瑞香素改善衰老相关认知能力衰退的药物应用的制作方法

本发明涉及药物领域，特别是瑞香素在制备改善认知能力、防治老年痴呆病的药物中的应用。

背景技术：

瑞香素(Daphnetin)，又名祖师麻甲素，化学名7，8-二羟基香豆素(7,8-dihydroxycoumarin)，是我国自主研发的天然药物之一。瑞香素是从瑞香属植物长白瑞香(Daphne Korean Nakai)中提取出来的有效成分，是香豆素类化合物的代表性单体成分。目前，瑞香素的临床用途用于治疗血栓闭塞性脉管炎及其他闭塞性血管疾病和冠心病的辅助治疗。

近期，发明人的研究首次证明了瑞香素可通过降低阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠病理发生早期脑内β-淀粉样蛋白(Aβ)水平，改善小鼠认知功能损伤，提升学习记忆能力。对以Aβ沉积、tau蛋白异常磷酸化为典型病理特征的老年痴呆病(如阿尔茨海默病)，可能具有在疾病早期延缓病理发生，缓解认知损伤的作用，对其他蛋白异常沉积相关疾病如帕金森病、衰老相关的认知能力减退和神经退行性变化可能具有改善效应。

AD是老年痴呆症中的一种主要类型，占痴呆症总人数的60-70％，是老年人中发病率最高的神经退行性疾病。患者主要表现为渐进性记忆丧失，认知功能障碍，人格改变及语言功能障碍等。β-淀粉样蛋白(Aβ)在脑内沉积和逐步蔓延是AD一系列病理生理改变的主要标志，与神经细胞线粒体功能损伤、tau蛋白过度磷酸化、神经肌细胞炎性激活、神经元或突触丢失等病理过程密切相关。在AD病理发生初期，有效抑制或清除Aβ沉积，改善神经细胞代谢，是预防AD发生和缓解AD认知功能减退的重要防治策略。

老年痴呆病是影响我国老年人口健康的主要神经退行性疾病之一。从全球范围来看，老年痴呆病的预防和治疗缺乏有效治疗药物，亟待发现有效防治药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于瑞香素在保健食品领域、化妆品和生物医药领域中用于改善衰老相关的学习记忆能力，特别是老年痴呆病的早期预防与治疗。

本发明一个方面提供了瑞香素在制备预防或治疗由于脑内β-淀粉样蛋白增多导致的疾病的药物中的用途。

本发明另一个方面提供了瑞香素在作为脑内β-淀粉样蛋白的抑制剂的用途。

本发明再一个方面提供了瑞香素在预防或治疗认知性障碍，优选地，所述的认知性障碍为阿尔兹海默氏病、帕金森病的药物中的用途。

本发明再一个方面提供一种降低β-淀粉样蛋白水平的药物组合物，其中以瑞香素作为唯一活性成分。

本发明再一个方面提供一种预防或治疗认知性障碍的药物组合物，其中以瑞香素作为唯一活性成分。

本发明再一个方面提供了一种预防和治疗蛋白异常沉积病变，如增龄过程中抑制老年斑等斑块形成的组合物用途，其中以瑞香素作为唯一活性成分。

在本发明的技术方案中，所述的瑞香素为7，8-二羟基香豆素(7,8-dihydroxycoumarin)，具体结构式如下：

瑞香素摄入后可快速通过血脑屏障，改善中枢和外周组织代谢紊乱，抑制脑内Aβ沉积，从而达到改善学习记忆能力、改善认知损伤的目的。

本发明所采用的技术方案是：瑞香素在防治与衰老相关学习记忆能力衰退的保健食品、化妆品和药物中的应用，其特征在于瑞香素或瑞香素衍生物为主要效应成分，或含有瑞香素或瑞香素衍生物的植物提取物，以不同剂型服用和敷用后，能够改善认知功能，对衰老相关的学习记忆能力降低、老年痴呆病的早期预防和认知功能障碍、斑块形成具有缓解作用。

附图说明

采用阿尔兹海默病转基因小鼠模型-APP/PS1转基因模型小鼠。该转基因小鼠脑内过表达人Aβ前体蛋白APP，以及早老素基因PS1的双转基因模型小鼠，能够模拟人类AD发生中Aβ沉积和认知功能退变等典型病理及神经功能症状。分别采用水迷宫实验观察瑞香素对小鼠认知功能的改善作用，采用ELISA方法检测脑内Aβ40和Aβ42的含量，观察瑞香素对小鼠蛋白异常沉积的改善效应。

图1，采用阿尔兹海默病转基因小鼠模型-APP/PS1转基因模型小鼠。该转基因小鼠脑内过表达人Aβ前体蛋白APP，以及早老素基因PS1的双转基因模型小鼠，能够模拟人类AD发生中Aβ沉积和认知功能退变等典型病理及神经功能症状。采用水迷宫实验观察瑞香素对小鼠认知功能的改善作用。水迷宫共进行5天。图1A，水迷宫训练中各组小鼠找到平台的时间，图1B，训练过程中各组小鼠找到平台的路程，其中:横坐标为小鼠训练的天数，纵坐标分别为小鼠找到平台的时间和路程；图1C，水迷宫训练中，各组小鼠潜伏时间的曲线下面积(Area under curve,AUC)，其中:横坐标为小鼠的种类，纵坐标为小鼠潜伏时间的曲线下面积。

图2，采用阿尔兹海默病转基因小鼠模型APP/PS1，检测脑内Aβ40和Aβ42的含量，观察瑞香素对病理性蛋白沉积和斑块形成的改善效应。图2A显示，瑞香素可降低阿尔兹海默病小鼠模型脑内Aβ40的水平。图2B显示，瑞香素可降低阿尔兹海默病小鼠模型脑内Aβ42的水平。其中:横坐标为小鼠的种类，纵坐标分别为小鼠皮层组织中Aβ40和Aβ42的含量。

具体实施方式

1.实验材料

瑞香素从南京普仪生物科技有限公司购买；ELISA检测Aβ40和Aβ42试剂盒从Invitrogen公司购买。

2.实验动物饲养及模型建立

APP/PS1转基因模型小鼠，是在小鼠脑内过表达人Aβ前体蛋白APP，以及早老素基因PS1的双转基因模型小鼠，能够模拟人类AD发生中Aβ沉积和认知功能退变等典型病理及神经功能症状。该小鼠模型和对照小鼠购自南京大学模式动物中心(3月龄)。所有小鼠喂养在温度为23-25℃，湿度为60％，12h/12h昼夜的环境中。在整个实验的过程中，小鼠可以自由获取饲料和饮水。

实验小鼠在饲养环境适应1个月后，一共分为四组。四组分别为：1)灌胃ddH2O的野生型WT小鼠组(WT组)，11只；2)灌胃100mg/kg/day瑞香素的野生型WT小鼠组(WT+Daphnetin组)，12只；3)灌胃ddH2O的APP/PS1小鼠组(AD组)，15只；4)灌胃100mg/kg/day瑞香素的APP/PS1小鼠组，(AD+Daphnetin组)，14只。实验周期为12个月。

实施例1小鼠水迷宫实验

阿尔兹海默病模型小鼠灌胃瑞香素9个月，同时对应实验组的小鼠也进行蒸馏水或瑞香素，之后进行水迷宫实验。

Morris水迷宫(Morris water maze)实验是测试小鼠空间学习与记忆能力的经典方法。测试方法如下：在直径为120cm圆形泳池中进行，泳池分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ共4个象限，其中第Ⅳ象限中心区域放置一个直径为7.5cm的小圆台，圆台浸没在水面以下1cm处。泳池周围的围帘支架上对于4个象限分别放置4个不同形状的标记物作为视觉线索。整个实验过程中，水温保持在25℃，周围保持安静，用围帘将泳池与外部环境隔绝。正式测试的前一天，让每只小鼠在泳池中自由游泳60s，以适应游泳环境。在接下来的5天中，将被试小鼠放置在泳池的四个不同的象限中，置于池顶的摄像机记录小鼠找到泳池中隐藏平台的轨迹。在前5天的连续训练中，如果小鼠在120s内找不到平台，它们将被人为引导至平台，并在平台上停留30s。摄像机视频跟踪系统记录的小鼠游向平台的时间和距离应用于分析小鼠的学习记忆能力。

实验结果：通过统计分析，结果以Mean±S.E.M形式表示；数据分析使用多因素方差分析方法。显著统计学意义为*:WT+H2O VS AD+H2O，P<0.05,**P<0.01，****p<0.0001；#:AD+H2O VS AD+Daphnetin，P<0.05；$:AD+H2O VS WT+Daphnetin，P<0.05,$$P<0.01。

图1A显示小鼠在水迷宫实验训练过程中，在第5天时，AD+Daphnetin小鼠水迷宫潜伏时间相对于AD+ddH2O小鼠显著缩短；图1B显示水迷宫实验中，第4,5天时，AD+Daphnetin小鼠找到平台的路程相对于AD+ddH2O小鼠明显缩短。图1C潜伏时间曲线下面积显示AD小鼠相对于AD+Daphnetin游水时间的AUC显著增长。以上的行为学结果证明瑞香素可改善AD模型小鼠的学习和空间记忆能力，提示瑞香素可用于改善神经退行性疾病中认知功能的减退。

实施例2脑组织内可溶性β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)检测

实施例1的水迷宫实验结束后1周，处死小鼠，取出小鼠大脑皮层组织，进行脑组织内可溶性β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)检测。

Aβ斑块是阿尔兹海默病显著的病理学特征，在产生Aβ途径中，Aβ40和Aβ42最常见；因此针对大脑皮层中可溶性Aβ40和Aβ42的含量进行检测，使用的检查方法为ELISA方法。

首先，使用(5mol/L盐酸胍/50mmolTris HCl)的胍盐缓冲液将皮层组织进行匀浆，组织匀浆液在4℃，10000g离心10分钟，取上清液进行测定。将50μL已知的人Aβ40或Aβ42标准品和待测脑组织匀浆样品加入预先用Aβ抗体的包被的96孔板中，37℃孵育30分钟。然后向每个孔中加入50μL人Aβ40或Aβ42检测抗体溶液，孵育60分钟。随后，吸去溶液，使用1X洗脱液(wash buffer)清洗4次，再加100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔抗体，孵育30分钟，随后吸去溶液，再次使用1X洗脱液清洗4次。然后，加入100μL显色液(Stabilized chromogen)避光条件下反应30分钟。最后，加入100μL终止液终止反应。通过FlexStage3酶标仪测量波长450nm处的吸光度(OD450)。BCA方法进行蛋白定量用于ELISA的蛋白标定，检测结果分别表示为pgAβ40或Aβ42/mg蛋白。

实验结果：通过统计分析，结果以Mean±S.E.M形式表示；数据分析使用多因素方差分析方法。显著统计学意义为*:WT+H2O VS AD+H2O，P<0.05,**P<0.01，****p<0.0001；#:AD+H2O VS AD+Daphnetin，P<0.05；$:AD+H2O VS WT+Daphnetin，P<0.05,$$P<0.01。

图2A显示AD+Daphnetin小鼠大脑皮层组织中Aβ40的水平相比AD+ddH2O小鼠显著减少。图2B显示AD+Daphnetin小鼠大脑皮层组织中Aβ42的水平相比AD+ddH2O小鼠也明显减少。以上实验结果证明，瑞香素可降低小鼠脑中可溶性Aβ40和Aβ42的水平，减少Aβ的沉积，提示瑞香素具有改善阿尔兹海默病及衰老进程中Aβ等斑块形成的作用。

瑞香素为一种单分子化合物，已在临床用药多年，药物的药理、毒理特性较为明确。我们的研究证明，该药可能具有新的药理效应，即防治和改善衰老相关认知功能退变，以及防治老年痴呆病、改善病理性斑块沉积的新型药理效应，为瑞香素的临床应用和衰老相关神经退行性疾病的防治开辟新的治疗方案。