本发明属于医药领域，涉及一种葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物的制备方法及应用。
背景技术：
近年来，声动力疗法(sonodynamictherapy，sdt)已经成为治疗肿瘤的新兴手段，声动力学疗法是在光动力疗法(pdt)的基础上发展而来一种优选的治疗方式。与pdt相比，sdt具有组织穿透深、无创、对正常组织毒性较低等特点。sdt是指给予患者一定剂量声敏剂，在一定的频率和强度的超声波激发下，声敏剂从基态跃迁到激发态，之后由激发态回到基态时释放能量转移给氧分子生成活性氧(ros)，导致肿瘤细胞发生不可逆行损伤，从而达到治疗肿瘤目的。由此可见，sdt具有氧气依赖性，然而，相较正常组织来说，肿瘤部位呈现乏氧环境，因此提高肿瘤组织氧气含量是提高sdt效应的关键因素。
二氧化锰纳米粒作为一种原位氧气生成材料，因具有类过氧化氢酶样活性可催化氧化过氧化氢产生o2和mn2+离子。基于肿瘤酸性微环境，二氧化锰纳米粒有望通过o2自给性以及mn2+的t1加权磁共振成像(mri)对比性能来放大声动力学疗法的效果。值得注意的是，具有介孔孔道和高比表面积的中空二氧化锰纳米粒可被用作纳米载体，提高对小分子声敏剂的负载量。然而，肿瘤细胞内过氧化氢含量有限，限制了二氧化锰的产氧水平。因此，提高细胞内过氧化氢的水平是解决该问题的重点。
葡萄糖氧化酶(gox)作为一种天然的氧化还原酶，已在生物医学领域得到广泛研究。gox可消耗氧气，催化葡萄糖氧化为过氧化氢和葡萄糖酸。基于此，将gox修饰在中空二氧化锰纳米粒表面或许可形成氧气和过氧化氢的循环补充，成功实现级联催化治疗。此外，此种方式可提高gox的稳定性，防止在血循环过程中被降解。一般来讲，与正常组织的氧化磷酸化供能方式不同，肿瘤细胞以有氧糖酵解为主要供能方式，对葡萄糖有较强的依赖性。因此，基于gox修饰的介孔二氧化锰药物组合物势必消耗葡萄糖，阻碍细胞能量供应，进而“饥饿”细胞，促进细胞凋亡。
将gox通过酰胺键修饰到介孔二氧化锰纳米粒表面，在介孔二氧化锰纳米粒孔道中物理负载小分子声敏剂，即得一种葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物。gox有效将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢，使得依赖葡萄糖供能的肿瘤细胞“饥饿”。同时，二氧化锰催化过氧化氢产生氧气，可极大提高声动力学治疗的效率，且二氧化锰作为磁共振成像造影剂可对肿瘤定位，在治疗过程中可以进行实时监测。因此，发明一种葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物在肿瘤诊疗中具有重大意义和价值，但至今未见有公开报导。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物的制备方法及应用，可有效解决葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物的制备，实现声动力学治疗和饥饿疗法协同抑制肿瘤细胞生长，为治疗肿瘤疾病提供新药物的问题。
本发明解决的技术方案是，一种葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物的制备方法，将葡萄糖氧化酶通过酰胺键反应修饰在介孔二氧化锰纳米粒子的表面，再在介孔二氧化锰孔道中物理负载小分子声敏剂，成内部荷载声敏剂，外部共价修饰葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒药物组合物；所述的介孔二氧化锰纳米粒的粒径为100-300nm；所述葡萄糖氧化酶与二氧化锰的质量比为1︰5，具体制备方法包括以下步骤：
(1)、制备介孔二氧化锰纳米粒：将7.5-8.0g的十二烷基苯磺酸钠超声溶解于90-110ml的超纯水中，成十二烷基苯磺酸溶液；将1.3-1.5g的碳酸氢钠溶于12-18ml超纯水中配成无色透明溶液；将1-2g的mncl2·4h2o溶于6-12ml的超纯水中配成淡粉色透明溶液；将十二烷基苯磺酸溶液置于50℃油浴下搅拌5-10min，之后加入碳酸氢钠溶液继续搅拌30-40min，再逐滴加入配好的mncl2·4h2o溶液搅拌3-4h，10000-15000rpm离心10min取沉淀，沉淀先用超纯水洗3-5次，再用无水乙醇洗3-5次，50-60℃下烘干24h，研磨后放入马弗炉400℃煅烧5-7h，所得黑色固体粉末即为介孔二氧化锰纳米粒；
(2)、制备氨基化二氧化锰复合物：将介孔二氧化锰粉末15-25mg用7-9ml的无水乙醇超声分散，再向其中加入70-90μl的3-氨丙基三乙氧基硅烷、0.3-0.5ml的超纯水、0.3-0.5ml的浓氨水，室温搅拌10h，离心取沉淀，无水乙醇洗至中性，50-60℃烘干取出研磨成粉末，即得氨基化二氧化锰复合物；
(3)、制备葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒：将8-12mg的葡萄糖氧化酶溶于1-3ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中配成亮黄色透明液体；取7-9mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶于0.5-1.5ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中，成1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液；取5.5-6.5mg的n-羟基琥珀酰亚胺溶于0.5-1.5ml的一水吗啉乙磺缓冲液中，成n-羟基琥珀酰亚胺溶液；取4.5-5.5mg氨基化二氧化锰溶于1-3ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中，成氨基化二氧化锰溶液；向葡萄糖氧化酶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和n-羟基琥珀酰亚胺溶液，在室温下搅拌25-30min，加入氨基化二氧化锰溶液，在室温下搅拌反应4-6h，离心取沉淀，沉淀用磷酸缓冲盐溶液洗涤3-5次，30-40℃烘干取出研磨成粉末，即得葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒；
(4)、制备葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物：将5-7mg的小分子声敏剂溶于1-3ml无水乙醇中；将5-7mg葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒探超分散于5-7ml超纯水中，二者混合后室温搅拌24-48h，10000-15000rpm离心5-10min，得沉淀，沉淀再用体积比1︰1的无水乙醇-水混合液复溶，如此重复2～3遍，冷冻干燥，即得葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物；
所述的小分子声敏剂为二氢卟吩、金属酞菁及卟啉类化合物的血卟啉单甲醚中的一种。
所述的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，该是一种内部荷载声敏剂，外部共价修饰葡萄糖氧化酶的介孔的二氧化锰纳米粒。
所述的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物在制备治疗肿瘤药物注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用。
所述的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物在声动力学治疗和饥饿疗法可协同抑制肿瘤细胞生长，其中所降解的mn2+可作为磁共振对肿瘤定位成像造影剂中的应用。
本发明制备方法稳定可靠，成本低，制得的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物在制备抗肿瘤药物方面可实现饥饿疗法与声动力学治疗的协同治疗，且可作为磁共振成像造影剂对肿瘤进行实时监测，是肿瘤治疗药物上的创新，经济和社会效益巨大。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)、制备介孔二氧化锰纳米粒：将7.8g的十二烷基苯磺酸钠超声溶解于100ml的超纯水中，成十二烷基苯磺酸溶液；将1.4g的碳酸氢钠溶于15ml超纯水中配成无色透明溶液；将1.5g的mncl2·4h2o溶于9ml的超纯水中配成淡粉色透明溶液；将十二烷基苯磺酸溶液置于50℃油浴下搅拌7min，之后加入碳酸氢钠溶液继续搅拌35min，再逐滴加入配好的mncl2·4h2o溶液搅拌3.5h，13000rpm离心10min取沉淀，沉淀先用超纯水洗4次，再用无水乙醇洗4次，55℃下烘干24h，研磨后放入马弗炉400℃煅烧6h，所得黑色固体粉末即为介孔二氧化锰纳米粒；
(2)、制备氨基化二氧化锰复合物：将介孔二氧化锰粉末20mg用8ml的无水乙醇超声分散，再向其中加入80μl的3-氨丙基三乙氧基硅烷、0.4ml的超纯水、0.4ml的浓氨水，室温搅拌10h，离心取沉淀，无水乙醇洗至中性，55℃烘干取出研磨成粉末，即得氨基化二氧化锰复合物；
(3)、制备葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒：将10mg的葡萄糖氧化酶溶于2ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中配成亮黄色透明液体；取8mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶于1ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中，成1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液；取6mg的n-羟基琥珀酰亚胺溶于1ml的一水吗啉乙磺缓冲液中，成n-羟基琥珀酰亚胺溶液；取5mg氨基化二氧化锰溶于2ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中，成氨基化二氧化锰溶液；向葡萄糖氧化酶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和n-羟基琥珀酰亚胺溶液，在室温下搅拌28min，加入氨基化二氧化锰溶液，在室温下搅拌反应5h，离心取沉淀，沉淀用磷酸缓冲盐溶液洗涤4次，35℃烘干取出研磨成粉末，即得葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒；
(4)、制备葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物：将6mg的小分子声敏剂血卟啉单甲醚或二氢卟吩溶于2ml无水乙醇中；将6mg葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒探超分散于6ml超纯水中，二者混合后室温搅拌36h，12000rpm离心8min，得沉淀，沉淀再用体积比1︰1的无水乙醇-水混合液复溶，如此重复2遍，冷冻干燥，即得葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物。
实施例2
本发明一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法，由以下步骤实现：
(1)、制备介孔二氧化锰纳米粒：称取7.75g的十二烷基苯磺酸钠超声溶解于100ml的超纯水中；称取1.4g的碳酸氢钠溶于15ml超纯水中配成无色透明溶液；称取1.5g的mncl2·4h2o溶于9ml的超纯水中配成淡粉色透明溶液；将十二烷基苯磺酸溶液置于50℃油浴下搅拌7.5min，之后加入碳酸氢钠溶液继续搅拌35min，再逐滴加入配好的mncl2·4h2o溶液搅拌3.5h，12500rpm离心10min取沉淀，沉淀先用超纯水洗4次，再用无水乙醇洗4次，55℃下烘干24h，研磨后放入马弗炉400℃煅烧6h，所得黑色固体粉末即为介孔二氧化锰纳米粒；
(2)、制备氨基化二氧化锰复合物：取20mg介孔二氧化锰粉末，用8ml的无水乙醇超声分散，再向其中加入80μl的3-氨丙基三乙氧基硅烷、0.4ml的超纯水、0.4ml的浓氨水，室温搅拌10h，离心取沉淀，无水乙醇洗至中性，55℃烘干取出研磨成粉末，即得氨基化二氧化锰复合物；
(3)、制备葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒：取10mg的葡萄糖氧化酶溶于2ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中配成亮黄色透明液体；取8mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶于1ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中；取6.0mg的n-羟基琥珀酰亚胺溶于1.0ml的一水吗啉乙磺缓冲液中；取5.0mg氨基化二氧化锰溶于2ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中；向葡萄糖氧化酶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和n-羟基琥珀酰亚胺溶液，在室温下搅拌27min，加入氨基化的二氧化锰溶液，在室温下搅拌反应5h；离心取沉淀，用磷酸缓冲盐溶液洗涤4次，35℃烘干取出研磨成粉末，即得葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒；
(4)、制备葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物：将6mg的小分子声敏剂金属酞菁溶于2ml无水乙醇中；将6mg葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒探超分散于6ml超纯水中，二者混合后室温搅拌36h，12500rpm离心7min，得沉淀，沉淀再用体积比1︰1无水乙醇-水混合液复溶，如此重复2～3遍，冷冻干燥，即得葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物。
实施例3
本发明一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法，由以下步骤实现：
(1)、制备介孔二氧化锰纳米粒：称取7.5g的十二烷基苯磺酸钠超声溶解于90ml的超纯水中；称取1.3g的碳酸氢钠溶于12ml超纯水中配成无色透明溶液；称取1g的mncl2·4h2o溶于6ml的超纯水中配成淡粉色透明溶液；将十二烷基苯磺酸溶液置于50℃油浴下搅拌5min，之后加入碳酸氢钠溶液继续搅拌30min，再逐滴加入配好的mncl2·4h2o溶液搅拌3h，10000rpm离心10min取沉淀，沉淀先用超纯水洗3次，再用无水乙醇洗3次，50℃下烘干24h，研磨后放入马弗炉400℃煅烧5h，所得黑色固体粉末即为介孔二氧化锰纳米粒；
(2)、制备氨基化二氧化锰复合物：取15mg上述制备好的介孔二氧化锰粉末，用7ml的无水乙醇超声分散，再向其中加入70μl的3-氨丙基三乙氧基硅烷、0.3ml的超纯水、0.3ml的浓氨水，室温搅拌10h，离心取沉淀，无水乙醇洗至中性，50℃烘干取出研磨成粉末，即得氨基化二氧化锰复合物；
(3)、制备葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒：取8mg的葡萄糖氧化酶溶于1ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中配成亮黄色透明液体；取7mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶于0.5ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中；取5.5mg的n-羟基琥珀酰亚胺溶于0.5ml的一水吗啉乙磺缓冲液中；取4.5mg氨基化二氧化锰溶于1ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中；向葡萄糖氧化酶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和n-羟基琥珀酰亚胺溶液，在室温下搅拌25min，加入氨基化的二氧化锰溶液，在室温下搅拌反应4h，离心取沉淀，用磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，30℃烘干取出研磨成粉末，即得葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒；
(4)、制备葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物：将5mg的小分子声敏剂血卟啉单甲醚溶于1ml无水乙醇中；将5mg葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒探超分散于5ml超纯水中，二者混合后室温搅拌24h，10000rpm离心5min，得沉淀，沉淀再用体积比1︰1无水乙醇-水混合液复溶，如此重复2～3遍，冷冻干燥，即得葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物。
实施例4
本发明一种葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物的制备方法，由以下步骤实现：
(1)、制备介孔二氧化锰纳米粒：称取8.0g的十二烷基苯磺酸钠超声溶解于110ml的超纯水中；称取1.5g的碳酸氢钠溶于18ml超纯水中配成无色透明溶液；称取2g的mncl2·4h2o溶于12ml的超纯水中配成淡粉色透明溶液；将十二烷基苯磺酸溶液置于50℃油浴下搅拌10min，之后加入碳酸氢钠溶液继续搅拌40min，再逐滴加入配好的mncl2·4h2o溶液搅拌4h，15000rpm离心10min取沉淀，沉淀先用超纯水洗5次，再用无水乙醇洗5次，60℃下烘干24h，研磨后放入马弗炉400℃煅烧7h，所得黑色固体粉末即为介孔二氧化锰纳米粒；
(2)、制备氨基化二氧化锰复合物：取25mg上述制备好的介孔二氧化锰粉末，用9ml的无水乙醇超声分散，再向其中加入90μl的3-氨丙基三乙氧基硅烷、0.5ml的超纯水、0.5ml的浓氨水，室温搅拌10h，离心取沉淀，无水乙醇洗至中性，60℃烘干取出研磨成粉末，即得氨基化二氧化锰复合物；
(3)、制备葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒：取12mg的葡萄糖氧化酶溶于3ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中配成亮黄色透明液体；取9mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶于1.5ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中；取6.5mg的n-羟基琥珀酰亚胺溶于1.5ml的一水吗啉乙磺缓冲液中；取5.5mg氨基化二氧化锰溶于3ml的一水吗啉乙磺酸缓冲液中；向葡萄糖氧化酶溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和n-羟基琥珀酰亚胺溶液，在室温下搅拌30min，加入氨基化的二氧化锰溶液，在室温下搅拌反应6h；离心取沉淀，用磷酸缓冲盐溶液洗涤5次，40℃烘干取出研磨成粉末，即得葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒；
(4)、制备葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物：将7mg的小分子声敏剂二氢卟吩或血卟啉单甲醚溶于3ml无水乙醇中；将7mg葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米粒探超分散于7ml超纯水中，二者混合后室温搅拌48h，15000rpm离心5-10min，得沉淀，沉淀再用体积比1︰1无水乙醇-水混合液复溶，如此重复2～3遍，冷冻干燥，即得葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物。
实施例1-4所述方法制备的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物，可有效用于制备抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物为注射剂、口服剂或植入给药剂，以及制备磁共振对肿瘤定位成像造影剂，实现葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，在制备治疗肿瘤药物注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用，在声动力学治疗和饥饿疗法可协同抑制肿瘤细胞生长药物以及所降解的mn2+作为磁共振对肿瘤定位成像造影剂中的应用。
由上述可以看出，本发明方法简单，易操作，成本低，所制备的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物为内部荷载声敏剂，外部共价修饰葡萄糖氧化酶的介孔二氧化锰纳米粒，并经实地试验取得了非常好的有益技术效果，试验表明，本发明所制得的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物到达肿瘤部位后，有效将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢，使得依赖葡萄糖供能的肿瘤细胞“饥饿”。同时，二氧化锰催化过氧化氢产生氧气，可极大提高声动力学治疗的效率，且二氧化锰作为磁共振成像造影剂可对肿瘤定位，在治疗过程中可以进行实时监测。该药物组合物将声动力学疗法与饥饿疗法相结合，既能弥补声动力学治疗的不足，又能协同增强治疗效果，操作方便，方法稳定可靠，与传统化疗相比具有高效、可控的优势。有关资料如下(以实施例1为例)：
一、负载血卟啉单甲醚的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米复合物的表征实验：
1、葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物中血卟啉单甲醚含量的测定
采用紫外分光光度法，于396nm波长处测定血卟啉单甲醚的含量。以公式(1)计算样品的载药量。载药量达到32％，计算公式为：
2、负载血卟啉单甲醚的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米复合物的粒径和电位的测定
取适量负载血卟啉单甲醚的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米复合物分散于水中，用nano-zs90型激光纳米粒度分析仪测得其粒径和电位分别为290.3±5.8nm和-18.8±1.7mv。
二、负载血卟啉单甲醚的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米复合物在体外产生活性氧实验：
选择对数生长期的mcf-7人乳腺癌细胞，调整细胞数为3×105个/ml接种于六孔培养板，每孔2ml，细胞贴壁生长24h后加药，依次为空白组、mno2-gox组、hmme、hmme/mno2-gox组，并分设超声组，其中mno2终浓度设为20μg/ml，培养24h后，弃去旧培养液，每孔用新鲜的磷酸缓冲盐溶液洗2～3遍，每孔加1ml含dcfh-da的活性氧探针培养基，37℃培养30min后，用新鲜的磷酸缓冲盐溶液洗2～3遍，在显微镜下观察，hmme超声组、hmme/mno2-gox超声组均检测到较高强度的绿色的dcfh-da荧光信号，该结果与文献报道一致，作为声敏剂的hmme会产生ros，尤其是有效声动力学疗法的单线态分子氧(1o2)，从而达到消灭肿瘤细胞的作用。
三、负载血卟啉单甲醚的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米复合物的细胞摄取实验：
选择对数生长期的mcf-7人乳腺癌细胞，调整细胞数为3×105个/ml接种于6孔培养板，每孔2ml，贴壁生长24h后加药，依次为hmme组、hmme/mno2-gox组，药物终浓度设为10μg/ml，孵育时间设为1h、4h，加药后在37℃，5％co2条件下培养后，将孔内含药培养基弃去，每孔用1ml磷酸缓冲盐溶液洗2～3遍，加入500μl不含edta的胰酶消化细胞，加1ml新鲜培养基终止消化，吹打，直至细胞与壁分离，将细胞悬液移入10ml离心管中，离心弃去上清，加磷酸缓冲盐溶液重悬，用流式细胞仪测定，发现mcf-7人乳腺癌细胞1h对hmme、hmme/mno2-gox的摄取量分别为：27.18％、39.88％；4h时的摄取量分别为：46.93％、89.12％。结果表明，hmme/mno2-gox纳米制剂可携带药物更多更快的进入细胞，提高细胞摄取效率。
四、负载血卟啉单甲醚的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米复合物的细胞增殖抑制实验：
采用srb法，选择对数生长期的mcf-7人乳腺癌细胞，调整细胞数为5×104个/ml接种于96孔培养板，每孔100μl(边缘孔用无菌磷酸缓冲盐溶液填充)，细胞贴壁生长24h后加药，依次为空白组、空白+us组、hmme、hmme+us组、mno2-gox组、mno2-gox+us组、hmme/mno2-gox组及hmme/mno2-gox+us组。hmme终浓度设为10μg/ml，并分设超声组(1w/cm2，1min)和非超声组。每组设6个复孔。加药孵育24h后，每孔加入50μl，4℃预冷的50％三氯乙酸(tca)固定细胞，固定10min后移入4℃冰箱固定1h，取出弃去固定液，用去离子水洗5遍，甩干，室温自然干燥。室温晾干后，每孔加入srb染液50μl，室温避光放置15～30min染色，弃染液，用1％的冰醋酸洗5遍，室温干燥之后，用150μl非缓冲tris碱液(10mm，ph＝10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，摇床微振荡(37℃，100rpm，10min)，于酶标仪515nm波长处测每个小孔的od值，计算肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1-实验组od值/对照组od值)×100％，计算得到空白组、空白+us组、hmme组、hmme+us组、mno2-gox组、mno2-gox+us组、hmme/mno2-gox组，hmme/mno2-gox+us组各组的细胞生长抑制率分别为：2.1％、4.7％、3.1％，42.5％，19.8％，23.4％，26.7％，81.6％。结果表明，hmme在未超声时无明显细胞毒效应，但在超声条件下产生活性氧可抑制肿瘤生长，有明显的声动力学效应；在无超声时制剂组与原料药组的细胞毒性差别不大，而在超声时hmme/mno2-gox对细胞杀伤效果最强，则是饥饿疗法与声动力学治疗协同作用的结果。
五、负载血卟啉单甲醚的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰纳米复合物的药效学研究实验：
购买昆明小鼠(雌性，3～4周龄)，在小鼠的右上肢背部皮下接种s-180腹水瘤细胞，7天后测量肿瘤体积，取36只肿瘤体积≥100mm3且肿瘤体积和体重相似的小鼠，将其随机分为6组，每组6只。具体分组如下：空白组、空白+us组、hmme组、hmme+us组、mno2-gox组、mno2-gox+us组、hmme/mno2-gox组，hmme/mno2-gox+us组。均采用尾静脉注射，每两天给药一次，共给药7次。超声组给药6h后超声治疗肿瘤部位(1w/cm2，1min)。整个实验过程中保证小鼠每日正常饮食，每两天对小鼠进行称重，并使用数显游标卡尺测量荷瘤小鼠肉瘤的长径(a)与短径(b)，按公式肿瘤体积v＝a×b2/2计算肿瘤体积。记录的数据显示，空白组、空白+us组、hmme组、hmme+us组、mno2-gox组、mno2-gox+us组、hmme/mno2-gox组，hmme/mno2-gox+us组各组的抑瘤率分别为3.21％、3.45％、5.95％，41.46％，34.76％，36.37％，39.75，87.63％。结果表明，hmme/mno2-gox+us组的药效显著，说明hmme/mno2-gox在超声下的声动力学疗法可以显著增强肿瘤的治疗效果。
在实验中，还针对实施2、3、4方法制备的葡萄糖氧化酶修饰的金属有机框架药物组合物，按上述各项进行了反复试验，均取得了相同或相近似的结果，这里不一一累述。
实验表明，本发明与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：
(1)本发明提供的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物，在肿瘤部位处葡萄糖氧化酶消耗葡萄糖进行饥饿疗法；同时所产生的h2o2与具有类过氧化氢酶活性的介孔二氧化锰纳米粒反应产生氧气，提高了声动力学治疗的效率。
(2)本发明提供的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物，可在肿瘤组织降解为mn2+离子，mn2+可作为磁共振成像造影剂以对肿瘤定位，在治疗过程中可以进行实时监测，位肿瘤的诊断和治疗提供了新的方向。
(3)本发明提供的葡萄糖氧化酶修饰的介孔二氧化锰药物组合物，需超声刺激才能发挥抗肿瘤效应，由于正常组织缺乏超声刺激，故可保证正常组织部位的安全性，具有很强的药物价值，是抗肿瘤药物上的创新，经济和社会效益巨大。