柠檬提取物在制备预防或治疗阿尔茨海默病导致的认知障碍药物中的应用的制作方法

本发明涉及柠檬提取物的新用途，特别涉及柠檬提取物在制备预防或治疗阿尔茨海默病造成认知障碍药物中的用途。本发明属于医药技术领域。

背景技术：

柠檬是民间药物，味酸性凉，具有止渴生津、提神醒脑、祛湿安胎的功效，用于多种类疾病的治疗，例如咽痛口干、减肥，高血压，胃脘胀气，心肌梗塞等。《本草纲目》中提及陈皮(柑橘)“同补药则补；同泻药则泻；同升药则升；同降药则降。”可见远在古代，人们就已经认识到柑橘类的药用价值了。现代研究也表明柠檬具有杀菌、防治结石、预防心血管疾病、提高凝血功能、止血等方面的药理活性。实验显示，酯度极强的柠檬汁在15min内可把活海生贝壳内所有的细菌杀死。此外，柠檬酸有收缩、增固毛细血管，降低通透性，提高凝血功能及血小板数量的作用，可缩短凝血时间和出血时间，具有止血作用。

目前，随着老龄化增长，阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease,ad)ad已经成为一个严重的公共健康问题，给个人、家庭、社会带来诸多的不便。ad是起病隐匿的神经系统退行性疾病，病理表现为脑萎缩、淀粉样变以及神经纤维缠结，是导致老年痴呆的主要病因。在发达国家ad是老年人的第四大死因；在中国，85岁以上的高龄老人的ad发病率为20％，预计到2050年人数将从目前的900万增至3000万。由于疾病中晚期的干预及治疗难以逆转病情，所以要在疾病早期尽可能进行干预和治疗。

本发明提出了柠檬提取物用于改善app/ps-1转基因鼠的神经损伤及认知障碍的新用途，柠檬提取物用于ad疗效确切、毒副作用低、成本低廉、易于操作且易保存，本发明的提出为ad患者提供了一种新的备选药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的药物用于预防或治疗阿尔茨海默病导致的认知障碍。

为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：

app/ps-1双转基因鼠是一种用以研究ad致病机制的转基因小鼠模型，其具有认知功能障碍并伴随神经损伤。本发明利用app/ps-1双转基因鼠模型，随机分为两组，即空白组(a-8-n)，柠檬提取物吸嗅组(a-8-o)，利用水迷宫实验检测小鼠认知功能情况。取各组小鼠大脑海马区组织，并提取蛋白质，利用westernblot实验检测各组小鼠海马中突触后致密蛋白95(psd95)、突触素1(synapsin-1)的表达情况。取各组小鼠大脑组织并固定，利用免疫组化实验检测各组小鼠海马中乙酰胆碱酯酶(ache)的表达情况。

水迷宫实验结果表明8月龄app/ps-1转基因鼠柠檬提取物吸嗅组与未处理组相比，在平台象限停留时间、穿越平台次数上，前者相对于后者明显增多，表明柠檬提取物能有效改善app/ps-1转基因鼠的认知功能障碍。

westernblot实验结果表明app/ps-1转基因鼠柠檬提取物吸嗅组海马中synapsin-1、psd95的表达较未处理组明显增高，表明柠檬提取物能够促进突触重塑，改善ad造成的神经损伤。

免疫组化实验结果表明app/ps-1转基因鼠柠檬提取物处理组与未处理组相比，前者海马中的ache表达明显下降。ache能够水解与记忆相关的乙酰胆碱(ach)，ache在多种神经退行性疾病中的异常增多会导致认知功能障碍。该结果说明柠檬提取物对app/ps-1转基因鼠的记忆损伤具有改善作用。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了柠檬提取物在制备预防或治疗阿尔茨海默病导致的认知障碍药物中的应用。

其中，优选的，所述的柠檬提取物是通过柠檬果皮蒸汽蒸馏法获得。

其中，优选的，所述的蒸汽蒸馏法是首先利用水蒸气将柠檬果皮中挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，再用二氯甲烷萃取，蒸去二氯甲烷后获得所述的柠檬提取物。所述的柠檬提取物可自行提取制备或直接购买自市场，例如可购买自上海源叶生物科技有限公司。

其中，优选的，所述的柠檬提取物通过促进突触重塑，改善ad造成的神经损伤、降低海马中的ache表达来达到预防或治疗阿尔茨海默病导致的认知障碍的目的。

其中，优选的，所述的认知障碍包括记忆力减退、学习能力减弱等。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明提出了一种可用于预防或治疗阿尔茨海默病导致的认知障碍的新的备选药物。实验证明柠檬提取物作为潜在的芳香疗法药物，对ad患者的记忆力减退、学习能力减弱等认知障碍具有很好的预防保护作用，因此，柠檬提取物在预防或治疗阿尔茨海默病领域将具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为水迷宫实验结果；

其中：(a)逃避潜伏期，(b)目标象限与其他象限平均停留时间百分比，(c)游泳速度，(d)目标象限的游泳距离。a-8-n表示8月龄app/ps-1转基因鼠未处理组，a-8-o表示8月龄app/ps-1转基因鼠柠檬提取物吸嗅组。

图2为水迷宫空间探索实验小鼠游泳轨迹；

其中：a-8-n表示8月龄app/ps-1转基因鼠未处理组，a-8-o表示8月龄app/ps-1转基因鼠柠檬提取物吸嗅组。

图3为wb检测小鼠海马中的psd95表达量；

其中：(a)wb实验检测psd95表达量结果，(b)表达量的统计数据，p<0.05；

图4为wb检测小鼠海马中的synapsin-1；

其中：(a)wb实验检测synapsin-1表达量结果，(b)表达量的统计数据，p<0.05；a-8-n表示8月龄app/ps-1转基因鼠未处理组，a-8-o表示8月龄app/ps-1转基因鼠柠檬提取物吸嗅组。

图5为免疫组化检测ache表达量；

其中：(a)海马区ache阳性神经元表达，(b)ache阳性神经元表达的统计数据，p<0.05；a-8-n表示8月龄app/ps-1转基因鼠未处理组，a-8-o表示8月龄app/ps-1转基因鼠柠檬提取物吸嗅组。

图6为免疫组化检测psd95。

其中：(a)psd95阳性神经元表达，(b)psd95阳性神经元表达的统计数据，p<0.05。a-8-n表示8月龄app/ps-1转基因鼠未处理组，a-8-o表示8月龄app/ps-1转基因鼠柠檬提取物吸嗅组。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1柠檬提取物的制备

柠檬提取物通过柠檬果皮蒸汽蒸馏法获得，得到的精油颜色是浅黄色的，带有植物的特征性的果香。首先利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，再用二氯甲烷萃取，蒸去二氯甲烷后获得精油，其中，90％以上的成分为柠檬烯。常温避光保存备用。

所述的柠檬提取物可自行提取制备或直接购买自市场，例如可购买自上海源叶生物科技有限公司。

实施例2柠檬提取物在预防或治疗阿尔茨海默病导致的认知障碍中的应用

1.准备实验动物

8月龄spf级雄性app/ps-1转基因小鼠，购于北京维通利华公司。分笼饲养于哈尔滨医科大学实验动物中心。适应性喂养1周，每笼5只群养。app/ps-1转基因鼠可表达突变的人类早老素和淀粉样前蛋白，6-7月龄脑内会形成β-淀粉样蛋白沉淀。将动物随机分为两组：空白组(a-8-n)5只，柠檬提取物吸嗅组(a-8-o)5只。取柠檬提取物(源叶生物)1ml滴入ivc封闭笼盒中挥发，吸嗅组小鼠吸嗅1h/d/cage，连续4周。其余动物每天放入ivc密封箱每天给予相应剂量的水挥发。4周后，进行水迷宫实验，神经行为学检测。

2.水迷宫实验

水迷宫(morriswatermaze,mwm)实验是分析啮齿类动物空间学习能力和记忆行为的有效工具，广泛应用于学习记忆、老年痴呆、药理毒理、神经生物等学科研究中。老鼠天生是游泳健将，但是它们不喜欢呆在水里，并且游泳对于老鼠来说是十分消耗体力的活动，因此他们会本能的寻找水中的休息场所。此行为涉及到复杂的学习记忆过程，它们收集周围空间中与空间定位有关的信息，再对这些信息处理、整理、记忆、巩固、再读取，目的是成功导航并找到隐藏在水中的平台，从而摆脱水中环境。实验房间选择安静、暗光、恒温环境进行测试，实验装置采用某动物行为记录分析系统。实验前将水池中注入清水，水深约20～25cm，加入2kg食用色素二氧化钛，使水成为不透明的白色液体，加热水温至22℃。水池周围设置围帘阻隔小鼠视线，免除实验者和周围物体对测试小鼠产生干扰。每一象限池壁上用不同形状贴纸标记，以示区别帮助动物确定方位。直径约9cm的逃生平台置于e象限中央水面下1cm处，整个实验过程平台位置保持不变。水迷宫装置顶部有照明机摄像装置，连接电脑，有配套软件进行数据分析。

第一天，水池中不设置逃生平台，将小鼠沿池壁轻轻放入后迅速离开，任小鼠自由游泳2min，通过摄像观察小鼠活动，保证小鼠具有正常游泳能力，并适应水池环境。随后6天开始空间记忆采集实验，实验分为定位导航(navigationtest)和空间探索实验(probetrial)。将逃生平台放置好后，各组小鼠分别从4个象限4个入水点面向池壁进行4次实验，且每天入水象限顺序不同，所有个体均在同一象限完成实验后再换下一象限。记录动物寻找并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期，登上平台后在平台停留30s以便小鼠根据图标记忆平台位置并减轻紧张感，再放回笼中。如果60s内仍未找到平台，将其引至平台，并在平台上停留30s后放回笼中，约60min后进行下一方向训练。空间搜索实验用于评价动物对平台位置的记忆，即记忆保持能力。第6天撤除逃生平台，从距离平台点最远的象限将测试小鼠放置入水，自由活动60s，统计小鼠60s内目标象限停留时间、穿越平台次数、游泳距离、平均游泳速度。结果如表1、图1以及2所示。

表1

如图1中的1a、1b所示，与未吸嗅组相比，柠檬提取物吸嗅组的小鼠逃避潜伏期较短，说明吸嗅后ad小鼠认知障碍有改善。图1c可以看出两组小鼠游泳速度无明显差异，吸嗅组的游泳总距离小于对照组。在最后一天撤去平台后的空间探索实验表明(图2)，吸嗅组小鼠在目标象限中停留时间高于对照组；观察两组的运动轨迹，吸嗅组在目标象限运动明显多于对照组且目的性更强。

以上数据说明8月龄的app/ps-1转基因鼠，柠檬提取物吸嗅后可以更快找到隐藏的平台，在撤去平台后可以目标性更明确的在目标象限寻找逃生平台，说明吸嗅组较对照组在空间学习记忆能力上占据优势。

综上所述，水迷宫实验结果表明：app/ps-1转基因鼠利用柠檬提取物吸嗅处理后，小鼠学习记忆能力得到明显改善。

3.wb实验检测psd95、synapsin-1表达情况

ad造成脑萎缩，神经缠结等，表现为行为改变和记忆力减退、学习能力减弱等认知障碍。海马神经元是空间记忆的基础，对记忆的存储和整理非常关键。众所周知，神经元是不可再生的，突触重塑可能是改善认知障碍的关键，所以我们选择了和突触功能相关的测试指标：psd95、synapsin-1。

对各组小鼠处理4周后，将小鼠麻醉后处死。冰上取小鼠海马、嗅球、大脑皮层，分别用pbs洗两遍，放入准备好的无rna酶的离心管中。用提前清洗好的研磨棒研磨，静置10min，涡旋20s，冰上再次静置10min，涡旋20s，静置10min，放入4℃预冷的离心机，13000rmp，离心30min，取上清。采用bca蛋白质定量试剂盒进行蛋白定量，对定量后蛋白进行变性处理，-80℃储存。制备page胶，将配置好的胶块装入电泳槽电泳，根据蛋白marker及溴酚蓝指示，在跑至距底部1cm时停止电泳。转膜后，取出pdvf膜，用5％脱脂奶粉室温封闭2h后用tbst清洗，剪膜，分别孵育兔来源一抗psd95，synapsin-1，及内参tubulin，摇床4℃孵育过夜。次日将膜放入盛有tbst的玻璃皿中，室温摇床洗3次，每次10min，室温孵育山羊抗兔、兔抗小鼠二抗2h。清洗后，将pvdf膜控干平铺于显影仪上，将显影液混合均匀，均匀滴在pvdf膜上，进行蛋白显影，并做灰度分析。

psd95，属于膜相关鸟氨酸激酶蛋白家族的一员，是组成兴奋突触的主要蛋白，也是功能性突触形成的基本需求。结果如图3所示，a-8-n组小鼠psd95表达量低，柠檬提取物吸嗅后表达增加，并且有统计学意义(p＜0.05)。说明psd95参与了认知损伤修复过程，对小鼠的学习记忆起到改善作用。

synapsin-1是神经特异性突触囊泡相关磷酸蛋白，有多个磷酸化位点，通过磷酸化和去磷酸化形式，在突触囊泡功能和递质释放中起重要作用。如附图4所示，a-8-n组小鼠synapsin-1表达量低，柠檬提取物吸嗅后表达增加，并且有统计学意义(p＜0.05)。说明synapsin-1参与了认知损伤修复过程，对小鼠的学习记忆起到改善作用。

统计处理：采用spss软件包分析，数据以“χ±s“表示，多组比较采用单因素方差分析，以p<0.05为差异有统计学意义。

综上，结果表明柠檬提取物通过促进突触重塑的方式，保护神经元并改善记忆功能。

4.免疫组化实验检测psd95、ache阳性神经元

海马神经元是记忆的基础，对记忆的存储和整理非常重要，使用指标ache验证柠檬提取物对ad的改善作用。

吸嗅处理4周后，用1％戊巴比妥钠将小鼠麻醉。仰卧固定小鼠四肢，剪开皮肤暴露胸部肌肉层，暴露心脏，将37℃生理盐水缓慢匀速注入10ml，将血液冲净。用4％的多聚甲醛灌注10-20min预固定大脑，完整取出小鼠大脑，放入盛有pbs的培养皿内，充分冲洗，用4％多聚甲醛固定24h后脱水。将大脑沿正中矢状面切开，分别取左右侧大脑矢状面向上石蜡包埋。使用石蜡切片机将脑组织蜡块切片，厚度4um，使用两步展片法展片捞片。将切好组织切片，设定60℃烤片3h。使用二甲苯脱蜡，梯度水化，冷水冲洗1-2min。使用抗原修复液柠檬酸钠进行抗原修复。冷水洗2min，pbs清洗3次后，加入h2o2阻断10min，用pbs清洗3次，加入来源为兔的一抗psd95及来源为兔的一抗ache，4℃敷育过夜，pbs清洗去除多余一抗，加入山羊抗兔二抗，室温敷育20min，用pbs清洗三次。用dab显色6min，苏木素复染2min，水洗去除多余染液，0.1％hcl酒精分化10s，氨水返蓝2s，水冲10-15s，过梯度酒精，95％乙醇每缸5min，共2个；无水乙醇每次5min，过3次；二甲苯每次5min，过2次，使用中性树脂湿封。观察切片。统计处理：采用spss软件包分析，数据以“χ±s“表示，多组比较采用单因素方差分析，以p<0.05为差异有统计学意义。

图5所示为免疫组化检测ache表达量结果，如图5所示，柠檬提取物可以降低小鼠海马中ache的表达。(a)海马区、ca3区ache阳性表达神经元；(b)对ache染色阳性区域进行光密度测定，做半定量分析。ach是形成记忆所必须的神经递质，是形成长期记忆的生理基础，ache靶向水解ach。因此，降低或者抑制ache的表达可以在突触水平防止ach降解进而增加其含量，对认知功能产生保护作用。海马ca3区是由锥体细胞构成，细胞呈锥形，从锥体形的尖端发起树突，伸向皮质的表层。图中可以清晰的看到被染色的轴突和树突，吸嗅组和对照组相比，ache表达降低(p<0.05)。

图6所示为免疫组化检测psd95，如图6所示psd95免疫产物呈褐色颗粒，表达于神经元胞体、神经纤维，各组均有表达，且在海马表达广泛。在海马中，psd95分布于ca1-4区锥体细胞，dg区颗粒细胞层，呈颗粒和点状。结果显示，吸嗅组相比对照组，免疫着色颗粒较大，光密度增加，广泛表达于神经元和神经纤维，即柠檬提取物吸嗅后psd95表达增加(p<0.05)。

综上所述，免疫组化实验的图5-6的结果表明，app/ps-1转基因鼠柠檬提取物吸嗅处理后，ache表达量降低，表明精油提取物通过抑制ache活性提高小鼠学习记忆能力。同时，海马部分psd95表达增加。

综合所有结果，由ad导致的认知障碍，利用柠檬提取物处理后，小鼠记忆得到明显改善，说明柠檬提取物能拮抗ad引起的认知障碍，且差异具有显著性。结论：柠檬提取物能改善小鼠记忆功能，且与神经突触相关的psd95，synapsin-1表达增加，ache表达降低密切相关。

以上所述实施例仅为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。