一种药物组合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种药物组合物，具体涉及一种包括法舒地尔二盐酸盐和二氯乙酸盐的药物组合物，它们的制备方法、以及它们的医药用途，属于药学
技术领域：
。
背景技术：
：rho激酶(rhoassociatedkinase，rock)，是参与细胞有丝分裂粘附、细胞骨架调整、肌肉细胞收缩、肿瘤细胞浸润等一系列细胞生命现象的重要酶。自1996年以来，已发现的rock分为rocki(rockβ)和rockii(rockα)。前者主要存在于非神经组织如心脏、肺、骨胳肌等细胞；后者主要存在于中枢神经系统，如海马锥体神经元、大脑皮质、小脑浦肯野细胞等。rho激酶(rock)在血管平滑肌细胞收缩、细胞迁移、增殖以及凋亡等多项细胞功能中具有重要的细胞内信号转导作用。在多种心血管疾病中都发现了rho激酶异常活化，如动脉粥样硬化、再狭窄、高血压、肺动脉高压和心肌肥厚等。研究表明，慢性缺氧和野百合碱所致大鼠肺动脉高压模型以及严重肺动脉高压患者肺组织和肺动脉中rho激酶活性均显著增高。法舒地尔[六氢-1-(5-磺酰基异喹啉)-1(h)-1，4–二氮杂卓，fasudil，又名ha1077]，是日本旭化成株式会社和名古屋大学药理学研究室合作开发的一种新型异喹啉磺胺衍生物。做为一种新型、高效的血管扩张药，法舒地尔可以有效缓解脑血管痉挛，改善蛛网膜下隙出血(sah)患者的预后，自1996年法舒地尔在日本上市以来，其对于肺血管的作用一直受到研究者的广泛关注，大量的动物实验和临床研究均表明法舒地尔可以：1)激活内源性的神经干细胞促进脑组织修复；2)增加星状胶质细胞刺激因子；3)抑制细胞内钙离子的释放；4)舒张脑部血管；5)保护神经细胞和改善伸进功能；6)促进轴突的再生。因此法舒地尔也用于缺血性脑卒中的治疗。此外，法舒地尔也能够安全有效地治疗肺动脉高压。rock抑制药法舒地尔可以渗透入血管平滑肌细胞，在正常或病理情况下都能与atp竞争rho激酶催化区的atp结合位点，特异地阻断rho激酶活性。目前盐酸法舒地尔抗pah处于ii期临床研究阶段。技术实现要素：目的：本发明提供一种药物组合物、其制备方法及医药用途。技术方案：本发明采用的技术方案为：一种药物组合物，所述药物组合物包括法舒地尔二盐酸盐、二氯乙酸盐；所述法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸盐的摩尔比为1:10至10:1。进一步的，所述二氯乙酸盐为二氯乙酸钠盐、二氯乙酸二异丙胺盐中的一种或两种。作为优选方案，所述法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸盐的摩尔比为1:1。更优选的，所述二氯乙酸盐为二氯乙酸钠盐，所述法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸钠盐的摩尔比为1:1。另一方面，本发明还提供一种药物制剂，其中含有治疗有效量的上述的药物组合物及药学上可接受的载体、佐剂或媒剂。另一方面，本发明还提供上述的药物组合物、上述的药物制剂在制备预防和/或治疗肺动脉高压、蛛网膜下腔出血、缺血性脑卒中等心脑血管疾病的药物中的应用。本发明中，在给予哺乳动物上述化合物及其药学上可接受的盐，以及这些化合物的溶剂化物(这里统称为“治疗药物”)时，可以单独使用，或者最好是按照规范的制药方法将其与适于药用的载体或稀释剂配合后使用。给药方式可以经各种途径，包括口服、非胃肠道给药或局部给药。这里所指的非胃肠道给药包括但并不限于静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射和透皮给药。同时，本发明公开了药物组合物对肺动脉高压的逆转作用。进一步进行动物实验，在野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的治疗模型中，通过将药物组合物灌胃给药发现，药物组合物可明显降低肺动脉高压大鼠的平均肺动脉压，右心室收缩压和右心室肥厚指数，而对体循环压无明显影响；通过将大鼠心肺组织进行病理学检查发现，药物组合物显著降低右心室心肌细胞面积(csa)、心肌及肺组织纤维化程度。说明药物组合物可有效逆转大鼠肺动脉高压，且药物组合物(即法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸盐联合用药)抗肺动脉高压的活性优于法舒地尔和二氯乙酸钠，提示该药物组合物是一种有效的抗肺动脉高压的复方，值得进一步研究。同时，本发明公开了药物组合物预防和/或治疗蛛网膜下腔出血的作用。在大鼠蛛网膜下腔出血模型中(蛛网膜下腔血管内穿孔造模，造模后0.5h和6h各给药一次，评价24h后大鼠的各项指标)，药物组合物(即法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸盐联合用药)显著降低大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛损伤，改善脑水肿和动物神经学评分，明显改善了基底动脉管径、管腔面积及管壁厚度和顶部皮层局部脑血流量(rcbf)，优于法舒地尔和二氯乙酸钠。结果提示法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸盐联合用药是一种有效的抗蛛网膜下腔出血的候选药物，值得进一步研究。同时，本发明公开了药物组合物预防和/或治疗缺血性脑卒中的作用。在大鼠短暂缺血模型中(缺血2h复灌，缺血4h给药一次，24h给药，评价48h后的大鼠的各项指标)，药物组合物(即法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸盐联合用药)有效地降低脑梗死面积，显著优于上市药物丁苯肽(nbp)组，显著优于法舒地尔二盐酸盐组和二氯乙酸钠组；此外法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸盐联合用药还显著地改善了缺血诱导的神经行为功能障碍，明显优于法舒地尔和二氯乙酸钠；略优于nbp组。结果提示法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸盐联合用药是一种有效的抗缺血性脑卒中的候选药物，值得进一步研究。作为rock的抑制剂，法舒地尔可以舒张血管、降低血压，抑制血管平滑肌细胞的增殖，抑制血管重构；而二氯乙酸盐是丙酮酸脱氢酶激酶的抑制剂，可以提高丙酮酸脱氢酶的活性，促进葡萄糖的有氧代谢，减少乳酸的生成；同时还可以促进钾离子通道尤其是kv1.5的表达，抑制平滑肌细胞的增殖和促进其凋亡。因此，法舒地尔和二氯乙酸盐的联合给药可以从多个机制治疗肺动脉高压，缺血性脑卒中以及蛛网膜下腔出血等心脑血管疾病。附图说明图1是实施例5中化合物对mct诱导的pah模型大鼠血流动力学的影响；mpap：平均肺动脉压，rvsp：右心室收缩压；msap：平均体循环压；rv/lv+s：右心肥厚指数；control：对照组，mct：野百合碱；f：法舒地尔二盐酸盐；dca：二氯乙酸钠盐；f+dca：法舒地尔二盐酸盐和二氯乙酸钠盐联合给药组。图2是实施例5中各给药组对大鼠肺小动脉血管壁厚度与肺小动脉直径的比值(pamt)和纤维化程度的影响；pamt：大鼠肺小动脉血管壁厚度与肺小动脉直径的比值；fibrosis：纤维化；control：对照组，mct：野百合碱；f：法舒地尔二盐酸盐；dca：二氯乙酸钠盐；f+dca：法舒地尔二盐酸盐和二氯乙酸钠盐联合给药组。图3是实施例5中各给药组对右心室心肌细胞面积及纤维化程度的影响；cas：心肌细胞横断面面积；fibrosis：纤维化；control：对照组，mct：野百合碱；f：法舒地尔二盐酸盐；dca：二氯乙酸钠盐；f+dca：法舒地尔二盐酸盐和二氯乙酸钠盐联合给药组。图4a是实施例6中不同化合物对sah大鼠脑水肿的影响；图4b是实施例6中不同化合物对sah大鼠自发性活动评分的影响。图5是实施例7中tmcao模型大鼠脑梗死面积和大鼠神经功能评分图。具体实施方式为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。实施例1一种药物组合物，由法舒地尔二盐酸盐、二氯乙酸钠盐组成；所述法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸钠盐的摩尔比为1:10。实施例2一种药物组合物，由法舒地尔二盐酸盐、二氯乙酸钠盐组成；所述法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸钠盐的摩尔比为10:1。实施例3一种药物组合物，由法舒地尔二盐酸盐、二氯乙酸钠盐组成；所述法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸钠盐的摩尔比为1:1。实施例4一种药物制剂，由法舒地尔二盐酸盐、二氯乙酸钠盐和载体组成；所述法舒地尔二盐酸盐与二氯乙酸钠盐的摩尔比为3:7。实施例5预防和/或治疗肺动脉高压一、f+dca化合物对mct诱导的pah模型大鼠血流动力学的影响研究野百合碱(mct)引起的大鼠pah模型中，f+dca及相关化合物的治疗作用。动物分组：①正常对照组；②正常对照组+f+dca；③mct模型组；④法舒地尔二盐酸盐(f)治疗组；⑤dca治疗组；⑥f+dca联合治疗组。大鼠模型的建立：动物模型组及治疗组一次性腹腔注射野百合碱(mct)60mg/kg，正常对照组注射等量生理盐水。实验处理：于注射野百合碱的第14天，各给药组以等摩尔剂量开始给药，给药方式为灌胃给药，每天一次，f组37.5mg/kg，dca组15.5mg/kg，f+dca联合治疗组包括f37.5mg/kg和dca15.5mg/kg，以及正常对照组+f37.5mg/kg+dca15.5mg/kg。正常组和模型组予以等量的生理盐水喂养。各组在第28天进行平均肺动脉压力(mpap)，右心室收缩压(rvsp)和平均体循环压(msap)的测量，随后处死大鼠取肺组织和心脏进行右心肥厚指数(rv/lv+s)，pcna检测，免疫组织化学染色、苏木精-伊红染色，masson染色等处理，评价各给药组在血流动力学、肺动脉平均厚度，肺纤维化程度，右心功能等方面的活性。结果如图1所示，和正常对照组相比，直接给予f+dca对正常大鼠的mpap，rvsp和rv/lv+s的影响不大，说明f+dca的安全性较高。而mct模型组可明显升高mpap，rvsp和rv/lv+s。各给药组均可有效地降低mpap，rvsp和rv/lv+s，其中f+dca组降低mpap，rvsp和rv/lv+s的活性最强，优于f组，dca组。另外，各给药组对msap的影响较小。如图2所示，不同给药组对大鼠肺小动脉血管壁厚度与肺小动脉直径的比值(pamt)和纤维化程度的影响，可以发现f+dca可有效降低pamt和肺小动脉纤维化程度，略优于f组，dca组。如图3所示，各给药组对右心室心肌细胞面积及纤维化程度的影响，结果提示与空白对照相比，mct模型组显著增加大鼠右心室心肌细胞面积和纤维化程度。而给药组，尤其是f+dca可显著降低右心室心肌细胞面积和纤维化程度，优于f组，dca组，结果提示f+dca可有效抑制右心室心肌细胞的增殖与重构。实施例6预防和/或治疗蛛网膜下腔出血实验动物spf级sd大鼠，体重260-340g，雌雄对半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于spf级饲养环境中，室内温度控制在23±2℃，自由饮食和摄水。动物总数32只。假手术组：等体积生理盐水含1％的dmso(n＝8)；实验方法试验分组情况及药物浓度选择：sah模型组：等体积生理盐水含1％的dmso(n＝8)；法舒地尔二盐酸盐(f)组：(26mg/kg)(n＝8)；dca组(10.7mg/kg)(n＝8)；f+dca组：(包括f26mg/kg和dca10.7mg/kg)(n＝8)；所有药物配成含1％dmso的生理盐水溶液，给药方式为尾静脉注射给药。分别在sah(大鼠蛛网膜下腔出血造模)后0.5h和6h后给药各一次，假手术组和模型组使用等体积生理盐水含1％dmso代替。模型及给药方法参考文献(stroke,1995,26,1086–1092)所述进行sah的血管内穿孔模型。即将大鼠麻醉，插管并在手术期间用3％异氟烷在70％/30％医用空气/氧气中保持人工通气。通过直肠探针监测体温，并通过加热灯维持正常热。将锐化的4-0尼龙缝合线引入左颈内动脉(ica)直至感觉到阻力(距颈总动脉分叉约18mm)。然后将缝合线进一步推入以刺穿前脑动脉和大脑中动脉的分叉，直到克服阻力并在穿孔后立即撤回。在假手术动物中，将缝线插入左ica，但没有进行穿孔。缝合线移除后，关闭切口，将大鼠单独圈养在加热的笼子中直至恢复。自发活动评分：将大鼠置于一宽敞、可以自由活动、四壁均可触及的笼中进行自发活动评分。sah造模后24h由2位实验人员分别以双盲法对实验大鼠进行评价和记录，取2组均值为最后得分，自发活动观察后立即处死大鼠。自发活动评分根据动物精神状态及运动情况分为4级：1级，大鼠活动正常，无活动障碍，积极探索四周环境，至少触及三面笼壁的上缘；2级，轻度活动障碍，即大鼠精神差、嗜睡，行动有一定的延迟，没有到达所有的笼壁，但他至少触及一面笼壁的上缘；3级，中度活动障碍，即大鼠几乎不能站立，在笼中几乎不进行活动；4级，重度活动障碍，即老鼠没有动弹，并显示有肢体的瘫痪。结果见图4a。脑含水量测定：分别于sah造模后24h处死大鼠，迅速取出大脑和小脑，用滤纸吸去表面血液。用电子天平分别秤取大脑和小脑的质量(湿重)，然后，将脑组织置于烤箱中，105℃烘烤至恒重，再次称取大脑和小脑的质量(干重)。脑组织含水量的计算公式为：脑组织含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。其中小脑的组织含水量作为正常对照。结果见图4b。基底动脉管径、管腔面积及管壁厚度的测量：将上述各组基底动脉的组织切片进行he染色，光学显微镜下观察照相后，采用imagepro-plus6.0图像分析系统测量基底动脉的管径、管腔面积和管壁厚度。管腔面积的测量方法如下：沿基底动脉内表面测定其管腔周长(l)，在根据公式：直径(d)＝l/π计算管腔直径，半径(r)＝l/2π计算管腔半径，管腔面积(s)根据公式：s＝πr2求得。管壁厚度的测量方法如下：测量基底动脉内表面至中膜外缘之距，不包括外膜。每根血管选取4个不同的检测点测量管壁厚度，取其平均值作为该血管的测定值。结果见表1。表1.各给药组大鼠基底动脉管腔直径、管腔面积和管腔厚度的测量。注：与model相比*p<0.05,**p<0.01，与f+dca组相比#p<0.05,##p<0.01。顶部皮层局部脑血流量(rcbf)测定：在邮顶部用直径5mm小型环钻开骨窗，中心位于bergma点后1mm，后外方3mm。将ldf3型激光多普勒血流仪探头固定于定向仪微推进器上，分别于制备sah前及sah后1、4、12、24h及时观察rcbf。结果见表2。表2化合物对sah大鼠局部脑血流变化的影响注：与model相比*p<0.05,**p<0.01，与f+dca组相比#p<0.05,##p<0.01统计方法：自发活动评分数据采用中位数表示，其余数据均以means±sd表示；自发活动评分据组间统计学差异采用kruskal-wallis检验和mann-whitneyu检验，其余数据组间统计学差异采用one-wayanova和tukey’s检验，p值小于0.05认为有显著性差异。2.3实验结果如图4a-图4b所示，与sah对照组相比，给予不同的受试化合物f和f+dca均可明显降低sah大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛损伤(p<0.01，p<0.01)。如图4a所示，与sah对照组相比，给予不同的受试化合物f和f+dca均可改善动物神经学评分(p<0.01，p<0.01)；同时，明显降低sah大鼠脑含水量(p<0.01，p<0.01)(figure1c)。实验结果表明化合物f+dca对sah大鼠的改善作用显著好于药物f(p<0.01)。并且，与sah对照组相比，给予不同的受试化合物f和f+dca后，明显改善了基底动脉管径、管腔面积及管壁厚度(table1)和顶部皮层局部脑血流量(rcbf)(table2)，且实验结果表明化合物f+dca对sah大鼠的改善作用显著好于药物f(p<0.01)。实施例7预防和/或治疗缺血性脑卒中为研究f+dca在体内是否具有神经保护作用，选用短暂性大鼠脑缺血模型(tmcao)进行实验。模型及给药方法：将大鼠腹腔注射10％水合氯醛(350mg/kg)麻醉后，仰卧位固定在实验台上，颈正中切口，手术刀切开皮肤，钝性分离各层组织，按照大鼠颈部血管解剖图，于体视显微镜下分离左侧颈总动脉(cca)，置线备用向上分离左颈外动脉(eca)和颈内动脉，双重结扎，剪断甲状腺上动脉及枕动脉两条颈外动脉分支，在近cca分叉约5mm-8mm处双重结扎eca，于ica及cca近心端分别用微动脉夹夹闭，在eca近分叉处留置一打好单结但不收紧的丝线，在eca近端结扎处与颈总动脉分叉处之间做一直径约0.2mm的v型微切口，将尼龙线头自切口处轻轻插入，轻轻收紧线结，将颈内动脉于两结扎线间剪断，使之与颈内动脉方向一致松开动脉夹，将尼龙线顺eca经ica送入颅内，插入深度约18mm～20mm微遇阻力时停止，使尼龙线头端位于mca起始处，阻断mca的血流收紧丝线，缝合切口，留置尼龙线尾端于体外。缺血2h后，用10％水合氯醛再次麻醉大鼠，轻轻拉动尼龙线使其头端回到微切口处(略有阻力感)，使大脑中动脉恢复血供，进行再灌注。假手术组大鼠只进行麻醉和血管分离术，不结扎血管及导入线栓，术后动物保温。给药方式：缺血4h、24h后大鼠分别尾静脉注射给药。缺血48h后，神经功能评分，再处死大鼠。分组：假手术组(sham)空白溶剂组(vehicle)法舒地尔二盐酸盐组(f，26.0mg/kg，尾静脉注射)二氯乙酸钠盐组(dca，10.7mg/kg)f+dca组(f26.0mg/kg+dca10.7mg/kg，尾静脉注射)ttc染色：在全脑视交叉及其前后各2mm处，做冠状切四刀，切成五片后迅速将脑片置5ml含有2％ttc的磷酸缓冲溶液中，37℃避光温孵10min，在温孵过程中每隔7～8分钟翻动一次，温孵10min后取出脑片，用数码相机(olympusc-4000，japan)拍照，之后用眼科镊分离苍白区(梗塞区)和非苍白区(正常区)，通过imagepro-plus6.0计算梗塞百分比如下：梗塞百分比(％)＝苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)×100％神经功能评级：在缺血48h后，根据longa’s方法对动物的神经功能缺陷进行分级评分，标准如下：0分：未观察到神经症状；1分：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁；2分：将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低；3分：动物自由行走时向手术对侧环转或转圈；4分；软瘫，肢体无自发活动。统计方法：神经功能缺陷分级评分数据采用中位数表示，其余数据均以means±sd表示；神经功能缺陷分级评分数据组间统计学差异采用kruskal-wallis检验和mann-whitneyu检验，其余数据组间统计学差异采用one-wayanova和tukey’s检验，p值小于0.05认为有显著性差异。结果表明，如图5所示，在缺血4h后，给予大鼠f+dca有效地降低脑梗死面积(梗死面积百分比：6.78％)，显著优于f组和dca组。此外，f+dca还显著地改善了缺血诱导的神经行为功能障碍，优于f、dca。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12