dss诱导的结肠炎模型建立流程图图3急性结肠炎小鼠模型的宏观状况。(a)实验小鼠的体重改变情况；(b)结肠长度变化；(c)模型组和正常组小鼠结肠状况；(d)疾病活动指数。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001图4急性结肠炎小鼠结肠组织结构变化。(a)正常组小鼠结肠组织he染色图；(b)模型组小鼠结肠组织he染色图；(c)组织学损伤评估结果。**p<0.01图5为不同药物干预小鼠急性结肠炎实验周期示意图。图6不同药物对急性小鼠结肠炎生理状况的改变。(a)模型期各实验组小鼠体重的改变量；(b)疾病病理指数；(c)结肠长度；(d)髓过氧化物酶活；(e)病理指数；(f)结肠病理切片(100倍镜下)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图7药物干预下，结肠炎小鼠肠道中与th17/treg平衡相关细胞因子的表达。(a)il-22；(b)il-6；(c)il-17a；(d)il-17f；(e)tnf-α；(f)tgf-β；(g)il-10。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图8药物对急性结肠炎小鼠肠道菌群丰富度和多样性的调节。(a-c)各实验组在第1天、第21天和第30天的样品稀释性曲线图；(d-f)各实验组在第1天、第21天和第30天的shannon指数图。图9为三种药物干预下结肠炎小鼠肠道菌群的物种组成。(a-b)实验预防期和结肠炎模型期的venn图；(c)样本间群落组成的层次聚类分析柱状图。图10三种药物干预对急性结肠炎小鼠肠道菌群结构的调节。(a-b)预防期和结肠炎模型期的主成分分析图。图11药物干预下急性结肠炎小鼠肠道菌群的组成分析。(a)门水平柱状图(b)厚壁菌门与拟杆菌门的比值；(c)模型期属水平heatmap图；(d)属水平柱状图。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图12急性结肠炎小鼠对三种药物干预起响应的特定菌属分析。(a)预防期和模型期样本聚类进化树；(b)预防期和模型期基于群体间微生物显著差异的lda直方分布。图13不同药物干预下，结肠炎小鼠模型粪便scfas含量的变化。(a)乙酸；(b)丙酸；(c)异丁酸；(d)正丁酸；(e)异戊酸；(f)正戊酸。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。图14三种药物干预下急性结肠炎小鼠肠道中与产scfas相关菌属丰度的变化。(a)促进scfas产生相关菌属的丰度；(b)抑制scfas产生相关菌属丰度。图15党参皂苷的全质谱扫描图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：实验例1：如图1所示，建立适合的动物模型是探究疾病发病机制及评估临床新药治疗效果的关键所在。对ibd而言，建立小鼠结肠炎模型是探究其病理机制最常用的方法。常见的结肠炎模型有：自发性、基因修饰性以及诱导性结肠炎模型等。其中，采取化学物质葡聚糖硫酸钠(dss)刺激产生的急性小鼠结肠炎模型是目前应用最广的。所以，本章探究了dss造模的实验周期，为后期实验做准备。材料实验动物：购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司的清洁级c57bl/6雌性小鼠(18±2g；4周龄)；仪器：nc-ms电子天平，hms-350涡旋振荡器，dh-500恒温培养箱，hs-202石蜡切片机；试剂：dss(分子量：36-50kda)，购自美国sigma-aldrich公司；造模前，根据文献报道的方法，采用灭菌蒸馏水将其配制成3％的dss溶液。二甲苯、无水乙醇、甲醛、苏木精、酚红染液购自深圳达科生物有限公司。实验方法dss诱导的急性结肠炎模型的构建方法清洁级雌性c57bl/6小鼠16只，评估每只动物的健康状况；在20±4℃下，提供12h的光照/黑暗循环交替、相对湿度为35-55％的环境，自由适应性饲养7天，然后随机分为对照组和模型组，每组各8只；所有的实验小鼠按5g/只/天的量给予常规饲料，模型组的小鼠按6ml/只/天的量让小鼠自由饮用3％dss溶液连续7天后移除(每隔2天更换新的dss溶液)，更换为蒸馏水继续饮用2天后于第10天处死。对照组的小鼠每天自由饮用蒸馏水9天后和模型组小鼠一起颈椎脱臼处死；取远端结肠制备组织病理切片。此外，整个实验过程中，观察两组实验小鼠生理特性和形态变化。每天记录试验小鼠的体重、日食量及模型组小鼠的便血情况。具体流程见图2。结肠炎模型的评价与观察疾病活动指数(dai)的评估：记录小鼠每日的体重、观察其大便特征，结合疾病活动度指数评分标准获得每只小鼠的dai，评价其疾病情况。组织学损伤的评估：根据解剖后实验小鼠的结肠大体形态以及其溃疡程度进行评估。制作结肠组织病理切片，在电子显微镜下，采用双盲法依据组织结构损伤指数评分标准对结肠样本切片进行评估。数据统计与分析统计分析使用spss22软件进行，图中的数据分析均以均值±标准误差的形式显示。采用单因素方差分析(anova)比较各组之间的差异，利用双尾测试进行评估。实验结果急性结肠炎模型的整体评价采用c57bl/6雌性小鼠建立dss诱导的急性结肠炎模型的过程中发现：模型组小鼠在连续饮用3％的dss水溶液4天时(第11天)，其体重并未发生明显的变化，并且部分小鼠的体重还有上升的趋势，但小鼠已经开始犯懒，不喜动；皮毛粗糙，不思饮食等症状。与对照组相比，实验组小鼠从第5天(第12天)开始体重下降，第6天(第13天)开始可以看见严重血便，且小鼠体重急剧降低，饮用dss水溶液和进食量大幅度减少。在第8天(第15天)将dss水溶液移除后，实验组小鼠的体重下降至最低。且与对照组相比，差异极显著(图3a)。整个实验过程中未出现小鼠死亡的情况。实验结束，颈椎脱臼处死小鼠并解剖，获取结肠组织并采用直尺量取结肠长度时发现：模型组小鼠的结肠病变主要集中在远端结肠，同时整个肠腔充血膨胀，无成型颗粒状粪便存在，肠壁薄脆且无收缩性(图3c)。此外，与正常组对比，模型小鼠结肠长度明显缩短(p<0.05)(图3b)。根据小鼠体重变化、大便性状和隐血情况采用dai评分标准评估发现：模型组实验小鼠的dai疾病指数与正常组之间的差异性极其显著(p<0.001)。结肠病理组织切片结构的变化选取远端结肠0.6cm制作实验小鼠结肠病理组织切片后，我们观察到dss诱导的急性结肠炎病理学特征主要表现是结肠上皮细胞大量缺失，结肠隐窝和杯状细胞破损严重，且已无法识别。同时，整个结肠黏膜中出现大量的炎性细胞因子，部分甚至浸润到黏膜下层(图4b)。采用组织学损伤评分标准对结肠组织的破损程度进行评估，进一步证实了上述结果(图4c)。实验小结与讨论本实验室已采用c57bl/6雌性小鼠成功建立dss诱导的急性结肠炎模型；故本发明选用c57bl/6雌性小鼠。探索适合的dss造模浓度和周期是成功构建急性肠炎模型和药物疗效研究的关键。研究发现：当dss总摄入量高于它的最低阈值30mg/g剂量时，就会产生炎症症状，也就是说小范围的浓度差异并不会影响造模的最终结果。本发明采用3％的dss剂量造模，c57bl/6雌性小鼠于第5天体重开始下降，第6天开始出现稀血便，体重急剧下降，进食量和dss水溶液摄入量大幅减少；甚至停止食用。所以增加dss溶液的给药时间和浓度并无太大意义。加之，随着dss摄入时间的延长，结肠炎疾病病程会加重，进而可能引发小鼠死亡；所以于造模第7天移除dss溶液。随后，给予蒸馏水继续饲喂2天，观察造模小鼠疾病病理状态的变化。我们发现造模小鼠的体重及便血状况并未因dss溶液的移除而发生明显改变，且小鼠死亡率为零。第10天颈椎脱臼处死小鼠，观察其结肠长度，肠腔充血状态、体重变化、结合结肠病理组织切片、dai评分标准和组织学损伤评分标准共同评估，最终确认造模小鼠结肠组织结构发生明显病变；符合急性结肠炎模型的标准。同时，进一步说明c57bl/6雌性小鼠，在3％的dss诱导一周后可建立稳定的急性结肠炎模型；为开展药物干预实验提供了良好的研究模型。实验例2药物对结肠炎小鼠肠道菌群及th17/treg的作用研究近年来，随着“中药多组分同时作用于多个靶点”观点的提出，恢复紊乱的肠道菌群、重塑th17/treg平衡作为治疗ibd的新型研究靶点，已经成为了研究热点。中药多糖因其药理作用广泛，免疫调节优势显著，且肠道菌群可通过多种机制将其降解进而被机体利用，是中药材中发挥药效的关键组分。党参作为补中益气的经典中药，其代表性活性药理分子党参多糖对ibd肠道菌群、及与th17/treg平衡相关细胞因子表达的影响尚未明确。基于此，本发明利用党参多糖防治dss诱导的小鼠结肠炎，采用16srrna高通量测序技术深入探索党参多糖对结肠炎小鼠肠道菌群的调节，检测结肠中与th17/treg平衡相关细胞因子的表达；评估党参多糖的潜在益生元效应及开发益生产品的前景。实验材料实验动物：spf级c57bl/6雌性小鼠(18±2g；4周龄)，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；药材：党参多糖(56％)和党参皂苷(95％)购自兰州沃特斯生物有限公司；仪器：nc-ms电子天平，hms-350涡旋振荡器，高速冷冻离心机(美国thermoscientific公司)，uv-6100bs紫外可见分光光度计，pcr仪：abi9700型；试剂：dss(分子量：36-50kda)；酚红、苏木素；低聚果糖购自德国曼海姆公司；mpo酶测定试剂盒；小鼠酶联免疫吸附测定试剂盒。实验方法党参多糖的含量测定采用蒽酮-硫酸法对所购买的党参多糖进行含量鉴定。具体如下：不同药物组干预结肠炎小鼠的实施方案清洁级雌性c57bl/6小鼠60只(体重约为18±2g)，在20±4℃下，提供12h的光照/黑暗循环交替和35-55％的相对湿度，适应性饲养7天以后，正式开始实验。依据处理方法和给药类别的差异，具体分为以下5组：a：低聚果糖组(fro)，n＝12，每天上午于同一时间段，灌胃300mg/kg剂量的低聚果糖水溶液；b：党参多糖组(cp)，n＝12，每天上午于同一时间段，灌胃300mg/kg剂量的党参多糖水溶液(根据2010版药典规定的党参药材的常用剂量范围：9-30g，结合具体实验及相关文献，取药典规定的最大给药剂量30g，参照人体和动物的体表面积换算方法，最终确定党参多糖的给药剂量300mg/kg)；c：党参皂苷组(cs)，n＝12，每天上午于同一时间段，灌胃300mg/kg剂量的党参皂苷水溶液(剂量确定方法同上)；d：对照组(con)，n＝12，实验期间不给予dss溶液，每天上午于同一时间段，灌胃等剂量的pbs缓冲溶液；e：结肠炎模型组(mod)：n＝12，每天上午于同一时间段，灌胃等剂量的pbs缓冲溶液；如图5显示了用3％dss诱导小鼠急性结肠炎的实验过程；整个实验分为预防期(day1-21)和治疗期(day22-30)，共30天。除对照组外，预防期结束后，从第22天开始，连续给予3％的dss溶液7天诱导急性结肠炎；在此期间，每天制备新鲜的dss溶液。第29天移除dss溶液，禁食12h后，所有实验组均给予党参皂苷溶液(300mg/kg)一次(第30天)；并在第1，21，30天收集粪便。观察各组小鼠的形态特征和活动状况，同时记录小鼠每天的体重。实验结束时，将小鼠用乙醚麻醉并采用颈椎脱臼法处死。通过摘眼球采血的方法快速采集血液样本，并迅速取出结肠，纵向切开，pbs轻轻清洗。同时，根据文献报道的第二章的2.2.3中的评分标准对疾病等级进行肉眼评估，结肠组织用于mpo酶活和elisa分析。在整个动物实验研究期间，所有实验动物都是严格遵守《国际动物保护准则》中实验动物的关爱和使用标准进行的。此外，本实验采用的所有方法均按照兰州大学实验动物伦理委员会批准的方案进行。结肠mpo酶活测定和组织切片的制备结肠mpo酶活的测定：从-80℃冰箱取出冻存的结肠组织称重，按组织重量比加入10倍体积的pbs溶液充分研磨。在4℃条件下，1000g/min离心5min，吸取组织上清液，并按照mpo酶试剂盒说明书进行后续操作。结肠中与th17/treg平衡相关细胞因子的测定从-80℃冰箱取出冻存的结肠组织称重，按组织重量比加入15倍体积的pbs溶液充分研磨。在4℃条件下，8000g/min离心15min，收集上清液。按照市售小鼠elisa试剂盒(dakewe)的说明书对促炎性细胞因子：il-17a，il-17f，il-6，il-22，tnf-α和抗炎性细胞因子：tgf-β和il-10的表达进行分析。3.2.5illuminamiseq250测序及生物信息学分析根据“测序方法”手册在illuminamiseq250测序平台上对产物进行测序。本课题中涉及到的粪便样品dna的提取、pcr扩增、相应illuminape250文库的构建及高通量测序过程均由上海凌恩生物科技有限公司完成。数据统计处理及分析origin8.0和r3.2.4语言作图软件剖析肠道菌群；spss22进行统计分析，数据在图中以均值±标准误(se)的形式绘制。采用anova分析比较各组之间的差异，利用双尾测试进行评估。p值小于0.05可判断为具有差异性。实验结果党参多糖的含量测定结果采用蒽酮-硫酸法测得党参多糖的含量为55.82％，与购买标签上标注的56％基本一致。3.3.2药物改善结肠炎小鼠宏观疾病状况图6显示了不同药物干预对dss诱导的c57bl/6小鼠结肠炎生理状况的作用。研究发现：在dss诱导的第4天开始，模型组小鼠的体重改变量急剧降低，且显着低于对照组(p<0.01)；而各药物干预组(低聚果糖，党参多糖和党参皂苷)在dss诱导的最后2天与模型组相比，显著抑制了小鼠体重的减轻(p<0.001；图6a)。同时，经dss诱导，虽然评估结肠炎炎症程度的dai评分在模型组极显著增加(p<0.01)；但与模型组相比，各药物干预显著改善了结肠炎小鼠的炎症程度，降低了dai指数(p<0.05)(图6b)。此外，经dss处理的模型组小鼠结肠长度显著缩短(p<0.01)，而各药物干预组(低聚果糖，党参多糖和党参皂苷)与模型组相比，则明显抑制了实验小鼠结肠的缩短(p<0.05；图6c)。mpo酶活力是评价组织中炎性细胞浸润的标志物。研究发现：dss处理后，与对照组相比，模型组中的mpo酶活性急剧升高；但各给药组的mpo酶活值与模型组相比显著降低(图6d)。h&e染色的结肠切片(图6f)显示：对照组小鼠结肠上皮组织结构完整，可观察到明显的杯状细胞和隐窝结构。dss处理后，导致模型组小鼠结肠上皮结构的完整性严重破坏，隐窝、杯状细胞大量破损和缺失，炎症细胞和粘膜下层呈现出大量的炎性细胞浸润。各药物组均对结肠组织炎症和隐窝结构的完整性表现出不同程度的保护作用。此外，组织学评分也清楚显示了各实验组的差异(6e)；对照组的组织学评分显著低于模型组(p<0.01)；而三种药物干预也明显降低了结肠的组织学损伤评分(p<0.05)。实验小鼠肠道中与th17/treg平衡相关细胞因子的表达按照小鼠elisa细胞因子测定试剂盒的说明书，根据各细胞因子的标准溶液的回归方程，求得各样品细胞因子的含量。如图7a-e所示，与对照组相比，dss诱导的结肠炎小鼠中il-17a，il-17f，il-6，il-22和tnf-α的水平显著增加(p<0.01)。与模型组相比，不同药物干预防治，则显著抑制了il-17a，il-17f，il-6，il-22和tnf-α促炎因子的表达(p<0.05)。如图7f-g所示，tgf-β和il-10作为参与treg免疫功能的主要抗炎细胞因子，在dss诱导的结肠炎小鼠结肠黏膜中的表达水平明显低于对照组(p<0.05)。相比之下，各药物干预组的小鼠肠黏膜中tgf-β和il-10的表达显著高于结肠炎模型组(p<0.05)。实验小鼠肠道菌群丰富度和多样性的变化采用illuminape250进行16srrna测序，最终从60个样本中共获得2716932条可用的基因序列和787个otu。根据不同时间节点的样品稀释性曲线图(图8a-c)对比发现：测序数据量的增加促使样品otu数量增大，其稀释性曲线图呈上升趋势，但增加的幅度越来越小，最终曲线趋向平坦；如若连续增加测序深度，也只会有少量新的otu出现。因此，说明测序数据量合理，稀释性曲线可以反映样本的测序深度情况。同时，经各药物干预治疗的实验组小鼠的测序深度有所增加。其中，党参多糖和低聚果糖组均明显大于对照组和模型组。从不同时间点各组小鼠的shannon指数结果看(图8d-f)：无论是在药物干预的预防期，还是在dss诱导的结肠炎小鼠的治疗期，各药物干预组的shannon指数均有上升趋势，其中低聚果糖和党参多糖组均明显上升。实验小鼠肠道菌群的物种组成分析采用韦恩图(venndiagram)研究了3种药物对急性结肠炎小鼠肠道菌群组成的调节，比较各实验组样本之间独有和共有的otu数目(图9a-b)。从结果看，预防期结束后，低聚果糖组独有12个otus，党参多糖组特有23个otus，党参皂苷特有13个otus；对照组特有32个otus。当dss处理导致炎症发生后，虽然实验组所共有的otu数目增加到286个，但各药物干预组所特有的otu数量均有所减少，且各药物防治组与模型组所共有的otu数量明显增加(低聚果糖组431-444otus；党参多糖组：307-333otus；党参皂苷组：428-502otus)。也就是说，dss处理改变了样本中的物种组成。样本间群落组成的层次聚类分析(bray-curtis算法)柱状图(图9c)也显示：无论是预防期还是dss诱导的模型期，三种药物干预均对样本的群落结构造成了影响。具体来说，与对照组和模型组相比，预防期结束后，低聚果糖、党参多糖和党参皂苷组小鼠的肠道菌群略微发生了变化，但其和对照组依旧处于同一分支。而在dss处理的结肠炎模型期，与对照组相比，无论是结肠炎模型组还是各药物干预组的小鼠菌群结构均发生了明显的变化，且其和对照组分处于不同的分支。此外，就模型组和各药物干预组相比，我们发现，低聚果糖组和党参多糖组距离结肠炎模型组的距离较远，其肠道菌群组成相差较大，但党参皂苷组与模型组的距离最近，所以肠道菌群组成最为相似。实验小鼠肠道菌群结构的变化基于欧氏距离的主成分分析(pca)，采用多元统计方法确定预防期和结肠炎模型期，五个实验组小鼠样本群落组成的相似性。结合pca(图10a-b)的分析结果来看：在实验预防期，各给药组与对照组样本群落组成之间并没有明显差异。但dss诱导后，与对照组相比，结肠炎小鼠肠道菌群的总体结构发生了明显变化。同时，模型组和各药物干预治疗组小鼠肠道菌群结构差别较大；且各药物干预治疗组小鼠的整体群落结构与对照组的更为相近；而在所有药物干预组中，低聚果糖组与对照组的群落结构最为相似。实验小鼠肠道菌群组成分析heatmap图作为直观反映不同分类水平上，样本之间菌群组成同一性和特异性的重要指标。通常与样本群落组成层次聚类分析柱状图、及群落结构柱状图联系起来共同分析不同分类水平上，各实验组样本间的菌群差异。门水平上，结合群落结构组成柱状图(图11a)，我们发现各实验组均含有bacteroidetes,firmicutes,proteobacteria,verrucomicrobia,actinobacteria等。在实验预防期结束后，与对照组相比，三种药物干预明显增加了bacteroidetes和actinobacteria的丰度(p<0.05)，下调了firmicutes的丰度(p<0.05)。同时，给药低聚果糖和党参多糖明显增加了肠道中verrucomicrobia的比例(p<0.05)。在dss诱导的结肠炎模型期之后，与对照组相比，结肠炎模型组小鼠肠道中bacteroidetes，verrucomicrobia，proteobacteria和actinobacteria的生长被显著抑制(p<0.01)，而firmicutes，tenericutes，deferribacteres和spirochaetae的丰度显著增加(p<0.01)。此外，党参多糖和低聚果糖抑制了spirochaetae的生长(p<0.01)，而党参多糖和党参皂苷选择性抑制了tenericutes的生长(p<0.05)。通过比较各实验组中厚壁菌门与拟杆菌门的丰度比值firmicutes/bacteroidetes(f/b)(图11b)，我们发现模型组中f/b的比率显著高于对照组(p<0.01)，明显高于低聚果糖组和党参多糖组(p<0.05)。在属水平，如图11c-d所示，预防期结束后，与对照组相比，所有药物干预组中的odoribacter,lachnospiraceaenk4a136group和rikenellaceaerc9gutgroup的丰度均明显受到抑制(p<0.05)，而低聚果糖和党参多糖选择性地促进了akkermansia,lactobacillus,allobaculum,prevotellaceaenk3b31group,bifidobacterium和ruminococcaceaeucg-014strains菌属的生长(p<0.01)。此外，与对照组相比，党参多糖选择性抑制了erysipelotrichaceae_uncultured菌属的生长(p<0.05)。在dss诱导的模型期，结肠炎模型组小鼠肠道中的alistipes，lachnospiraceaenk4a136group，bacteroides，desulfovibrio，helicobacter，parasutterella，paraprevotella，parabacteroides和odoribacter菌属丰度显著增加(p<0.01)，成为了模型组小鼠肠道中的优势细菌。然而，不同的药物干预治疗，各给药组小鼠肠道中的desulfovibrio,alistipes,helicobacter,parasutterella和odoribacter菌属的丰度明显低于模型组(p<0.05)。此外，与模型组相比较，党参皂苷选择性促进了肠道中alloprevotella,bacteroides,roseburia和treponema2菌属的生长(p<0.05)；而低聚果糖和党参多糖选择性增加了bifidobacterium,lactobacillus,turicibacter和quinella菌属的丰度(p<0.05)。值得关注的是：党参多糖组和低聚果糖组中的bacteroides丰度却明显低于模型组(p<0.05)。各实验组小鼠对药物干预起响应的特定菌属lefse分析依照分类学组成对样本采取不同分组方式进行聚类，并利用线型判别分析(lda)，查找出样本之间具有显著性差异的菌属。根据生物统计学绘制的样本聚类树和lda分数直方图可直观的显示出各组样本中发挥主要作用的菌属以及组与组之间存在显著性差异的菌属(图12a和b)。实验预防期结束时，我们发现：低聚果糖组中发挥主要作用且与其他实验组具有差异的是分别隶属于saccharibacteria,proteobactreia,firmicutes和actinobacteria4个门的18株菌，党参多糖组中发挥主要作用且与其他组具有显著性差异的是分属于tenericutes和firmicutes两个门的anaeroplasma，anaeroplasmatales，anaeroplasmataceae，acetitomaculum和clostridialesvadinbb60group5株菌；党参皂苷组是属于actinobacteria门的olsenella菌；对照组是属于firmicutes的eisenbergiella,lachnospiraceaenk4a136group和roseburia；模型组则是分属于firmicutes和proteobactreia门的9株菌。由此，我们也可以看出给药低聚果糖和党参多糖增加了小鼠肠道中发挥关键作用的物种多样性。在dss诱导的结肠炎模型期结束后，我们发现低聚果糖组中发挥关键作用的是saccharibacteria,tenericutes和firmicutes门的13株菌，其中有7株菌在预防期是不起关键作用的，而原来发挥关键作用的12株优势菌也消失了。党参多糖组中分属于proteobacteria和firmicutes的四株菌：bilophila,lachnospiraceaenk4a136group,allobaculum和familyxiiiucg_002起关键作用；且与预防期的优势菌完全不同。党参皂苷组中的优势菌是属于firmicutes，deferribacteres和bacteroidetes的18株菌；与预防期相比，新出现了18株优势菌，且原来的优势菌属已不是其发挥关键作用的菌属。对照组中有14株属于actinobacteria,firmicutes和bacteroidetes门，而在mod组中仅发现了属于firmicutes的ruminococcaceaeucg_005。总体而言，dss诱导的急性结肠炎小鼠肠道菌群多样性明显降低。小节与讨论哺乳动物胃肠道是致密微生物群落的家园，这个群落统称为肠道菌群。肠道菌群与宿主以互惠互利的方式共存，并为宿主提供微量营养素，增加食物的消化和营养吸收等，并分泌辅助营养吸收和全身生理的代谢物。健康个体中，微生物具有多样性，杯状细胞通过产生厚实的结肠粘液层，从而形成一个物理保护屏障，阻止病原微生物的入侵、富集特定粘液驻留微生物。ibd发生时，肠道菌群失调导致微生物多样性减少，其主要归因于bacteroidetes中普雷沃氏菌属prevotellaspecies的减少以及actinobacteria,proteobacteria中粘附侵袭性大肠杆菌escherichiacoli和fusobacteria的大量增长。此外，肠粘膜功能改变后，脂质代谢也受到影响。潘氏细胞和杯状细胞数量减少及其功能缺失，导致抗菌物质的分泌及粘液层厚度降低，最终致使粘膜完整性和屏障功能受损。此过程不仅增加了细菌移位，而且刺激dc和mφ细胞活化诱导改变了t细胞谱，使其产生分泌ifn-γ/tnf-α的th1、分泌il-6/tnf-α的th2和促进il-17产生的th17淋巴细胞，导致炎症反应和组织损伤，进一步恶化了肠道菌群的失调和慢性炎症反应。所以，通过多种方式恢复ibd肠道菌群失调，增加微生物多样性是缓解甚至医治ibd的关键所在。加之，由菌群研究引发的“多组分作用于多个靶点”已成为了研究热点，这也是现阶段益生元、益生菌和合生元受欢迎的原因。党参药理活性广泛，作为临床补中益气的经典中药材，有时甚至可用作人参的替代品，其主要活性成分包括多糖类，三萜类化合物，苯丙素类，生物碱类和聚乙炔类等。据文献记载，目前为止，已经分别从党参根部中分离出分子量超过10kda的水溶性多糖及分子量为14.5kda的果胶多糖。这些发现说明党参药材中的生物活性多糖分子量分布覆盖较宽。党参多糖不仅能抑制人胃腺癌细胞和肝癌细胞的活性，而且以剂量依赖的方式有效降低了空腹小鼠血清中血糖和胰岛素水平，降低丙二醛(mda)含量。同时，研究发现：水溶性党参多糖可改善胃溃疡模型小鼠的胃粘膜损伤；并在体外免疫学研究中，以剂量依赖性的方式刺激伴刀豆蛋白a或脂多糖(lps)诱导的淋巴细胞增殖。此外，马齿苋多糖、黄芪、龙眼多糖等均已证实有菌群调节作用，且实验室课题组在探究四君子汤对结肠炎肠道菌群的作用时意外发现：四君子汤中的主要水溶性多糖-党参多糖(35％)可以增加结肠炎小鼠肠道中有益菌属的比例，抑制有害菌属的生长，一定程度上缓解结肠炎。但由于实验最主要的目的并不是探究党参多糖与肠道菌群之间的作用关系，且实验选用的党参多糖纯度相对较低，所以并未明确党参多糖对肠道菌群的具体影响。因此，在这项研究中，我们建立了dss诱导的急性结肠炎模型来模拟肠道微生物生态失调，采用高纯度的党参多糖探究其对结肠炎小鼠肠道菌群结构和多样性的调节作用，进一步明确党参多糖的益生机制。研究发现，虽然不同药物干预防治均可不同程度改善dss诱导的结肠炎模型小鼠结肠黏膜的损伤，降低疾病活动指数，抑制结肠中与th17/treg平衡相关炎性细胞因子tnf-α、il-17a、il-17f、il-6、il-22的表达，增加抗炎细胞因子il-10和tgf-β的数量，最终缓解结肠炎症反应；但党参多糖的作用效果明显优于党参皂苷，且与低聚果糖组相一致。这可能归功于党参多糖广泛的免疫药理活性和抗炎作用。此现象也进一步证实了前期实验课题组的结论：党参多糖具有缓解结肠炎的作用。采用不同分类学水平的菌群分析，查找三种药物干预后急性结肠炎小鼠肠道菌群结构和多样性的具体差异。在门水平上，研究发现：预防期结束后，三种药物干预增加了bacteroidetes和actinobacteria的丰度；而低聚果糖和党参多糖显著增加了verrucomicrobia的比例。文献报道：bacteroidetes编码了3976个碳水化合物活性酶(cazymes)，其是大分子物质代谢必不可少的。虽然actinobacteria中的许多会导致人类疾病，但部分菌属特别是streptomycesspp可以代谢某些药物产生许多生物活性代谢产物，进而发挥抗菌，抗病毒，免疫调节等作用。verrucomicrobia中的某些菌属能够代谢硫并降解粘蛋白。在dss诱导的模型期，三种药物干预治疗后proteobacteria的丰度显著升高；同时，党参多糖和低聚果糖抑制了spirochaetae的生长。文献记载：proteobacteria中的许多菌属能够诱导iga的分泌进而调节肠道内稳态，而spirochaetae中的大部分菌属具有致病性，其也许会加剧结肠炎的病理进程。f/b的比值不仅与肥胖紧密相关，而且是评估ibd炎症反应的关键指标。我们发现急性结肠炎小鼠肠道中f/b的比值与对照组相比显著增加，这与文献报道相一致。此外，党参多糖和低聚果糖组f/b的比值相对较小，表明党参多糖和低聚果糖可以通过调节肠道中厚壁菌门和拟杆菌门的比例进而缓解结肠炎。在属水平，党参多糖同时刺激了两种重要益生菌属bifidobacteriumspp和lactobacillusspp的生长，抑制了有害菌属desulfovibiospp.,alistipesspp和helicobacterspp的丰度，恢复了结肠炎小鼠肠道菌群的紊乱；其对结肠炎小鼠的菌群调节作用明显优于党参皂苷组，且与已被公认的低聚果糖之间并无显著性差异，所以具有良好的益生元效应。此外，党参多糖和低聚果糖可促进akkermansiaspp,quinella,allobaculum,turicibacter的生长，抑制parasutterella和paraprevotella丰度。研究报道akkermansiaspp能诱导treg(foxp3+t细胞)细胞减轻ⅱ型糖尿病症状，调节肠道黏液厚度、维持肠道屏障完整性；且日常摄入低聚果糖、短链碳水化合物等均可增加肠道中akkermansiaspp的数量；parasutterella和paraprevotella分别在ibd患者及结肠癌患者体内显著升高；而quinella,turicibacter和allobaculum则与发酵产生scfas有关。lefse分析进一步说明三种药物干预不同程度增加了dss诱导的结肠炎小鼠中优势菌的多样性。此外，我们可以看出firmicutes中的某些菌属在各实验组中均属关键菌属，其可能和dss诱导的结肠炎有关。党参皂苷组中的deferribacteres和bacteroidetes门属优势菌门的原因可能是它们中的某些菌属均是参与代谢的重要菌属所致。总之，无论是在预防期还是在结肠炎治疗期，党参多糖对小鼠急性结肠炎的缓解作用可以分为两个方面：一方面，党参多糖在经口给药到达肠道后，由肠道微生物组编码的数千种碳水化合物活性酶降解，通过肠道微生物的发酵将其分解为小分子物质，进而被宿主吸收发挥其药理活性作用；另一方面，党参多糖为肠道菌群提供了营养物质，同时在辅助肠道菌群与病原菌竞争有限的空间时，通过增强机体的免疫应答，促进肠道中益生菌属的生长，抑制病原菌的定植，进而恢复了肠道内稳态。实验例3药物对结肠炎小鼠scfas含量及相关菌属的影响scfas作为结肠细胞能量的来源，其可通过改善肠道通透性和内环境、调节机体能量稳态和免疫细胞趋化性，发挥抗炎和抗菌作用。为了探究党参多糖作用于急性结肠炎后，是否会影响结肠炎小鼠肠道中产scfas菌属及粪便中scfas含量的变化。本发明通过气相色谱法(gc)检测了dss诱导的急性结肠炎小鼠粪便中的scfas含量，并结合16srrna测序结果分析了结肠炎小鼠肠道中与产scfas相关菌属的变化。实验材料仪器：agilent7890b气相色谱仪(包括fid检测器)；nc-ms电子天平、hms-350涡旋振荡器、高速冷冻离心机(美国thermoscientific公司)；药品与试剂：乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、2-乙基丁酸对照品(美国sigma公司)，偏磷酸，pbs溶液。实验方法色谱条件高效毛细管色谱柱：db-ffap(30m*0.25mmid,0.25um),maxtemperature：250℃,载气为高纯度氮气(99.999％)，流速为0.8ml/min，fid检测器温度：230℃，进样口温度250℃，分流比30：1，初始进样温度60℃，保持1min，以20℃/min速率升温至220℃，保持3min。对照品溶液的制备对照混合溶液的配制：准确称取乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和戊酸适量，加入10ml容量瓶中，用含有内标2-乙基丁酸的偏磷酸溶液定容至刻度线，配制成各成分浓度均为200mm的储备液，存放在-4℃备用。内标储备液的配制精密称取25g偏磷酸与0.217ml的2-乙基丁酸加入100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，配制成含有内标2-乙基丁酸的25％的偏磷酸去蛋白溶液，存放在-4℃备用。标准曲线的绘制取混合对照品溶液1.5ml置于agilentgc进样瓶中，分别以0.1ul，0.2ul，0.4ul，0.6ul，0.8ul，1ul不同梯度的进样量(控制浓度)进行样品分析，以检测到的scfas与内标峰面积比值(y)对浓度(x)进行线性回归获得回归方程。小鼠粪便样品的处理方法从-80℃冰箱取出收集到的不同时期、不同组别的小鼠粪便样本，每0.1g混悬于0.5ml的pbs溶液中，漩涡混匀。在4℃条件下，3000g/min离心10min，取上清1ml加入到1.5ml离心管中，再加入0.2ml的去蛋白溶液，混匀；冰水浴静置30min后，于4℃在10000g/min离心12min，取上清放置在新的离心管中，4℃冷藏保存备用。scfas相关菌属分析及数理统计根据第三章16srrna测序数据，结合粪便样本中scfas含量的测定结果；采用origin8.0和r3.2.4语言作图软件分析dss诱导及药物干预防治下，肠道中与产scfas相关的菌属变化。利用spss22进行统计分析，数据在图中以均值±标准误的形式绘制。anova分析进行组间差异比较，并采用双尾测试进行评估。p值小于0.05可判断为具有差异性。实验结果小鼠粪便样品中scfas含量的变化采用gc色谱仪分析研究了dss诱导的结肠炎小鼠粪便中scfas含量的变化。如图13所示，与对照组相比，dss诱导的结肠炎模型组小鼠粪便中乙酸，丙酸，丁酸，异丁酸和异戊酸的含量显著降低(p<0.05)。与模型组相比，三种药物干预显著增加了乙酸，丙酸，正丁酸，异丁酸和异戊酸的含量(p<0.05)，其中党参皂苷组小鼠粪便中的乙酸，丙酸和丁酸含量极显著高于模型组(p<0.01)。然而，值得注意的是，无论是模型组还是各药物干预治疗组，其粪便样本中的正戊酸含量与对照组之间并没有显著差异。肠道中scfas相关菌属的变化本小节结合粪便中scfas含量的测定结果和第三章16srrna测序数据，比较了肠道中与scfas产生相关菌属含量的变化(图14a-b)。如图14a所示，在实验预防期，党参多糖组中促进scfas产生的相关菌属总丰度高于其它各实验组(p<0.01)。当dss诱导后，各药物干预组中促进scfas产生的菌属总丰度以及特定菌属blautia，oscillibacter和quinella的丰度均显著高于模型组(p<0.05)。此外，值得关注的是，党参皂苷组中与scfas产生呈正相关的菌属总体丰度并不受dss处理的影响，一直保持持续增长的趋势，并且可选择性促进prevotellaceaeucg-001菌属的生长(p<0.01)；而低聚果糖和党参多糖干预组中的prevotellaceaenk3b31和prevotellaceaeucg-001菌属的丰度受dss处理的影响均显著降低(p<0.05)。如图14b所示，在实验预防期，与对照组相比，各药物干预组小鼠肠道中抑制scfas产生相关菌属的总丰度显著降低(p<0.05)。经dss诱导后，特定菌属ruminococcaceae_uncultured,coprococcus1,odoribacter和clostridialesvadinbb60group_norank的丰度均显著高于对照组(p<0.01)。值得庆幸的是，在低聚果糖，党参多糖和党参皂苷不同药物干预组中与scfas产生呈负相关的菌属总丰度以及特定菌属coprococcus1和clostridialesvadinbb60group_norank丰度均显著低于模型组(p<0.05)。此外，党参皂苷组中的clostridiumsensustricto1菌属丰度低于模型组(p<0.01)。实验小结与讨论scfas是宿主从外界摄入的未消化碳水化合物在结肠中与肠道共生菌发酵作用产生的产物，主要包括由1-6个不等碳原子组成的乙酸，丙酸，丁酸，异丁酸，异戊酸和戊酸。scfas作为监测肠道内稳态变化的重要信号分子以及结肠细胞的能量来源，不仅可以被肠上皮吸收进入机体循环发挥全身性作用，而且可调节宿主的能量平衡、改善肠道通透性和内稳态、调节能量稳态、代谢以及免疫细胞趋化性，同时还具有抗炎、抗癌和抗菌活性。所以测定小鼠粪便中scfas的含量对深入研究菌群失调对药物发挥治疗作用的影响，探讨肠道菌群与scfas之间的作用关系具有一定的指导意义。研究报道，coprococcus1菌属可抑制丙酸的产生，odoribacter与乙酸、丙酸的产生呈负相关，而clostridialesvadinbb60group_norank菌属抑制了丙酸和丁酸的含量。在本发明中，我们发现给药党参多糖不仅增加了结肠炎小鼠肠道scfas的产生，而且通过选择性富集文献已报道的具有促进scfas产生的blautia，prevotellaceaeucg-001，oscillibacter和quinella菌属，抑制coprococcus1，odoribacter和clostridialesvadinbb60group_norank等某些肠道共生菌的生长，改善了scfas的系统和局部能量供应情况，quinella发酵碳水化合物产生乙酸和乳酸；本实验结果与文献报道一致。除此之外，研究报道，肠道菌群调节scfas的产生还涉及到scfas信号传导的主要机制：hdac的抑制和gpcr的信号传导。在本发明中，我们发现党参多糖通过抑制促炎细胞因子、促进抗炎细胞因子的表达，间接降低了结肠上皮粘膜损伤，并恢复了结肠炎小鼠体内th17/treg的平衡，这可能是由于多糖影响了参与scfas代谢的肠道菌群所导致的结果。实施例4党参多糖调节肠道菌群影响党参皂苷的药代动力学研究中药与肠道菌群之间的复杂联系使得肠道细菌可以介导中药成分之间的互作。为了探究党参药材中活性药理分子党参多糖与党参皂苷在疾病治疗过程中的互作机制。本发明采用超高效液相-质谱联用仪(uplc-tof-ms)探究了党参多糖调节肠道菌群的作用下，党参皂苷在急性结肠炎小鼠模型血清中的吸收情况。实验材料仪器：agilent1260uplc-6460triplequadlc-ms联用仪，nc-ms电子天平，hms-350涡旋震荡仪，hms-350涡旋振荡器、高速冷冻离心机(美国thermoscientific公司)；试剂：色谱级甲醇、屈臣氏超纯水、色谱级乙腈、色谱级甲酸均购自dakewe生物有限公司(中国深圳)，pbs实验方法色谱条件液相条件：色谱柱为agilentporoshell120ec-c18(2.1mm*100mm，2.7um)，流动相-固定相：0.1％甲酸溶液(a)—乙腈(b)；进样量为2ul，柱温30℃。质谱条件：离子源为电喷雾(esi)离子源，正负离子电离模式；干燥气(n2)，温度为350℃，雾化气(n2)压力：15psi，流量12l/min；电喷雾电压3000v，扫描方式为多反应监测(mrm)模式；定量离子m/z：415.2。表2超高效液相-质谱联用梯度洗脱血液样品的处理对经不同药物防治的小鼠禁食12h后，灌胃给予党参皂苷(300mg/kg)一次。在给药1h，3h，6h，9h，12h，24h后，摘眼球收集各组血液样本，并在4℃条件下，10000g/min离心15min，收集血清并存贮于-20℃直至分析。精确量取小鼠血清100ul，加入甲醇300ul，涡旋混匀。4℃条件下，8000g/min离心12min，取样品溶液注入uplc-tof-ms中进行分析，以外标法计算样品中暴露量最高的皂苷单体化合物的相对质量浓度。血清标准曲线的制备取小鼠空白血清匀浆100ul，加入经甲醇连续稀释的1ng/ml党参皂苷水溶液300ul，涡旋混匀。4℃条件下，8000g/min离心12min，取上清于进样瓶中，分别以0.01，0.03，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8ul(浓度控制)不同梯度的进样量注入uplc-tof-ms进行分析，记录样品峰面积。利用样品质量浓度(x)与峰面积(y)作直线回归，得暴露量最大的皂苷单体化合物的血清标准曲线方程。数据分析处理采用pksolver2.0软件(中国药科大学)以非房室模型分析，计算党参皂苷在急性结肠炎小鼠模型血液及盲肠中的药物代谢动力学参数。实验结果党参皂苷的全质谱扫描结果以esi离子源，在正负离子电离模式下，采用mrm模式分别扫描：研究发现党参皂苷在负esi模式下几乎没有质量响应；而在正esi模式下具有相当强的质量响应，且在[m-h]-m/z415.2处获得最高曝光量的皂苷单体分子，以下称为cs-415.2。图15显示了党参皂苷的全质谱扫描图。表3党参皂苷的全质谱扫描分析参数党参皂苷在血清中的含量分布根据血清样品质量浓度(x)与样品峰面积(y)作直线回归，得暴露量最大的党参皂苷单体分子cs-415.2在血清中代谢的标准曲线方程如下：y＝1948721.689038*x+157855.395005；r2＝0.993938。采用uplc-tq-ms技术测定了结肠炎小鼠口服给药党参皂苷一次后，其暴露量最大的皂苷单体分子cs-415.2于24h内在血清中的含量变化。我们发现口服党参皂苷后，在24h范围内，各实验组血清中cs-415.2皂苷单体分子的整体吸收量依次为：低聚果糖组>对照组>党参多糖组>党参皂苷组>模型组。此外，cs-415.2皂苷单体分子在低聚果糖组和对照组血清中的最大吸收量在6h左右；在党参多糖和党参皂苷组中的最大吸收量约在3h，而在模型组中则为1h左右。采用pksolver软件以非房室模型成功研究了cs-415.2在血清中的药代动力学。本申请显示了口服给药党参皂苷300mg/kg后，各实验组小鼠血清中cs-415.2的主要药代动力学参数。与对照组相比，模型组小鼠血清中cs-415.2的药代动力学参数发生了明显改变。具体而言，模型组小鼠血清中的cs-415.2的auc0-inf和cmax显著低于对照组(p<0.05)。然而，在经低聚果糖、党参多糖和党参皂苷干预1个月之后，我们发现，与模型组相比，党参多糖组和党参皂苷组血清中cs-415.2的auc0-inf和cmax均明显提高(p<0.05)。此外，低聚果糖组血清中cs-415.2的auc0-inf和cmax均极显著高于模型组(p<0.01)。表4给药党参皂苷后，最大单体分子cs-415.2在血清中的药代动力学参数a-c上标表示组与组之间具有显著性(p<0.05)实验小结与讨论现阶段，天然药物中活性药理分子的研究因缺乏标准品，以及其在生物样品中的低生物浓度和高变异特征而受限。因此，在这项研究中，我们选择党参皂苷提取物中暴露量最高的单体化合物进行了研究，希望由此探究党参皂苷在结肠炎小鼠体内的量变规律。研究发现：党参皂苷提取物中暴露量最高的单体化合物的分子式为c29h50o，其与豆甾-7-烯-3-醇(stigmast-7-en-3-ol)具有相同的相对分子量。采用“相对暴露法”，在没有标准品的情况下，对实验小鼠血液和盲肠样品中暴露量最高的外源性党参皂苷单体化合物cs-415.2，利用“稀释比标准曲线法”进行相对定量；获得党参皂苷单体化合物cs-415.2的“相对血药浓度”，并非实际血药浓度。研究报道，除了绝对血药浓度，此方法和标准品检测法获得的药代动力学参数并无显著差异。研究发现结肠炎小鼠在灌胃给予300mg/kg剂量的党参皂苷提取物后，其暴露量最高的单体化合物在低聚果糖组的吸收最好，在模型组的吸收率最差，在党参皂苷组、对照组和党参多糖组的吸收率大体一致。也就是说，经低聚果糖、党参多糖和党参皂苷干预一段时间增强了cs-415.2在dss诱导的结肠炎小鼠血清中的吸收，延缓了党参皂苷发挥疾病治疗作用的时间。一方面，这可能是由低聚果糖、党参多糖和党参皂苷一定程度上缓解结肠炎小鼠肠道菌群的失调、促进参与皂苷代谢相关细菌lactobacillusspp，bacteroidesspp和bifidobacteriumspp的生长，进而提高党参皂苷降解为小分子物质更易被机体吸收所引起的。另一方面也可能是低聚果糖、党参多糖和党参皂苷通过促进能够产scfas的akkermansia,bifidobacterium和bacteroides菌属的生长，进而使scfas改善了结肠炎小鼠肠黏膜屏障的破损，最终提高了党参皂苷的肠代谢所致。但无论是哪种原因，我们的研究结果与文献报道相一致。未来将主要关注天然药物活性分子之间的互作机理及其在机体内代谢产物的结构特征研究，为中药现代化应用奠定理论基础。结论1)给予c57bl/6雌性小鼠3％的dss水溶液7天可成功建立稳定性、重复性良好，且无死亡出现的急性小鼠结肠炎模型，适合后期药物疗效的评估。2)低聚果糖、党参多糖和党参皂苷均可通过改善dss诱导的结肠炎小鼠的宏观病理状况；上调与th17/treg平衡相关抗炎因子的表达，下调促炎因子的分泌；调节其肠道菌群结构和多样性；进而不同程度缓解结肠炎。其中，党参多糖的作用效果与低聚果糖组无显著差异，但却优于党参皂苷组。3)给药低聚果糖、党参多糖和党参皂苷增加了结肠炎小鼠肠道内scfas的含量，通过选择性富集文献已报道的具有促进scfas产生的blautia，prevotellaceaeucg-001，oscillibacter和quinella菌属，抑制coprococcus1，odoribacter和clostridialesvadinbb60group_norank等某些肠道共生菌的生长，改善了scfas的系统和局部能量供应情况；其中党参多糖和低聚果糖作用效果最优。4)低聚果糖、党参多糖和党参皂苷防治后，通过调节结肠炎小鼠肠道菌群的失调，增强了党参皂苷中暴露量最高的单体化合物cs-415.2在结肠炎小鼠中的吸收，延缓了党参皂苷发挥疾病治疗作用的时间。其中，低聚果糖作用最优，党参多糖次之。5)党参多糖通过选择性刺激三种重要益生菌属bifidobacteriumspp,akkermansiaspp和lactobacillusspp的生长，抑制有害菌属desulfovibiospp,alistipesspp和helicobacterspp的丰度，恢复了结肠炎小鼠肠道菌群的紊乱；增加了肠道中促进scfas产生菌属的生长；提高了党参皂苷中暴露量最高的单体化合物cs-415.2的吸收率，延长了其发挥药效的作用时间；具有良好的益生元特性，在急性结肠炎的防治过程中显示出良好的应用前景。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。当前第1页12当前第1页12