牛蒡子苷元在制备特异性杀伤耐阿霉素肝癌细胞的药物中的应用的制作方法

本发明涉及癌症药物技术领域，尤其涉及牛蒡子苷元在制备特异性杀伤耐阿霉素肝癌细胞的药物中的应用。

背景技术：

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第六大常见癌症，也是全球癌症死亡率的第二大常见原因。目前临床上存在多种治疗肝细胞癌的疗法，但并非普遍适用于所有患者的治疗。手术切除为目前临床上HCC治疗的主要措施，尽管接受肝切除治疗的患者总体存活率增加，但大多数患者在切除后的前2年内复发HCC。且因为肿瘤大小，位置或患者肝功能差等多种因素，临床上许多HCC不适合手术切除，因而药物治疗占据非常中药的地位。然而近年来肝癌的化疗进展不大，可能与多药耐药基因(MDR)不无关系。目前常用顺铂、5-氟尿嘧啶、多柔比星(阿霉素)进行化疗，肝动脉内效果较为肯定，而全身用药效果极微。但目前使用化疗药物治疗肝癌等肿瘤时普遍存在长期用药后肿瘤细胞耐药的问题，临床上常采用联合用药的方案来减缓耐药现象的出现，但仍不能完全避免。

牛蒡子(FructusArctii)，来源为菊科牛蒡属牛蒡(Arctium lappa L.)的干燥成熟果实，在我国广泛分布于多个省份，自然资源较为丰富，其中东北产的牛蒡子质量较佳。其主要化学成分有木脂素类，萜类和挥发油。传统中医理论研究表明，牛蒡子具疏散风热和解毒消肿的功效。现代药理研究表明，牛蒡子具降血糖、抗病毒和保肝的作用，其中发挥作用的成分是牛蒡子苷元(arctigenin，ARG)。牛蒡子苷元的分子式为C21H24O6，分子量372.41，CAS号为：7770-78-7，结构式如式I所示，具有抗炎，抗结肠炎，抗癌，保护血管和保护记忆等多种作用。

技术实现要素：

本发明为了克服现有耐药的肝癌细胞治疗效果不佳的缺陷，提供了牛蒡子苷元在制备特异性杀伤耐阿霉素肝癌细胞的药物中的应用，牛蒡子苷元能特异性杀伤耐阿霉素肝癌细胞，并且对正常肝癌细胞友好，是理想的耐阿霉素肝癌细胞的治疗药物。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了牛蒡子苷元在制备特异性杀伤耐阿霉素肝癌细胞的药物中的应用。

优选的，牛蒡子苷元为所述药物中的唯一有效成分。

优选的，所述药物的剂型包括片剂、口服液、颗粒剂、粉剂、注射剂和栓剂。

优选的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选的，所述药物中，牛蒡子苷元的质量百分含量为1～99％。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

而与复方方剂相比，天然植物单体具有成分结构清楚，易于研究，活性更强等特点，更符合现代医学精准医疗和靶向治疗观点。因此，发明人对75种清热解毒类天然植物提取物进行筛选研究。实验结果表明，与其他74类中药单体相比，牛蒡子苷元能特异性地杀伤耐阿霉素的肝癌细胞HepG2(R⁺HepG2)，对普通HepG2细胞以及其它类型的肿瘤细胞均无杀伤作用，而且在相同的药物浓度下其对永生化的人正常肝细胞LO-2没有影响，表明牛蒡子苷元是一类对肝脏友好的抗癌中药单体。

附图说明

图1为CCK-8细胞活性检测原理及WST-8与甲臜结构图；

图2为CCK-8细胞活性检测方法的操作步骤示意图；

图3为实施例1中牛蒡子苷元作用多种肿瘤细胞24小时效果图；

图4为实施例1中牛蒡子苷元作用多种肿瘤细胞48小时效果图；

图5为对比例中沙蟾蜍精作用多种肿瘤细胞24小时效果图；

图6为对比例中沙蟾蜍精作用多种肿瘤细胞48小时效果图。

具体实施方式

本发明提供了牛蒡子苷元在制备特异性杀伤耐阿霉素肝癌细胞的药物中的应用。如本发明实施例记载的实验表明，牛蒡子苷元对于普通肝癌细胞HepG2、Hep3B、Huh-7，肺癌细胞A549、耐吉西他滨的A549(G+A549)，结肠癌细胞SW620、CaCO2、SW480、RKO，胃癌细胞AGS、SGC7901，乳腺癌细胞MDA-MB-231，前列腺癌细胞PC3等均无明显杀伤作用，并且对正常人肝细胞LO-2无明显杀伤作用，只特异性杀伤耐阿霉素肝癌细胞，是一种特异性强、对人体干细胞友好的抗耐阿霉素肝癌细胞的有效物质。

在本发明中，牛蒡子苷元优选的为所述药物中的唯一有效成分。在本发明中，所述牛蒡子苷元也可以与其他有效物质进行复配制备特异性杀伤耐阿霉素肝癌细胞的药物。

在本发明中，所述药物的剂型包括但不限于片剂、口服液、颗粒剂、粉剂、注射剂和栓剂。本发明对所述药物剂型的制备方法无特殊限定，本领域已知的药物剂型均在本发明的保护范围内。

在本发明中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。本发明优选的所述药物中，牛蒡子苷元的质量百分含量为1～99％；更优选为10～50％。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实验采用CCK-8法(Cell CountingKit-8)检测牛蒡子苷元对细胞增殖及毒性的影响，其原理为：

如图1所示，该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-MethoxyPMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪检测450nm波长处的OD值，根据OD值间接反映活细胞的数量。因此可利用这一特性进行细胞增殖和毒性分析。

本实验具体操作如下：(以R⁺HepG2为例，其余类型肿瘤细胞亦同)

(1)铺板：取生长状况良好的R⁺HepG2细胞，使用含0.25％EDTA的胰酶消化细胞并重悬成浓度均匀的细胞悬液，用改良牛鲍计数板计数，用含10％胎牛血清的含1.2μM阿霉素的高糖DMEM培养基将细胞稀释成3×10⁴个/ml的细胞悬液。往96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液100μl，即确定每孔含细胞3000个；每组设置五个复孔，置于含5％CO2和37℃的细胞培养箱中培养24小时。

(2)加药：观察细胞，待细胞完全贴壁后，吸弃旧培养基，用细胞培养基将牛蒡子苷元稀释成40μM、20μM、10μM、5μM、0μM，用含上述浓度药物的培养基作用细胞，然后置于细胞培养箱中分别培养24小时和48小时。检测不同药物作用时间对细胞的影响。

(3)反应：药物反应时间到后，吸弃含药的旧培养基，配置CCK-8反应液：CCK-8母液和培养基以1:9比例配成CCK8工作液，新鲜配制后尽快使用。每孔加入100μl CCK-8工作液，培养箱孵育2小时。

(4)上机：培养箱孵育完毕后，使用多功能全波长酶标仪测定450nm波长时各孔的吸光度值A450nm。(可依据实验目的不同适当增减铺板的细胞数以及每次CCK-8实验的间隔时间和CCK-8工作液的反应时间)

(5)统计分析：剔除每组细胞中A450nm的最大值和最小值，剩下的三个复孔A450nm值取平均值作为平行孔的平均OD值，本次实验属于统计学计量资料，各实验数据以均值(mean)±标准差(SD)表示。细胞存活率与吸光度值呈正比。此实验需要重复三次。细胞生长抑制率计算公式：

生长抑制率＝[1-(实验组OD值-空白对照组)/(阴性对照组OD值-空白对照组)]×100％；

用GraphpadPrism 6.0软件统计分析结果并计算IC50，本次实验数据是计量资料因此采用统计学方法，是单因素方差分析，P﹤0.05即可认为差异有比较显著的统计学意义。

按照上述步骤分别对牛蒡子苷元对耐阿霉素人肝癌细胞R⁺HepG2，普通的肝癌细胞HepG2、Hep3B、Huh-7，肺癌细胞A549、耐吉西他滨的A549(G⁺A549)，结直肠癌细胞SW620、CaCO2、SW480、RKO，胃癌细胞AGS、SGC7901，乳腺癌细胞MDA-MB-231，前列腺癌细胞PC3进行细胞增殖及毒性的分析，验证牛蒡子苷元作用R⁺HepG2的特异性。

实验结果如图1和图2所示：牛蒡子苷元可以特异性杀伤R⁺HepG2，而对上述的其它类型的肿瘤细胞和LO-2均无明显杀伤作用。

对比例

按照实施例1所示的方式检测沙蟾蜍精(也称沙蟾毒精)对耐阿霉素人肝癌细胞R⁺HepG2，普通的肝癌细胞HepG2、Hep3B、Huh-7，肺癌细胞A549、耐吉西他滨的A549(G⁺A549)，结直肠癌细胞SW620、CaCO2、SW480、RKO，胃癌细胞AGS、SGC7901，乳腺癌细胞MDA-MB-231，前列腺癌细胞PC3的细胞增殖及毒性。

结果如图3、4所示，结果显示其沙蟾蜍精对肿瘤细胞及人正常肝细胞的作用没有选择性。

以上结果可以初步表明本发明已找到一种可特异杀伤耐阿霉素肝癌细胞R+HepG2的中药单体，后续将增加肿瘤细胞的类型和开展动物实验继续验证其特异性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。