一种治疗肺纤维化的药物组合及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种治疗肺纤维化的药物组合及其制备方法和应用，属于药物技术领域。

背景技术：

肺间质纤维化(pulmonaryfibrosis，pf)发病机制不明，发病率逐年增加，致残致死率高，现代医学缺乏理想治疗手段，为世界性重大疑难疾病。中医药在该领域有一定优势，但局限于活血、补益类中药的研究，尚不能廓清作用机理，且临床疗效特别是晚期pf患者的疗效值得商榷。云南是中国最大的中草药资源宝库(6559种药物)，并拥有丰富的民族医药资源(26个民族)，并故应从中深入挖掘、研究，探寻行之有效的思路和方法。本项目选择具有云南民族医药特色的“滇龙血竭”对博来霉素(blm)诱导的实验性pf大鼠模型进行分期干预研究，动态评价相应指标，从“炎症暴发级联反应”角度探讨其作用机制，并为滇龙血竭早期干预防治pf提供理论和实验依据，可望发现云南民族医药资源中防治pf的新思路、新方法，具重要临床价值，有益于促进云南民族医药的健康发展。

pf是一组具有呼吸困难、干咳等相似症状，影像学示肺间质改变及肺功能呈限制损害的异质性疾病的总称。发病机制尚未完全阐明，主要包括上皮和内皮细胞的损伤、炎症细胞和炎症介质的产生、细胞因子的大量表达及纤维母细胞的激活等。其发病过程可概括为肺泡的免疫和炎症反应、肺实质损伤和受损伤肺泡修复(纤维化)3个环节。目前，肺纤维化的发病率在全球呈上升趋势，且所有慢性肺疾病的晚期都存在不同程度的纤维化改变。尤其是特发性肺纤维化(idiopathicpulmonaryfibrosis，ipf)从1991年到2003年间，ipf的发病率估计每年增长11％，中位生存期3-5年^[1]，被称为“慢性肺癌”，严重威胁着人类生命健康，引起医学界的广泛关注。本病目前尚缺乏有效的治疗手段，主要还是依靠传统的激素和免疫抑制剂，大多数药物的治疗机制也仅多局限在抗炎和抗氧自由基方面。但激素用于治疗ipf的效果仍然存有争议，其虽然应用普遍，但无前瞻性、随机、双盲、对照研究来评价其效果^[2]。免疫抑制剂在临床上只有大约15％-50％的患者对细胞毒药物有好的反应，加之长期应用副作用较大，目前对它们的临床疗效尚有争议。而由美国胸科学会(ats)、欧洲呼吸学会(ers)、日本呼吸学会(jrs)和拉丁美洲胸科学会(alat)共同颁布的《2011年ipf诊断和治疗循证新指南》^[1]中明确指出：强烈不推荐单用糖皮质激素及糖皮质激素联合应用免疫抑制剂，强烈推荐长期氧疗及肺移植(适合患者)。整个世界范围内，现代医学对于ipf为代表的肺间纤维化基本处于束手无策境地。因此，迫切需要寻求行之有效的治疗手段。

天龙竭是以香格里拉高山红景天和滇龙血竭组成的具有云南民族医药特色的中药复方。红景天为迪庆香格里拉藏区野生高山红景天，藏族习称为“索罗玛宝”，《神农本草经》称其为“火焰草”、“八宝草”。性平，味甘苦，归肺、心经。有培补宗气、益气活血、通脉平喘、健脑益智、滋补强身，被誉为“高原人参”。当地民族数百年来习以用来强壮身体，防治慢性肺病和高原缺氧。血竭(sanguisdraconis)又名麒麟竭，是一种传统名贵中药，始载于《唐本草》，基源为棕榈科植物麒麟血竭(dracaenadracoblume)或柬埔寨龙血树(dracaenacambodianapierre)的含脂木材经提取的树脂类药材^[15]。性味甘、温、咸、平，归心、肝经，有活血散瘀、定痛止血、生肌敛疮功效，有“活血之圣药”美誉(明·李时珍《本草纲目》卷34)，药源长期依靠进口。随着血竭资源日渐匮乏，20世纪70年代起，我国著名植物学家蔡希陶在云南孟连、沧源、勐腊等地发现了能够提供血竭资源的百合科植物剑叶龙血树[dracaenacochinchinensis(lour.)s.c.chen]，经过临床证实，其疗效与进口血竭基本一致。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，为缓解治愈肺纤维化，本发明提供一种治疗肺纤维化的药物组合配方及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种治疗肺纤维化的药物组合，由以下重量份的原料药组成：龙血竭3-9份，红景天15-45份。

进一步地，所述的药物组合还包括以下重量份的原料药：三七1-10份，地龙1-10份。

一种治疗肝纤维化的药物组合的制备方法，将药物组合混合后粉碎过20目筛混合→乙醇回流→合并滤液→浓缩→干燥得到药物组合。

一种治疗肺纤维化的中药组合物在制备治疗肺纤维化药物中的应用。

本发明中药物的药理作用为：本发明红景天选自香格里拉高山红景天(rhodiolacretinii(hamet)h.ohbasubsp.sino-alpina(frod.))h.ohba〕)，红景天主要为红景天苷、酪醇、多酚等生理活性物质。有显著抗缺氧作用，可提高机体缺氧耐力，调节hif-1α表达。红景天能够提高机体对低含氧环境的适应性，增强动物对缺氧和疲劳的耐力。最新研究发现红景天可促进低氧条件下内皮细胞hif-1α及vegf的表达，这可能是红景天抗缺氧和促血管新生作用的机制之一。同时红景天具有抑制血小板聚集、促纤溶酶、降血粘、促血栓溶解，改善血流变的作用。

龙血竭源自云南孟连产百合科植物剑叶龙血树[dracaenacochinchinensis(lour.)s.c.chen]的含脂木材提取的树脂，龙血竭含有黄酮类、皂甙类、酚类、酯类等成分。现代研究证实，龙血竭具有显著的抗炎止痛、抗菌、促进表皮修复、活血/止血双相调节、调节血管新生、抗氧自由基等药理作用。目前其临床运用广泛，特别是治疗冠心病、脑梗塞、消化道出血和妇科血症等方面取得了显著疗效。近年来有研究提示龙血竭能有效地减轻pf大鼠的纤维化程度，其机制可能与抑制炎症性肺损伤及通过抑制大鼠肺组织转化生长因子(tgf)-β1mrna的表达，阻止ⅰ型胶原蛋白过度沉积有关。提示其治疗本病的良好前景，值得进一步深入研究。

本发明的技术方案相对于现有技术的有益效果为：目前国内含龙血竭的中成药的质量标准多以龙血素b为主，包括《中国药典》(1995年版一部附录ⅵd测定)也有相关规定。但是龙血竭的主要成分为龙血素a(4’2羟基22,42二甲氧基二氢查耳酮)和b(4’2羟基22,4,62三甲氧基二氢查耳酮)。因两者结构上的相似性，导致了有关龙血素b的含量测定中混有龙血素a，而得出龙血素b含量较高的失实结论。近年来，有学者采用较高柱效的色谱柱对龙血竭样品进行分析时发现以往文献报道中的龙血素b对应色谱峰，实际上是由龙血素a和龙血素b两种物质共同产生的，而其中龙血素a的色谱峰较高，龙血素a的含量高于龙血素b五倍左右；测定龙血素b时因样品较浓对色谱柱污染较严重，而测定龙血素a时因样品较稀对色谱柱污染较小。而且因龙血素a不但含量比龙血素b高，紫外光谱同龙血素b相似，并且吸收强度比龙血素b高(灵敏度高)，因此在测龙血素b时受龙血素a的干扰比较大，而测龙血素a时受龙血素b的干扰就相对较小。所以，定量龙血素a比定量龙b血素更准确。

本发明中的红景天培补宗气，通脉平喘，为君药；龙血竭功擅活血化瘀，通络散结，为臣药。二药相伍，药精力专，攻补兼顾，共奏补益宗气，活血通络之功。正适肺间质纤维化(肺痿/痹)患者宗气亏虚，肺络瘀痹的状态(核心病机)。且本发明中药物组合配伍合理，经过药理学验证，使用安全，能够减轻肺纤维化患者的临床症状，并能改善肺纤维化程度，且临床应用未见不良反应。

附图说明

图1为本发明药物组合对肺纤维化大鼠模型血清中il-4水平的影响；

图2为本发明药物组合对肺纤维化大鼠模型ifn-γ水平的影响；

图3为本发明药物组合分期干预大鼠fizz1mrna及蛋白表达水平的影响；

图4为本发明药物组合对肺纤维化大鼠模型肝纤维化程度(masson染色和he染色结果)的影响；

具体实施方式

为了更好的说明本发明的实质，下面通过本发明药物组合的药理作用实验结果来进一步说明它的效果。

实施例1

取龙血竭3份，红景天15份，三七1份，地龙1份，将混合药物粉碎过20目筛混合→乙醇回流→合并滤液→浓缩→干燥得到药物组合。

实施例2

取龙血竭9份，红景天45份，三七10份，地龙10份，将混合药物粉碎过20目筛混合→乙醇回流→合并滤液→浓缩→干燥得到药物组合。

实施例3

取龙血竭6份，红景天30份，三七6份，地龙8份，将混合药物粉碎过20目筛混合→乙醇回流→合并滤液→浓缩→干燥得到药物组合。

实验方法

1.动物实验

1.1实验动物选择

选择雄性6周龄sprague-dawley大鼠，共96只，体重200～300g(spf级，正规动物号)，统一光照时间，恒温、恒湿，自由饮水，饲固体饲料(购于正规厂家)。

1.2动物分组及给药

实验用药选用实施例3中的方法制备得到的药物组合，取100个处方量制成干粉，分装高压灭菌，4℃保存。

适应性饲养1周后，随机分组、称重、编号，具体要求见表1。

表1大鼠分组及造模、给药、取材要点总表

注：模型对照组及龙血竭全程组各4个亚组，是为了达到全程动态观察的目的。

1.3动物造模

10％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔内注射麻醉，固定头和四肢，开口器固定口腔，拉出舌头，用压舌板压住舌腹，在额镜直视下，趁动物吸气瞬间迅速行气管插管，模型各组缓慢注入博来霉素(5mg/kg溶于0.9％氯化钠注射液0.3ml中)，空白对照组注入等量生理盐水。注药后立即将大鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3min使药液分布均匀。

1.4动物给药

大鼠给药剂量：参考人和动物体表面积折算的等效剂量比率表，取等效量给药，均以蒸馏水溶为3ml，从制模第2天开始定时灌胃(9-10am)，每日1次，各组给药内容及时段安排参见表1。

1.5相关指标检测

常规观测大鼠形态、体重变化：观察造模组与空白组大鼠形态变化，包括：皮毛色泽、神态、活动度、粪便、饮食等情况；测量大鼠体重：分别在造模前、造模后第7d、14d、21d、28d于同一时段，电子天平称重。

各组大鼠取材时点安排参见表1，10％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔内注射麻醉，固定头和四肢，打开腹腔，腹主动脉采血，高速离心后取上层血清置于-80℃冰箱保存；开胸后向肺动脉内注入4℃生理盐水，洗出肺内血液，剪去肺门，滤纸吸去表面水分，截取双肺组织，取右下肺做组织匀浆；左肺组织置于10％中性缓冲福尔马林溶液中(ph7.4)固定，取左下肺组织最大横径处切0.3cm厚组织块，经常规脱水、二甲苯透明，用自动石蜡包埋机包埋，自动切片机4μm切片备用。

(1)血清il–4/ifn-γ含量测定：以ellsa法检测，以酶联接免疫吸附剂测定(ellsa)法检测血清中的il–4、ifn–γ的含量。

(2)肺组织中fizz1的蛋白表达：以免疫组化(sabc)技术检测，以免疫组织化学(sabc)技术检测pf大鼠肺组织中fizz1的蛋白表达；以逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)技术检测pf大鼠肺组织中fizz1mrna表达。

(3)评估肺组织胶原蛋白的含量，判断pf的程度，胶原蛋白是器官纤维化时细胞外基质(extracellularmatrixecm)的主要成分，羟脯氨酸(hydroxyproline，hyp)是胶原蛋白的一种特有的氨基酸，几乎所有hyp都存在于胶原蛋白中(少量存在于弹性蛋白)，因此组织中hyp含量能反映器官纤维化的程度。hyp在氧化剂的作用下所得产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，利用这种特性通过比色法测定其呈色深浅测定其含量。

(4)肺组织中羟脯氨酸(hyp)含量测定：用比色法测定肺组织匀浆中hyp含量，对肺组织进行he染色、masson三联染色，按schissel标准进行分级积分

(5)病理形态学定量分析：取石蜡切片，60℃烤2h，二甲苯脱蜡，酒精梯度脱水后，常规he染色、masson三联染色。按schissel标准对肺泡炎和肺纤维化进行分级评分，分析结果如表2

表2肺泡炎和肺纤维化分级及积分标准

实验例1(il–4含量的影响)

表1血清中il-4的含量

与空白对照组比较：*:p<0.05，**p<0.01；与同时间模型空白组比较：^#:p<0.05，^##:p<0.01；与阳性对照组比较：^△:p<0.05，^△△:p<0.01。

结果如图1示：il-4水平：与a组比较，各造模组大鼠表达水平均有不同程度升高，以模型空白对照组最为显著(p<0.01)；与模型空白对照组相比较，各药物干预组可不同程度降低pf大鼠血清il-4水平(p<0.01或p<0.05)，与b4组比较，c4、d、f组均可不同程度下调其表达水平(p<0.01或p<0.05)，以c4组最为显著(p<0.01)，而e组无统计学差异(p>0.05)；与f组比较，e组有显著差异(p<0.05)，c4、d组无统计学差异(p>0.05)；滇龙血竭可降低pf大鼠血清il-4的水平，其中尤以滇龙血竭28天全程干预组为显著。

实验例2(ifn-γ含量的影响)

表2ifn-γ含量

与空白对照组比较：*:p<0.05，**p<0.01；与同时间模型空白组比较：^#:p<0.05，^##:p<0.01；与阳性对照组比较：^△:p<0.05，^△△:p<0.01。

结果如图2示：ifn-γ水平：与a组比较，各造模组大鼠表达水平均有不同程度降低，以模型空白对照组最为显著(p<0.01)；与模型空白对照组比较，各药物干预组可不同程度提高pf大鼠血清ifn-γ的水平(p<0.01或p<0.05)，与b4组比较，c4、d1、f组均可不同程度下调其表达水平(p<0.01)，以c4组最为显著(p<0.01)，而e组无统计学差异；与f组比较，e组有非常显著差异(p<0.01)，而c4、d组无统计学差异(p>0.05)；滇龙血竭可升高pf大鼠血清ifn-γ的水平，以滇龙血竭28天全程干预组为显著。

实验例3(fizz1蛋白及mrna表达水平的影响)

表3滇龙血竭对肺纤维化大鼠fizz1蛋白及mrna表达水平的影响

与空白对照组比较：*:p<0.05，**p<0.01；与同时间模型空白组比较：^#:p<0.05，^##:p<0.01；与阳性对照组比较：^△:p<0.05，^△△:p<0.01。

结果如图3示：(1)fizz1mrna的表达：与a组比较，各造模组大鼠表达水平均有不同程度增强，以模型空白对照组最为显著(p<0.01)；与模型空白对照组比较，各药物干预组可不同程度降低pf大鼠fizz1mrna水平(p<0.01或p<0.05)，与b4组比较，c4、d1、e、f组均可不同程度下调其表达水平(p<0.01或p<0.05)，以c4组最为显著(p<0.01)；与f组比较，c4、d组无显著差异(p>0.05)，e组有显著差异(p<0.05)；滇龙血竭各组以时间以来方式下调fizz1mrna表达，以滇龙血竭28天全程干预组最为显著。(2)fizz1蛋白的表达：与a组，各造模组大鼠fizz1蛋白表达水平均有不同程度增强，模型空白对照组增加最为显著(p<0.01)；滇龙血竭和吡非尼酮能抑制pf大鼠fizz1蛋白表达水平，与模型空白对照组比较，c4、d1、d2、e组均可不同程度下调其表达水平(p<0.01或p<0.05)，以c4组最为显著(p<0.01)，而e组无显著差异(p>0.05)；与f组比较，c4、d组无显著差异(p>0.05)，e组有非常显著差异(p<0.01)；滇龙血竭各组以时间依赖方式下调fizz1表达，以滇龙血竭28天全程干预组最为显著。

实验例5(肺组织病理学)

he染色及masson染色结果如下表4和图4所示：

表4各组大鼠肺泡炎及纤维化情况

结果如图4所示：空白对照组：肺内结构较清晰，支气管、肺泡以及肺泡间隔组织结构无异常，肺泡间隔无增厚、水肿、炎症及纤维化的表现，肺泡腔无渗出。

模型空白组：第7天时，肺毛细血管呈现充血，肺泡间隔可见增宽，并且伴随着肺泡炎表现，可见巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润，肺泡腔内分泌物增多并伴有轻度出血，还可见少量成纤维细胞增殖；第14天时，肺泡炎仍旧突出但较前略有减轻，肺泡间隔仍增宽，肺间质成纤维细胞增多，胶原纤维增多，间质胶原纤维增生呈带状，开始呈现出纤维化。第21天时，肺泡炎症较前减轻，肺泡结构开始出现受损，肺泡壁开始增厚，肺间质内胶原纤维沉积，纤维组织逐渐形成。第28天时，肺组织以纤维化病变为主，炎症程度较前明显减轻，肺泡结构受损，肺泡壁显著增厚，肺泡腔缩小，部分肺泡出现塌陷或融合，肺泡腔内可见脱落的肺泡上皮以及蛋白渗出液，肺间质内大量胶原纤维沉积，纤维组织呈条索、斑片状分布，形成弥漫性肺纤维化。

龙血竭干预组：龙血竭全程干预组各时间点肺泡炎以及肺纤维化程度较同时间模型空白组相比显著减轻，第7天时，肺组织炎性细胞浸润区域，与模型组相比显著减少，第14天时，出现轻中度肺泡炎改变，病变程度与同期模型空白组相比明显减轻，肺组织结构比较完整，成纤维细胞增殖明显减轻，第21天时，各组出现轻度肺纤维化改变，病变范围局限。第28天时，肺纤维化程度加重，病变范围较21天时稍有扩大，胸膜以及肺泡间隔胶原纤维沉积出现束状分布；龙血竭早期干预组与龙血竭晚期干预组相比肺泡炎、肺纤维化程度较轻。

吡非尼酮组：肺泡炎以及肺纤维化程度较模型空白对照组相比减轻，第28天时出现轻中度肺纤维化改变，病变范围较局限，胸膜及肺泡间隔胶原纤维沉积呈束状分布，肺泡炎及肺纤维化情况。

综上所述，本发明的药物组合可以抑制并减轻肺纤维化水平。

最后，需要说明的是，本发明保护范围不仅仅局限于上述实施例，上述实施例只是为了帮助解释和说明本发明，而不是对本发明的保护范围进行限制，凡在本发明的精神和原则之内，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。