桃胶萃取物于促进胶原蛋白增生或抑制胶原蛋白降解以及增加皮肤保水能力的用途的制作方法

本发明是关于一种桃胶萃取物的用途，尤其是关于一种将桃胶萃取物用于调控促进胶原蛋白增生或抑制胶原蛋白降解，与提升皮肤保水能力相关基因表现的用途。

背景技术：

如何兼顾健康，同时具有美容的效果，是现代人身体保养所追求的梦幻目标之一。因此，仿间提供有诸多的健康食品、营养品，让消费者可依照自己身体的需求，选购适合的保健营养品，为家人或自己的健康加分，以维持较好的生活质量。

其中同时具有美容功效，又有身体机能维持者即为胶原蛋白。胶原蛋白在骨骼形成的过程中，扮演了极为重要的角色，因此对于骨骼的健康息息相关，因此若有足量胶原蛋白的维持，对于骨质疏松将会有不错的改善效果。此外，胶原蛋白被认为与软骨细胞的修复有关，对于关节炎症状有很好的缓解效果。另一方面，胶原蛋白则是与皮肤的弹性有关，能推迟皮肤的老化并减少皱纹、改善橘皮组织。

因此，若有一组合物或成分，可促进体内胶原蛋白的生成，或是减少其代谢，则可达到前述所欲的功效，为人类健康与美容带来双效的改善。所谓桃胶，是由桃树树皮所分泌出来的油脂，形状看似琥珀，所以又称为桃花脂、桃花泪或桃凝等。桃胶在一般情形下可由桃树自然分泌，或分泌以对抗真菌，或在产生伤口时分泌，以利于伤口愈合。已知桃胶有清血降脂，缓解压力和治疗尿道结石、血尿的功效，但对于胶原蛋白的生成并未有相关的研究。

技术实现要素：

本发明目的之一在于提供一种桃胶萃取物于促进胶原蛋白增生或抑制胶原蛋白降解的应用，藉由桃胶萃取物的作用，增加胶原蛋白或弹力蛋白的分泌与含量。

在本发明的一实施例中，该桃胶萃取物可以水萃取所获得。在一态样中，该桃胶萃取物可于50～100℃下萃取所获得。

在本发明的一实施例中，该桃胶萃取物可用以促进基因timp1或col1a2的表现，而增加胶原蛋白的生成。

在本发明的另一实施例中，该桃胶萃取物可用以抑制基因mmp1、mmp2或mmp9的表现，而减少胶原蛋白的降解。

在本发明的再一实施例中，该桃胶萃取物可进一步添加于食品、保健食品或膳食补充品中。此外，该桃胶萃取物亦可进一步用于医药组成物的制备。

本发明的另一目的之一在于提供一种桃胶萃取物于促进皮肤保水能力的应用，藉由桃胶萃取物的作用，增加皮肤保水与锁水的能力。

在本发明的一实施例中，该桃胶萃取物可用以促进基因tgm1、krt1、aqp3、gba或has3的表现，而增加皮肤中水分的维持能力。

在本发明的一实施例中，前述该桃胶萃取物可以水萃取所获得。在一态样中，该桃胶萃取物可于50～100℃下萃取所获得。

在本发明的另一实施例中，前述该桃胶萃取物可进一步添加于食品、保健食品或膳食补充品中。此外，该桃胶萃取物亦可进一步用于医药组成物的制备。

以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明实施例的桃胶萃取物对于胶原蛋白分泌影响的测试结果图；

图2是本发明实施例的桃胶萃取物对于弹力蛋白表现影响的测试结果比较图；

图3是本发明实施例的桃胶萃取物对于tmp1、col1a2基因表现影响的结果图；

图4是本发明实施例的桃胶萃取物对于mmp1、mmp2、mmp9基因表现影响的图；

图5是本发明实施例的桃胶萃取物对于tgm1、krt1、aqp3基因表现影响的结果图；

图6是本发明实施例的桃胶萃取物对于gba、has3基因表现影响的结果图。

具体实施方式

实施例1桃胶萃取物的制备。

桃胶块/粒进行粗碎，取粉碎的桃胶以1～5∶10～30的液固比，以水混合后加以均质化，之后于50～100℃下进行0.5至3小时的萃取反应。反应后，冷却至室温，再以400目筛网过滤。将过滤液于45～70℃下减压浓缩，浓缩后即得桃胶萃取物(萃取液)。

实施例2胶原蛋白分泌测试

准备人类皮肤纤维母细胞(ccd-966sk，atcccrl-1881)，培养于细胞培养液[含10％胎牛血清的最低必需培养基，1％盘尼西林/链霉素(penicillin/streptomycin)]中。于24孔盘每孔中加入500μl细胞培养液，使每孔具有2x10⁴个细胞，之后于37℃下，培养24小时。

之后移除每孔中的培养液，以pbs清洗，分成三组(每组2孔)准备试验。a组为空白对照组，无细胞，仅加入500μl无血清培养液，b组为控制组，为细胞加入500μl无血清培养液，c组则为细胞加入500μl无血清培养液，并加入由前述实施例1所制备的桃胶萃取液0.5mg/ml的试验组。前述各组与培养液一同加入后，于37℃下培养48小时。

之后将每组2孔的溶液取出(共1000μl)转移至1.5ml微量离心管中，分别加入200μl胶原蛋白分离与浓缩溶液(sircol^tmsolublecollagenassaykit，biocolor)，来回摇晃6至8次后，于4℃下反应整晚。之后由4℃下取出(不震动搅拌)，在12000rpm下离心10分钟。轻缓地移除上清液后，加入1000μlsircol染剂，再缓慢摇晃30分钟。之后，于12000rpm下离心10分钟，移除上清液后，加入750μl酸盐(acid-salt)清洗溶液，再于12000rpm下离心10分钟。移除上清液后，将离心管倒放，小心地移出所有液体，同使以棉花棒将管壁与盖上所有液体拭干。之后加入250μlalkali试剂，震动搅拌均匀，于555nm波长下测量其吸光值(bioteck)。量测出的数值以微软excel软件，利用studentt检定分析二数值间的统计显著性，其结果如图1所示。其中，*表示p值＜0.05。

由图1的结果可知，在含有本发明实施例的桃胶萃取物的情况下，胶原蛋白的分泌量增加了约12％，亦即本发明实施例的桃胶萃取物可促进胶原蛋白的增生，因此可将该桃胶萃取物进一步应用于皮肤皱纹、皮肤弹性的改善，以及骨质疏松、关节炎的缓解。

实施例3弹力蛋白表现测试

准备人类皮肤纤维母细胞(ccd-966sk，bcrcno.60153)，培养于细胞培养液[含最低必需培养基(eagle)的earle′sbss，0.1mm非必需氨基酸，1.5g/l碳酸氢钠，1mm丙酮酸钠，90％；以及胎牛血清10％(gibco)]中。准备腔室玻片培养盘，于每孔中种入5x10³个细胞，再于试验组中加入由前述实施例1所制备的桃胶萃取液0.5mg/ml，于37℃下培养整晚。

接着加入三聚甲醛(paraformaldehyde)固定细胞，于室温下反应10分钟。之后以1xpbs(gibco)清洗三次，再加入0.2％tritonx-100增加细胞通透性，于室温下反应10分钟。之后进行阻断，加入1％bsa于37℃下反应1小时，之后以1xpbs(gibco)清洗三次。接着，加入已稀释于1％bsa的第一抗体(抗弹力蛋白抗体，merck；mab2503)，于37℃下反应1小时，之后以1xpbs(gibco)清洗三次。再加入已稀释于1％bsa的第二抗体(抗老鼠alexa488抗体，thermo)，于37℃下反应1小时后，以1xpbs(gibco)清洗三次。之后加入hoechst33342染剂(thermo)，于室温下培养3～5分钟，再以1xpbs(gibco)清洗三次。最后将玻片取出置于荧光显微镜下观察，其结果如图2所示。

由图2的结果可知，在含有本发明实施例的桃胶萃取物的情况下，所观察到弹力蛋白的数量明显增加，相较于一般细胞分泌的状况，可提高约30～50％的数量。因此，藉由本发明实施例的桃胶萃取物，确实可提升弹力蛋白的生成，增加皮肤的弹性。

实施例4胶原蛋白增生相关基因的检测

准备ccd-966sk细胞(bcrcno.60153)，培养于细胞培养液[含最低必需培养基(eagle)的earle′sbss，0.1mm非必需氨基酸，1.5g/l碳酸氢钠，1mm丙酮酸钠，90％；以及胎牛血清10％(gibco)]中。分成控制组以及加入1mg/ml实施例1所制备的桃胶萃取液的试验组，于37℃下培养6小时后进行检测，分析与胶原蛋白生成或分解相关的特定基因的表现状况。

将上述各组细胞回收，以rna萃取套组(genemark)萃取其rna，并以反转录酶(superscriptiiireversetranscripatase，invitrogen)将该些rna反转录为cdna。之后利用实时聚合酶链锁反应系统(abisteponeplusreal-timepcrsystem)，分别利用表1所列引子进行qpcr(kapacybrfastqpcrkits，kapabiosystems)，以定量以下基因的表现：timp1、col1a2、mmp1、mmp2与mmp9(以gadph基因的表现做为内部控制组)。基因表现相对定量分析是采用2^-δδct法。关于基因表现的结果如图3与图4所示。其中，*表示p值＜0.05，**表示p值＜0.01，***表示p值＜0.001。

表1

由图3的结果可知，在含有本发明实施例的桃胶萃取物的情况下，可将timp1基因表现的相对值提升15％，而将col1a2基因表现的相对值大幅提升至36％。由于timp1与col1a2基因与胶原蛋白的生成有关，因此藉由本发明实施例的桃胶萃取物确实能够促进timp1与col1a2基因的表现，进而使胶原蛋白的生成增加。

另一方面，如图4所示，在含有本发明实施例的桃胶萃取物的情况下，使得mmp1、mmp2与mmp9基因的表现分别大幅减少了约70％、33％与44％。由于mmp1、mmp2与mmp9基因所表现产生的酵素可对胶原蛋白进行分解，因此该些基因表现降低时，也降低了胶原蛋白的代谢速率，即可抑制胶原蛋白的降解，相对比之下，可使胶原蛋白的维持数量增加。

实施例5皮肤保水能力相关基因的检测

准备人类初代表皮角质形成细胞hpek-50(humanprimaryepidermalkeratinocytes，cellntec)，培养于keratinocyte-sfm(1x)细胞培养液中(thermo)。准备一6孔盘，于每孔中加入2ml细胞培养液，使每孔具有1.5x10⁵个细胞。分成控制组以及加入0.5mg/ml实施例1所制备的桃胶萃取液的试验组，于37℃下培养6、24小时后进行检测，分析与皮肤保水能力相关特定基因的表现状况。

将上述各组细胞回收，以rna萃取套组(genemark)萃取其rna，并以反转录酶(superscriptiiireversetranscripatase，invitrogen)将该些rna反转录为cdna。之后利用实时聚合酶链锁反应系统(abisteponeplusreal-timepcrsystem)，分别利用表2所列引子进行qpcr(kapacybrfastqpcrkits，kapabiosystems)，以定量以下基因的表现：tgm1、krt1、aqp3、gba与has3(以gadph基因的表现做为内部控制组)。基因表现相对定量分析是采用2^-δδct法。关于基因表现试验6小时的结果如图5与图6所示。其中，*表示p值＜0.05，**表示p值＜0.01，***表示p值＜0.001。

表2

由图5的结果可知，在含有本发明实施例的桃胶萃取物(0.5mg/ml)的情况下，可将tgm1基因表现的相对值大幅提升54％，krt1基因表现的相对值大幅提升90％，而将aqp3基因表现的相对值巨幅提升至129％。因此藉由本发明实施例的桃胶萃取物确实能够促进tgm1、krt1、aqp3基因的表现，由于tgm1、krt1、aqp3基因与皮肤角质结构的维持有关，因此结构愈完整，水分愈不易流失，可提升皮肤保水的能力。

另一方面，如图6所示，同样地，在含有本发明实施例的桃胶萃取物(0.5mg/ml)的情况下，也可使gba基因表现的相对值大幅提升77％，对于has3基因表现的相对值则提升了22％。由于此二基因与皮肤对水分的维持相关，因此藉由本发明实施例的桃胶萃取物，确实具有促进皮肤保水能力提升的效用。

藉由上述试验可知，本发明实施例的桃胶萃取物除了可增加胶原蛋白的生成外，亦具有抑制胶原蛋白降解的功效，能够使胶原蛋白分泌的数量增加。此外，本发明实施例的桃胶萃取物更能调节与胶原蛋白生成或分解有关基因的表现，达成前述促进胶原蛋白增生并抑制其降解的功效。

另一方面，本发明实施例的桃胶萃取物也具有调控皮肤保水能力基因表现的功效，藉由相关基因表现的促进作用，达成前述提升皮肤维持水分，增加皮肤健康等功效，且具有美容的效果。

此外，本发明实施例的桃胶萃取物，亦可进一步添加于食品、保健食品或膳食补充品中，或进一步应用于美容或保养品等产品中。同时亦可将本发明实施例的桃胶萃取物制备为医药组成物，而该医药组成物亦可进一步加入所属技术领域所熟知的载剂或其他辅剂。医药组成物的剂型，可为但不限于溶液、胶囊、或锭剂。