用于双动力协同治疗的上转换纳米复合材料、制备方法及应用与流程

本发明属于纳米生物材料技术领域，具体涉及一种用于双动力协同治疗上转换纳米复合材料及其制备方法与应用。

背景技术：

近些年来，癌症已经成为危害人类健康的主要疾病之一。生物成像作为癌症诊断的主要方式之一，也逐渐成为人们研究的热点。相对于其他成像技术，生物光学成像具有操作简便、直观易接受、信号强度和成本相对低廉等优点，在各类疾病的诊断和治疗方面具有广阔的前景。其中，稀土上转换发光纳米材料由于其独特的发光特性，更加引起了人们的广泛关注。这是由于其可采用近红外光激发，发出紫外、可见和近红外光，是一种反stokes发光过程。而近红外光作为激发光源几乎对生物组织无任何损伤，有望实现厘米级别的组织穿透深度并且不会引起背景荧光。上转换纳米材料作为一种新型成像剂，在一系列生物成像领域得到了广泛的应用，如：细胞成像、小动物活体成像、磁共振成像(mri)等。

针对目前临床上癌症的诊断和治疗相互独立，治疗周期长，费用高，化学治疗、放射治疗、手术治疗等治疗手段副作用大等问题，将成像和治疗相结合，制备诊疗一体化的多功能纳米材料则成为癌症发展的新方向。

现有技术中，已有报道的基于上转换纳米材料和pdt/cdt试剂的复合材料，大多是单独将一种pdt/cdt试剂与上转换纳米材料复合，这种结合所获得的上转换纳米粒子激发的效果有限，且治疗效果存在较大的局限性。其中，pdt为光动力治疗的缩写，cdt为化学动力学疗法的缩写。

磁共振成像(mri)是当今医学中最受推崇的无损伤、高分辨率以及高灵活性的诊断技术之一,磁共振成像造影剂在临床诊断中正起着愈来愈重要的作用。以光敏剂为核心的光动力治疗pdt是近期发展起来的一种选择性破坏、毒副作用小的治疗肿瘤新方法,在临床治疗癌症方面被认为是避免外科手术的良好选择。鉴于两者明显的应用优势和发展前景，如果能够研究出能兼具磁共振成像造影剂和光动力治疗用光敏剂双重功能的新一类试剂,可有力地促进二者的诊-治结合，并有可能为肿瘤的诊治带来革命性的变化。

光动力治疗(pdt)是以光、光敏剂和氧的相互作用为基础进行疾病的诊断和治疗的一种新技术，其基本原理是在特定波长及强度的光照下，光敏剂分子被激发至激发态并将其能量传递至周围的氧分子，从而产生单线态氧(¹o2)或自由基等反应活性氧物质(ros)，并由此造成组织器官损伤破坏目标组织进而达到治疗的目的。与传统的癌症治疗手段包括手术、化学治疗和放射治疗相比，光动力治疗(pdt)具有创伤小、毒性低、选择性好、精度高、可重复治疗和可协同手术等显著优势。

目前，相比于传统的癌症治疗手段(放疗、化疗等)对人体伤害较大的危害，光动力疗法(pdt)则是一种非侵入性和温和的医学技术，特别是在抗癌治疗中，可以利用适当的光敏剂在特定波长下照射时产生活性氧(ros)，达到杀死癌细胞的功效。而pdt作为一种新兴且有前途的癌症治疗方式，还可用于改善其他传统抗癌疗法的缺点。

然而，一些未解决的挑战严重阻碍了pdt的进一步临床应用：首先，常规使用的有机光敏剂具有低水溶性和低稳定性，在生理环境中溶解性较差，因此容易发生严重团聚，这常常对正常组织产生高毒性；其次，其光敏化效率低，导致光动力效率低，治疗效果受限。最后，紫外-可见光的低穿透深度导致无法到达深部病理组织或器官，只能用于很浅的表皮层和光子能够到达的部位的治疗。因此，需要开发其他的创新方法及材料来提高治疗效率。

而化学动力学疗法(cdt)则可能是提高pdt效率的一种好方法，特别是可以与光敏剂互相促进，可以实现肿瘤微环境中的两种治疗方法。

现有技术中，中国专利申请号201410826953.3的文献，公开了一种应用于光动力治疗的纳米复合材料及其制备方法，其是采用au25修饰ucnps@sio2制得纳米颗粒，使该纳米颗粒的光动力性能有了显著提高。本发明制备了一类均匀、单分散、尺寸可控(50-100nm)、介孔sio2包覆上转换纳米颗粒核壳结构的纳米载体,并且通过适当的吸附方法将光敏剂药物分子au25(capt)18-(au25)连接到介孔sio2骨架中构筑多功能的复合材料，采用该种材料以解决光动力治疗(pdt)现在存在的问题。但是其先是需要采用高温热解法制备nagdf4:20％yb/1％er(ucnps)，再采用连续包覆法制备ucnps，再合成核壳结构的ucnps@sio2纳米材料，再合成au25，最后用ucnps@sio2纳米颗粒修饰au25，整个工艺过程操作复杂，要求的条件高。

因此，开发一种新的可同时满足临床诊疗一体化即荧光成像、磁共振成像、双动力协同的上转换纳米复合材料，并且使其突破现有的治疗局限、实现双动力协同治疗、以大幅提高其疗效，是非常有意义的。

技术实现要素：

本发明是针对现有技术的不足，提供一种用于双动力协同治疗和诊疗一体化的上转换纳米复合材料的制备方法，其采用在上转换纳米材料的侧面生长并共价连接两种不同二维材料的方法制得上转换纳米复合材料，步骤少、操作简便，反应温和，常温下即可完成，有利于批量生产。

本发明还提供一种用于双动力协同治疗和诊疗一体化的上转换纳米复合材料与应用，该材料复合两种不同的治疗试剂，纳米材料尺寸较小、结构稳定，具有良好的生物相容性，大幅提高了其疗效，可同时满足临床诊疗一体化即荧光成像、磁共振成像、双动力协同治疗的需要。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于双动力协同治疗的上转换纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下

步骤：

(1)将分散在环己烷中的表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料加入到环己烷，叔丁醇，水和k2co3水溶液中，并向其中加入lemieux-vonrudloff试剂，搅拌，离心，洗涤，收集产物；随后，将产物用hcl处理，得到壬二酸封端的亲水性上转换纳米颗粒，形成第一分散液；

(2)将kmno4加入到第一分散液中，在酸性环境下超声处理直至形成棕色胶体、使mno2生长在上转换纳米颗粒的侧面上；然后，收集mno2修饰的上转换纳米颗粒，形成第二分散液；

(3)预备亲水性聚合物(sh-peg-nh2)配体，并在常温下与第二分散液搅拌，从而进一步提高材料的水溶性和生物相容性，最后将材料分散在弱碱性缓冲液中，得到第三分散液；

(4)预备分散在弱酸性缓冲液中的硝酸酸化的c3n4，在活化剂作用下与第三分散液进行羧氨活化偶联，使c3n4与生长在上转换纳米颗粒侧面的上mno2共价连接，即得到水溶性良好的侧面生长并共价连接两种不同二维材料的上转换纳米复合材料，并使其同时具备磁共振成像(mri)、下转换荧光成像(dsl)、上转换荧光成像(ucl)作用层，以及化学/光动力(cdt+pdt)协同治疗复合结构。

所述步骤(1)中表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料为：

nayf4:yb,tm@nagdf4；nayf4:yb,tm,er@nagdf4；nayf4:yb,tm,ho@nagdf4。

所述步骤(1)具体为：将分散在环己烷中的上转换发光纳米材料，环己烷，叔丁醇，水和k2co3水溶液均加入两颈烧瓶中，在室温下搅拌20-30min，然后将lemieux-vonrudloff试剂滴加到溶液中，将所得混合物在40-50℃下搅拌48小时，离心，收集产物，并用去离子水和乙醇洗涤数次。随后，将产物用hcl处理，并将混合物在室温下搅拌30-40min；最后，将产物离心并洗涤，然后再分散在去离子水中，得到第一分散液；所述的lemieux-vonrudloff试剂为5.7mmkmno4和0.105mnaio4的水溶液。

所述步骤(2)具体为：将含有壬二酸封端的亲水性上转换纳米发光材料的水溶液加入到含有2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液(0.1m，ph＝6.0)的离心管中，并将kmno4加入管中，超声处理20-30min，直到形成棕色胶体，使mno2生长在上转换纳米颗粒的侧面上；随后，通离心收集mno2修饰的上转换纳米颗粒，用去离子水洗涤三次以除去过量的钾和游离锰离子，并再分散在去离子水中。

所述步骤(4)具体为：预备分散在弱酸性缓冲液mes中的硝酸酸化的c3n4，加入edc和nhs，超声15-30s,与此同时，将油浴锅升温稳定在37℃；超声完后，立刻放入油浴锅中，搅拌15-20min；后快速离心，并将第三分散液加入其中，快速超声30-50s，然后油浴锅搅拌过夜，使c3n4与生长在上转换纳米颗粒侧面的上mno2共价连接，；最后离心，洗涤，即得到水溶性良好的侧面生长并共价连接两种不同二维材料的上转换纳米复合材料，并使其同时具备mri、dsl、ucl作用层，以及cdt+pdt双动力协同治疗复合结构。

一种前述所述方法制备的用于双动力协同治疗的上转换纳米复合材料，其特征在于，其是通过在以表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料侧面生长mno2、然后共价连接c3n4制成，其是以表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料为核心的层状结构，在所述的核心的侧面上生长有mno2层，在mno2层上共价连接由c3n4；即在所述以表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料上复合有两种不同的治疗试剂，以使其同时具备mri、dsl、ucl作用层，以及连接两种不同二维材料、实施cdt+pdt双动力协同治疗的复合结构。

一种前述的用于双动力治疗和诊疗一体化的上转换纳米复合材料的应用，其特征在于，利用其以表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料侧面生长mno2、并共价连接c3n4形成的mri、dsl、ucl作用层，将其用作制备荧光成像或磁共振成像的造影剂。

一种前述的用于双动力治疗和诊疗一体化的上转换纳米复合材料的应用，其特征在于，利用mno2层及与其共价连接的c3n4形成的cdt+pdt双动力协同治疗复合结构，克服单一光敏剂治疗效果的局限性，将其用作制备光/化学动力的协同诊疗剂。

本发明的优点在于：

(1)本发明提供的侧面生长并共价连接两种不同二维材料的上转换纳米复合材料的制备方法，采用侧面生长和共价连接的方法，克服了现有方法的高温和复杂，此方法操作方便，制备过程高效、稳定、可重复性高，易于产业化；

(2)本发明提供的侧面生长并共价连接两种不同二维材料的上转换纳米复合材料，突破了同类产品的工艺及结构限制，能够实现纳米级结构，尺寸较小，生物相容性好，品质稳定，无毒副作用；

(3)本发明提供的侧面生长并共价连接两种不同二维材料的上转换纳米复合材料，突破了现有材料的性能和效果不足，克服单一光敏剂治疗效果的局限性，同时具备磁共振成像(mri)、下转换荧光成像(dsl)、上转换荧光成像(ucl)作用层，以及化学/光动力(cdt+pdt)协同治疗复合结构，具有荧光/磁共振多模式成像，以及协同光动力和化学动力治疗，经测试其对癌症的双动力协同治疗效果为现有非协同治疗技术的2～3倍，其生物医学应用前景非常广阔。

下面结合附图与具体实施方式，对本发明进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明实施例制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料的tem照片；

图2为本发明实施例的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料的侧面生长、共价连接过程及结构示意图；

图3是本发明实施例制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料在980nm和405nm激光分别激发下的上/下转换荧光光谱图；

图4是本发明实施例制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料的磁共振成像图；

图5是本发明实施例制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料的ros的监测图；

图6是本发明实施例制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料用于癌细胞的双动力治疗的细胞存活率。

图7是本发明实施例制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料用于癌细胞的双动力治疗的dcf相对荧光强度即治疗效果对比示意图。

具体实施方式

实施例1

参见附图1～7，本实施例提供的一种用于双动力治疗和诊疗一体化的上转换纳米复合材料，其采用侧面生长和共价连接法，将两种治疗试剂(c3n4、mno2)连接在上转换纳米晶表面，所述上转换纳米晶为nayf4:yb,tm@nagdf4。该复合双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土铥掺杂上转换发光纳米材料的方法制备，其包括以下步骤：

(1)将20mg分散在环己烷中的nayf4:yb,tm@nagdf4上转换发光纳米材料，20ml环己烷，14ml叔丁醇，2ml水和1mk2co3水溶液均加入两颈烧瓶中，在室温下搅拌20min，然后将4mllemieux-vonrudloff试剂(5.7mmkmno4和0.105mnaio4水溶液)滴加到溶液中，将所得混合物在40℃下搅拌48小时，离心，收集产物，并用去离子水和乙醇洗涤数次。随后，将产物用等体积的hcl(ph＝4-5)处理，并将混合物在室温下搅拌30min；最后，将产物离心并洗涤，然后再分散在1ml去离子水中，得到第一分散液。

(2)将100μl含有壬二酸封端的亲水性上转换纳米发光材料的水溶液加入到含有250μl2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液(0.1m，ph＝6.0)的离心管中，并将250μlkmno4加入管中，超声处理30min，直到形成棕色胶体。随后，通离心收集mno2修饰的上转换纳米颗粒，用去离子水洗涤三次以除去过量的钾和游离锰离子，并再分散在1ml去离子水中；

(3)预备亲水性聚合物(sh-peg-nh2)配体，并在常温下与第二分散液搅拌，最后将20mg材料分散在10ml弱碱性pbs缓冲液中，得到第三分散液；

(4)预备20mg分散在10ml弱酸性缓冲液mes中的硝酸酸化的c3n4，加入80mgedc和120mgnhs，超声15s,与此同时，将油浴锅升温稳定在37℃,超声完后，立刻放入油浴锅中，搅拌15min,后快速离心，并将第三分散液加入其中，快速超声30s，然后油浴锅搅拌过夜。后离心，洗涤，即得到水溶性良好的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料，并使其同时具备磁共振成像(mri)、下转换荧光成像(dsl)、上转换荧光成像(ucl)作用层，以及化学/光动力(cdt+pdt)协同治疗复合结构。

一种前述方法制备的用于双动力协同治疗的上转换纳米复合材料，其是通过在以表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料侧面生长mno2、然后共价连接c3n4制成，其是以表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料为核心的层状结构，在所述的核心的侧面上生长有mno2层，在mno2层上共价连接由c3n4；即在所述以表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料上复合有两种不同的治疗试剂，以使其同时具备mri、dsl、ucl作用层，以及连接两种不同二维材料、实施cdt+pdt双动力协同治疗的复合结构。

一种前述的用于双动力治疗和诊疗一体化的上转换纳米复合材料的应用，利用其以表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料侧面生长mno2、并共价连接c3n4形成的mri、dsl、ucl作用层，将其用作制备荧光成像或磁共振成像的造影剂。

一种前述的用于双动力治疗和诊疗一体化的上转换纳米复合材料的应用，利用mno2层及与其共价连接的c3n4形成的cdt+pdt双动力协同治疗复合结构，克服单一光敏剂治疗效果的局限性，将其用作制备光/化学动力的协同诊疗剂，可达到突出的双动力协同疗效。

图1为本实施例1制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料的tem照片，可见上转换纳米粒子周围已经连接上mno2、c3n4两种光动力治疗试剂，说明该方法能得到形貌良好、生长均匀的纳米材料；并且最终的纳米材料，其平均粒径约为180～200nm，表面呈现正电性。因此，纳米粒子更容易被细胞内吞，有利于在生物体内循环，能够满足荧光成像、磁共振成像和协同光动力治疗的临床诊疗一体化的需要。

图2为本实施例双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料的侧面生长、共价连接过程及结构示意图，由该图可以看出，其是通过在以表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料侧面生长mno2、然后共价连接c3n4制成，其是以表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料为核心的层状结构，在所述的核心的侧面上生长有mno2层，在mno2层上共价连接由c3n4；即在所述以表面包裹有惰性nagdf4层的油溶性稀土上转换发光纳米材料上复合有两种不同的治疗试剂，以使其同时具备mri、dsl、ucl作用层，以及连接两种不同二维材料、实施cdt+pdt双动力协同治疗的复合结构。

实施例2

本实施例提供的一种用于双动力治疗的上转换纳米复合材料、制备方法及应用，具体来说，采用侧面生长和共价连接的方法，复合双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土铒、铥共掺杂上转换发光纳米材料，与实施例1基本相同，其不同之处在于，其包括以下步骤：

(1)将25mg分散在环己烷中的nayf4:yb,tm,er@nagdf4上转换发光纳米材料，20ml环己烷，14ml叔丁醇，2ml水和1mk2co3水溶液均加入两颈烧瓶中，在室温下搅拌30min，然后将5mllemieux-vonrudloff试剂(5.7mmkmno4和0.105mnaio4水溶液)滴加到溶液中，将所得混合物在45℃下搅拌40小时，离心，收集产物，并用去离子水和乙醇洗涤数次。随后，将产物用等体积的hcl(ph＝4-5)处理，并将混合物在室温下搅拌40min。最后，将产物离心并洗涤，然后再分散在1.5ml去离子水中，得到第一分散液；

(2)将100μl含有壬二酸封端的亲水性上转换纳米发光材料的水溶液加入到含有200μl2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液(0.1m，ph＝6.0)的离心管中，并将200μlkmno4加入管中，超声处理50min，直到形成棕色胶体。随后，通离心收集mno2修饰的上转换纳米颗粒，用去离子水洗涤三次以除去过量的钾和游离锰离子，并再分散在1.5ml去离子水中；

(3)预备亲水性聚合物(sh-peg-nh2)配体，并在常温下与第二分散液搅拌，最后将25mg材料分散在15ml弱碱性pbs缓冲液中，得到第三分散液；

(4)预备25mg分散在15ml弱酸性缓冲液mes中的硝酸酸化的c3n4，加入85mgedc和125mgnhs，超声15s,与此同时，将油浴锅升温稳定在37℃,超声完后，立刻放入油浴锅中，搅拌15min,后快速离心，并将第三分散液加入其中，快速超声40s，然后油浴锅搅拌过夜。后离心，洗涤，即得到水溶性良好的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土铒、铥共掺杂上转换发光纳米复合材料。

一种采用上述方法制备而得的用于双动力治疗的上转换纳米复合材料，其采用侧面生长和共价连接法，将两种治疗试剂(c3n4、mno2)连接在上转换纳米晶表面，所述上转换纳米晶为nayf4:yb,tm,er@nagdf4。

实施例3

本实施例提供的一种用于双动力治疗的上转换纳米复合材料、制备方法及应用，具体来说，采用侧面生长和共价连接的方法，复合双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土钬、铥共掺杂上转换发光纳米材料，与实施例1、2基本相同，其不同之处在于，其包括以下步骤：

(1)将22mg分散在环己烷中的nayf4:yb,tm,ho@nagdf4上转换发光纳米材料，20ml环己烷，14ml叔丁醇，2ml水和1mk2co3水溶液均加入两颈烧瓶中，在室温下搅拌35min，然后将5mllemieux-vonrudloff试剂(5.7mmkmno4和0.105mnaio4水溶液)滴加到溶液中，将所得混合物在45℃下搅拌40小时，离心，收集产物，并用去离子水和乙醇洗涤数次。随后，将产物用等体积的hcl(ph＝4-5)处理，并将混合物在室温下搅拌35min。最后，将产物离心并洗涤，然后再分散在2ml去离子水中，得到第一分散液。

(2)将100μl含有壬二酸封端的亲水性上转换纳米发光材料的水溶液加入到含有230μl2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液(0.1m，ph＝6.0)的离心管中，并将230μlkmno4加入管中，超声处理60min，直到形成棕色胶体。随后，通离心收集mno2修饰的上转换纳米颗粒，用去离子水洗涤三次以除去过量的钾和游离锰离子，并再分散在2ml去离子水中。

(3)预备亲水性聚合物(sh-peg-nh2)配体，并在常温下与第二分散液搅拌，最后将22mg材料分散在13ml弱碱性pbs缓冲液中，得到第三分散液。

(4)预备22mg分散在13ml弱酸性缓冲液mes中的硝酸酸化的c3n4，加入83mgedc和123mgnhs，超声15s,与此同时，将油浴锅升温稳定在37℃,超声完后，立刻放入油浴锅中，搅拌15min,后快速离心，并将第三分散液加入其中，快速超声50s，然后油浴锅搅拌过夜。后离心，洗涤，即得到水溶性良好的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)的稀土钬、铥共掺杂上转换发光纳米复合材料。

一种采用上述方法制备而得的用于双动力治疗的上转换纳米复合材料，其采用侧面生长和共价连接法，将两种治疗试剂(c3n4、mno2)连接在上转换纳米晶表面，所述上转换纳米晶为nayf4:yb,tm,ho@nagdf4。

实施例4

本实施例提供的一种用于双动力治疗的上转换纳米复合材料、制备方法及应用，与实施例1-3均基本相同，其不同之处在于：

其具体为将实施例1制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料，应用于细胞荧光成像的方法，包括以下步骤：

(1)预备双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料0～15mg，细胞培养基、96孔板培养的hela细胞；

(2)将预备的纳米材料用培养基配制成3～4mg/ml，超声5分钟分散，形成混合分散液；

(3)取不同浓度的(2)中的分散液加入96孔板中，随后置于恒温恒湿机箱中培养2小时，在激光共聚焦显微镜下观察。

图3是本发明实施例制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料在980nm和405nm激光分别激发下的上/下转换荧光光谱图，从图中可以观察到位于375nm、475nm处的发射峰，有利于实现更深穿透层次的成像，而980nm刚好位于生物组织的“光学窗口”，表明此材料非常适合于细胞和小动物活体成像。同时，由于c3n4良好的下转换发光效应，可以在405nm的激光激发下，呈现出下转换荧光的成像效果，在细胞和动物体内，实现上下转换双模式成像，更加精准的进行肿瘤定位。

实施例5

本实施例提供的一种用于双动力治疗的上转换纳米复合材料、制备方法及应用，与实施例1-4均基本相同，其不同之处在于：

本实施例提供的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料，应用于磁共振成像的方法，其包括以下步骤：

(1)预备15～30ml浓度为10～15mg/ml的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料，用磷酸盐缓冲溶液(pbs)将其配制成1～2mg/ml，超声5分钟分散，形成混合分散液；

(2)取不同浓度的(1)中的混合分散液，在磁共振仪器上分别测其磁共振成像。

图4是本发明实施例1制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料的磁共振成像图，通过对比可以看出，mn⁴⁺的存在进一步提高了材料的磁共振成像效果，利用gd³⁺浓度对1/t1作图并直线拟合后得到弛豫常数r1，证实了该纳米材料可以用于磁共振成像。

实施例6

本实施例提供的侧面生长并共价连接两种不同二维材料的用于双动力治疗的上转换纳米复合材料、制备方法及应用，与实施例1-5均基本相同，其不同之处在于：

其具体将双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料，应用于体外光/化学动力实验的方法，包括以下步骤：

(1)用去离子水配400μg/ml的纳米材料；

(2)取10mg的材料与2ml0.5mg·ml^-1dpbf通过超声波处理充分混合，避光，溶液由980nm激光(0.5cm^-1)照射激发；

(3)测量不同时间点样品的紫外吸收曲线，同时，向10分钟的最后一组样品中加入h2o2，以研究mno2对cdt的影响。

图5是本发明实施例1制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料的紫外吸收曲线图(即ros监测图)，激光照射后，随着时间的增长，dpbf在410nm波长下的uv-vis吸收带随着照射时间的延长而降低，表明ros量的增加，也证实了该纳米材料具有良好的双动力治疗效果，为后续生物实验的进行提供了可能。

实施例7

本实施例提供的侧面生长并共价连接两种不同二维材料的用于双动力治疗的上转换纳米复合材料、制备方法及应用，与实施例1-6均基本相同，其不同之处在于：

其具体将双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料，应用于癌细胞的双动力治疗，包括以下步骤：

(1)预备实施例1中的材料，配制成0,25,50,100,200,400μg/ml的dmem培养基；

(2)将hela细胞在上述培养基中分别培养24h；

(3)用pbs缓冲溶液冲洗三次，将没有被细胞吸收的材料洗去；

(4)将培养后的细胞在用0.5w/cm²的980nm激光器间隔照射6min(照射2min，停2min)，再继续在培养基中培养24h，用cck-8法，测定细胞的存活率；同时，分别用钙黄绿素和碘化丙啶对活死细胞分别进行染色，用荧光显微镜收集发射荧光。

图6是本发明实施例1制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料的培养过后的细胞存活率，从图中，我们可以看出，在980nm激光照射下，ucnps@mno2-c3n4对hela细胞显示出优异的浓度依赖型毒性。当ucnps@mno2-c3n4浓度为400μg/ml时，细胞存活率降至对照的23％。这些结果充分表明，ucnps@mno2-c3n4纳米复合材料在激光照射下表现出良好的双动力治疗(cdt+pdt)效果。

实施例8

本实施例提供的侧面生长并共价连接两种不同二维材料的上转换纳米复合材料、制备方法及应用，与实施例1-7均基本相同，其不同之处在于：

其具体将双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料，应用于对单线态氧的监测，从而来检测治疗效果，包括以下步骤：

(1)将hela细胞接种在板中并培养过夜，将ucnps@mno2和ucnps@mno2-c3n4

(400μg/ml)共孵育后，用d-hanks溶液洗涤；

(2)将dcfh-da加入培养基中并孵育，然后冲洗三次。

(3)用功率为0.5w/cm²的980nm近红外激光照射，没有照射的空白孔也被检测作为对照。使用酶标仪(485nm激发/528nm发射)检测dcf荧光强度。

图7是本发明实施例1制得的双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土铥掺杂上转换发光纳米复合材料的培养过后，用dcfh-da对细胞单线态氧的检测图，从图中，我们可以看出，与对照组相比，单独cdt材料中单线态氧的含量几乎翻了2倍，而最终材料组中单线态氧的含量接近3倍。结果进一步表明了ucnps@mno2-c3n4纳米复合材料的潜在诊断和治疗价值，其协同治疗疗效为现有技术的2～3倍。

本发明的重点在于，本发明采用直接侧面生长和共价连接的方法，独特简捷的工艺方法及组分配比，获得基于纳米晶表面直接生长用于双动力治疗的纳米复合物，制备工艺简洁，过程易控，产品结构稳定、尺寸均一、水溶性好，可重复性高，易于产业化。

本发明不限于上述实施方式，采用与其相同或相似方法所得的其它双动力治疗试剂(c3n4、mno2)修饰的稀土上转换发光纳米复合材料的方法，如不同稀土离子掺杂的上转换纳米晶(nayf4:yb,tm@nagdf4；nayf4:yb,tm,er@nagdf4；nayf4:yb,tm,ho@nagdf4)、不同的水溶性聚合物等均在本发明保护范围内。