间充质干细胞在制备脊髓损伤修复治疗剂中的用途的制作方法

本发明属于干细胞应用领域，具体涉及间充质干细胞在制备脊髓损伤修复治疗剂中的用途。
背景技术：
：脊髓损伤(spinalcordinjury,sci)是由外伤诱发的一种脊柱外科创伤性疾病，表现为在损伤节段以下出现感觉、运动和自主神经功能障碍。国外流行病学调查显示，每年全球有13万新发脊髓损伤患者，且有超过250万患者正饱受着不同程度的脊髓损伤后遗症困扰，而这些sci患者每年的医疗支出将超过60亿美元，给家庭及社会造成沉重负担。目前临床上用于治疗sci的方法主要局限在药物、手术及各种物理干预，sci的干细胞治疗仍停留在动物相关的基础研究层面，如骨髓基质干细胞移植、自体脂肪间充质干细胞移植、嗅鞘细胞移植、脐带血间充质干细胞移植、脐带华通胶来源间充质干细胞(mesenchymalstemcells,mscs)移植、nogoa疫苗移植等。脂肪在人体中大量存在，容易获取。脂肪组织经过分离、培养、筛选可得到脂肪干细胞(adiposederivedstemcells，adsc)。adsc经过定向诱导培养后，可以分化为外胚层来源神经前体细胞和中胚层来源的内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、和神经前体细胞。因此自体脂肪干细胞具有来源广泛、易扩增等优点成为了干细胞移植的重要来源细胞。在临床上，脊髓损伤患者经各种保守治疗后神经功能可获得一定程度的恢复，如糖皮质激素药物冲击、神经营养药物静点及高压氧治疗等。但是保守治疗在临床上对于神经功能的恢复并不是十分的理想，还有改善的空间。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明公开了间充质干细胞在制备脊髓损伤修复治疗剂中的用途。本发明所采用的技术方案如下：间充质干细胞在制备脊髓损伤修复治疗剂中的用途。其进一步的技术方案为，所述间充质干细胞来源于脂肪间充质干细胞。其进一步的技术方案为，所述间充质干细胞是来源于自体脂肪间充质干细胞。其进一步的技术方案为，所述治疗剂为注射剂或者静脉滴注剂。其进一步的技术方案为，所述治疗剂为间充质干细胞与生理盐水的混合液。其进一步的技术方案为，所述治疗剂为注射剂时，每次用量为细胞量/生理盐水＝3×106/3ml；所述治疗剂为静脉滴注剂时，每次用量为细胞量/生理盐水＝4×107/100ml。其进一步的技术方案为，所述间充质干细胞是自体脂肪间充质干细胞；所述治疗剂的使用方法是：(1)对病人进行抽脂手术，抽取50ml脂肪；(2)将抽取的脂肪提取脂肪间充质干细胞进行保存；(3)对病人进行脊髓损伤修复治疗；在腰椎髓鞘内注射治疗剂，每次用量为细胞量/生理盐水＝3×106/3ml，同时静脉滴注治疗剂，每次用量为细胞量/生理盐水＝4×107/100ml。其进一步的技术方案为，所述脊髓损伤修复治疗共进行八次；在第一次至第四次的治疗过程中，每相邻的两次治疗间隔两周；从第五次开始，每相邻的两次治疗间隔一个月。其进一步的技术方案为，所述治疗剂为注射剂时，每次用量为细胞量/生理盐水＝1×106/ml。其进一步的技术方案为，所述治疗剂的使用方法是：对患者的双下肢的膝关节以及髀关穴、阴市穴、风市穴、殷门穴、上巨虚穴和承山穴注射所述治疗剂；注射频率为每个月注射一次。本发明的有益效果如下：通过本发明所述的治疗方案，也即脊髓修复手术联合使用自体脂肪间充质干细胞制成的治疗剂来治疗脊髓损伤，与单纯的手术治疗相比存在显著的优势。这是因为常规的手术方法只解决了损伤部位的异物排除、压力过高和粘连松解问题，并没有对受损的脊髓组织进行修复和再生的工作。且本发明的治疗方案相对于手术治疗来说，对患者来说痛苦较少，只需要静脉滴注和注射，另外本发明的治疗方案也可以与手术治疗相结合，为患者提供更好的治疗效果。附图说明图1是nse阳性神经元的示意图。图2是nse阳性神经元的初级突起的示意图。图3是gfap阳性星形胶质细胞的示意图。图4是mbp阳性少突胶质细胞的示意图。图5是he常规染色的示意图。图6是fitc标记抗nse免疫荧光染色的示意图。具体实施方式实施例1。实施例1为动物实验。建立与临床相似的创伤性慢性期脊髓损伤大鼠模型，抽取大鼠自身脂肪制备间充质干细胞进行腰椎髓鞘内注射，术后采用改良标准bbb功能评分，术后6周进行组织学检查，采用心室灌注固定取材，常规染色和免疫荧光组织化学检查。形态计量分析，利用imageproplus图像分析软件计数，brdu和nse标记细胞，数据以x±s的形式表示，采用spss软件包进行t检验，x2检验。进而探索自体脂肪间充质干细胞(adsc)移植修复慢性期脊髓损伤的疗效、最佳剂量及其作用机制。实验方法如下：(1)动物模型制作使用45只大鼠随机分为移植组、模型组和对照组，每组15只。所有组以psi-ihimpactor制作大鼠脊髓t10挫裂伤模型。对移植组进行间充质干细胞注射治疗。对照组同一部位注射生理盐水。模型组不处理。(2)间充质干细胞注射治疗的方法。以慢性期sci大鼠为对象。(21)对大鼠进行抽脂手术，抽取2～5ml脂肪；(22)将抽取的脂肪提取脂肪间充质干细胞进行保存；(23)对大鼠进行脊髓损伤修复治疗；在腰椎髓鞘内注射治疗剂，每次用量为细胞量/生理盐水＝0.5×106/0.5ml，同时静脉滴注治疗剂，每次用量为细胞量/生理盐水＝0.5×107/20ml。(3)实验结果：(31)移植组免疫荧光分化鉴定。见图1～图4，图1～图4是fitc标记抗免疫荧光染色(×200)的示意图。其中：图1是nse阳性神经元的示意图。图2是nse阳性神经元的初级突起的示意图。如图1、图2所示，分化3天后，大量nse阳性锥形细胞出现，胞浆丰富，中心较大面积未着色，为细胞核占据，在图1和图2中可见神经元初级突起发出，较短。图3是gfap阳性星形胶质细胞的示意图。如图3所示，gfap阳性的星形胶质细胞胞体着色均匀，丰富的轴突紧密缠绕pga纤维(黄褐色自发荧光)，形成立体网络结构。图4是mbp阳性少突胶质细胞的示意图。如图4所示，也可发现mbp标记的少突胶质细胞出现，数量极少，胞体小，突起少而短小。(32)动物一般情况及功能评分：术后6周动物共存活28只，平均存活率为62.22％，各组间差异无统计学意义(p>0.05)。术后第1周，各组bbb评分均<2分，从第2周开始，移植组的恢复情况已明显优于模型组(p<0.01)和对照组(p<0.05)，对照组的恢复情况也优于模型组。(33)he常规染色。术后6周，移植组损伤区脊髓间连接紧密，无明显界限。图5是he常规染色的示意图(×200)。在图5中，移植组界面区无明显疤痕，箭头示锥形神经元，其中v：血管；h：脊髓。如图5所示，部分细胞已成三角形或锥形外观，有明确的突起发出。可见新生毛细血管形成，提示损伤部位血供良好。对照组也有各种细胞表型分化，梭形细胞为主。模型组损伤处成纤维细胞增生，胶原纤维增多。(34)免疫荧光组织化学检测。术后6周，移植组大量brdu标记细胞存活，细胞计数明显大于对照组(p<0.01)。图6是fitc标记抗nse免疫荧光染色的示意图(×200)。图6中箭头示出神经元及其轴突。如图6所示，该nse阳性细胞胞体较大，已经具有神经元典型的三角形外观，可见细胞发出长的神经纤维和突起，而在对照组，其神经元分化明显受到抑制，计数显著低于移植组(p<0.01)。虽然移植组有较多的星形胶质细胞成分，但界面区并未明确瘢痕，部分区域的损伤部位已经和健康区域形成神经纤维的紧密联系。对照组和模型组胶质细胞的密度较高，结构杂乱。所以结果表明，自体脂肪间充质干细胞对脊髓损伤的修复是安全有效的。实施例2。实施例2为临床实验。以下通过实验设计，进行自体脂肪间充质干细胞对脊髓损伤修复的安全性、耐受性及疗效的临床研究。1、患者纳入标准：(1)患者因各种原因经由医院诊断均为脊椎完全性截瘫，生活不能自理，二便失禁。(2)受试病人确认没有活动性肿瘤、没有活动性炎症、没有梅毒、艾滋病。(3)事先拍摄患病损伤部位的x片。(4)参与受试人员必须要完全理解知情同意书并且自愿签署，而且要配合参与全程随访评估。2、实验设计方案：病人为全脊椎任意段位完全或不完全损伤患者30名。(1)抽脂手术。病人先行进行抽脂手术，在后腰处抽取50ml脂肪。抽脂手术通过常规的、已知的抽脂手术方法进行。(2)损伤部位手术。手术团队行损伤部位蛛网膜下腔切开术，进行脊髓探查减压、脊髓粘连松解、椎管扩大成型，脊柱骨折内固定等手术，在手术进行同时，在实验室将脂肪通过酶消化法提取自体脂肪间充质干细胞并进行保存用于后续治疗。酶消化法在本领域属于已知的、常规的方法，在此不再赘述。(3)脊髓损伤修复治疗。对损伤部位手术一个月后，对患者进行脂肪干细胞腰椎髓鞘内等量置换注射治疗剂，每次用量为细胞量/生理盐水＝3×106/3ml，同时静脉滴注治疗剂，每次用量为细胞量/生理盐水＝4×107/100ml。治疗共进行八次，第一阶段四次，在第一次至第四次的治疗过程中，每相邻的两次治疗间隔两周。第二阶段四次，在第五次至第八次的治疗过程中，每相邻的两次治疗间隔一个月。第四次和第五次之间间隔两周。3、康复治疗。患者手术一个月后开始院内物理康复训练，三个月开始神经康复训练。从脊髓损伤修复治疗一个月后开始，对患者双下肢的膝关节以及髀关穴、阴市穴、风市穴、殷门穴、上巨虚穴、承山穴6个穴位每个月注射治疗剂，治疗剂用量为细胞量/生理盐水＝1×106/ml。用于加速恢复常年卧床造成的肌肉萎缩和关节退化。康复治疗的治疗剂注射一共8次。4、患者治疗后随访，并将随访结果记录在档案里。临床实验2016年3月启动，实验周期为2年。记录时间节点分别为术前、1个月、3个月、6个月、1年、2年，每次用asia评分标准进行疗效评价。评价结果见表1。表1患者编号术前1个月3个月6个月1年2年1bbbbcc2bbbbbc3bbbbbc4dddeee5bbbccc6cdddde7bbbbbc8aaaaab9cccddd10dddcce11cccddd12ddeeee13aaaabb14bbbbcc15dddeee16bbbbcc17bbbccc18aabbbc19cccddd20aabbbb21aaabbb22bbbccd23ddeeee24dddeee25aaabbb26aabbbc27ddeeee28dddeee29bbbbbc30cccddb如表1所示，30位患者的asia评分均在两年内有不同程度的改善。以上描述是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在不违背本发明的基本结构的情况下，本发明可以作任何形式的修改。当前第1页12