本发明涉及一种天然产物的新用途，特别涉及一种天然产物Echioidin的新用途。
背景技术：
1.致病菌介绍
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在自然环境中分布广泛，也是人和动物体表及 上呼吸道的常在菌，对人和家畜等都有严重的危害。金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症、菌 血症、败血症和各器官的严重感染。多年来抗生素应用于临床和生产使金黄色葡萄球菌得到 了较好的控制和治疗，然而随着抗生素的不断应用，尤其是不合理使用，导致了金黄色葡萄 球菌耐药性的产生。据有关报道，动物源性金黄色葡萄球菌对氨苄青霉素、氟喹诺酮类、苯 唑西林等抗生素耐药率都很高，给临床治疗金黄色葡萄球菌引起的感染带来了极大的困难。
大多数大肠杆菌(Escherichia coli)与人类有着良好合作，但是仍有少部分特殊类型的大 肠杆菌具有相当强的毒力，一旦感染，将造成严重疫情。其中最具代表性的就是代号为 O157：H7的大肠杆菌，它是EHEC(肠出血性大肠杆菌)家族中的一员。人体感染EHEC后， 会发生严重的痉挛性腹痛和反复发作的出血性腹泻，同时伴有发热、呕吐等表现，多为EHEC 产生的毒素所致。某些严重感染者毒素随血行播散造成溶血性贫血，红细胞、血小板减少； 肾脏受到波及时还会发生急性肾功能衰竭甚至死亡。通常情况下大肠杆菌对多种抗生素敏感， 但耐药的菌株也不少见。
由前文所述，自1929年英国细菌学家Fleming发明青毒素，于1940用于临床以来，天 然的及合成半合成的抗生素已有上千种。抗生素的有效使用对感染性疾病的防治起到十分关 键的作用，但与此同时，抗生素滥用的现象也很普遍，用量的增加，不仅造成浪费，而且不 良反应也增多，促使病原微生物产生了耐药性，并不断出现变异菌株，耐药性不断增强，最 终发展为多重耐药菌，导致临床治疗失败、感染复发、动物的抗病能力减弱。因而对于具有 广谱抑菌作用的治疗药物研究具有非常重要的现实意义。
2.天然产物Echioidin
国内外的研究显示，中药或天然植物提取物，可发挥对病原菌的直接杀灭作用及不产生 耐药性。黄酮类天然产物5，2’-dihydroxy-7-methoxyflavone 2’-O-β-D-glucopyranoside (Echioidin)，最早是1998年从印度南部的爵床科植物穿心莲Andrographis alata Nees (Acanthaceae)中分离得到的，参见文献：Journal of Asian Natural Products Research，1998，1(2)：133-138。穿心莲在药典中记载：清热解毒，凉血，消肿。用于感冒发热，咽喉肿痛，口 舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，毒蛇咬伤。但是，相关研究中未见其 提取物Echioidin对金葡菌等致病菌的抑制作用。
本发明通过Echioidin对金黄色葡萄球菌等2种致病菌进行体外抑菌试验，探讨Echioidin 抑菌活性的强弱，为确定Echioidin是否具有广谱抗菌作用提供依据，同时为研发天然抑菌药 物奠定基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种天然产物Echioidin的新用途，首先天然产物Echioidin可以 作为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑制剂，进一步地天然产物Echioidin作为制备抑菌液的原料。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明利用基于分子对接的虚拟筛选手段从现有天然产物数据库中筛选出具有广谱抑菌 作用的天然产物。
目标菌种包括：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。
根据蛋白口袋的大小以及待筛选分子库的分子量分布情况，选择了金黄色葡萄球菌中的 Sortase A、大肠杆菌中的PDHc-E1作为靶点蛋白来进一步筛选其相应的抑制剂。
Sortase A作用机理为：Sortase A是一个重要的半胱氨酸转肽酶，通过识别表面毒性蛋白 C端的LPXTG信号(亮氨酸、脯氨酸、X(任一种氨基酸)、苏氨酸和甘氨酸)来将其定位 在细胞表面的肽聚糖。作用位点中，Thr164，Val166，Val168，Leu169，Ile182形成疏水口袋； Cys184，Arg197，Trp194则可形成氢键。
PDHc-E1作用机理为：丙酮酸脱氢酶(E1)存在于丙酮酸脱氢酶复合体(PDHc)中， PDHc可促进丙酮酸盐氧化成为乙酰辅酶A，PDHc-E1为该反应的第一步，辅酶因子为ThDP 和Mg2+。作用位点中，Val192，Glu571，Gly231，Asn260，Lys392，Glu522，Leu264可形 成氢键作用，Phe602则可形成π-π相互作用。
最后，通过Echioidin对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌2种致病菌进行体外抑菌试验，探讨 Echioidin抑菌活性。
本发明的显著效果是：本发明首次公开了Echioidin对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制 作用，证明该化合物可以作为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制剂。
具体实施方式
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述 实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
1.Echioidin来源
Echioidin购买自Specs化合物公司(http：//www.specs.net/)中天然产物化合物库(Natural Products Database)，商品号：AK-693/40962748。
2.致病菌的复苏和菌悬液的制备
(1)金黄色葡萄球菌：营养琼脂培养基115℃高压灭菌20min，倾倒在平板培养皿内，以此 用作冻干菌株的复苏平板。利用平板划线法将冻干菌株接种于平板内，37℃培养24h后，挑 取单个生长的菌落至无菌生理盐水，配制成10mL金黄色葡萄球菌菌悬液，稀释调整为0.5 个麦氏比浊单位(约为1.5×108CFU/mL)。
(2)大肠杆菌：大肠杆菌工作用菌种的营养琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种至营 养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时，配制成10mL大肠杆菌菌悬液，稀释调整为 0.5个麦氏比浊单位(约为1.5*108CFU/mL)。临用时，取大肠杆菌的营养琼脂斜面培养物少 许，接种至5ml营养肉汤培养基内，制成悬液，在36±1℃培养18～24h后使用。
3.菌落计数
分别移取上述五种菌悬液500μL，加至装有4500μL无菌生理盐水的试管中，得到稀释 10倍的菌液。移取500μL稀释10倍的菌液至4500μL无菌生理盐水中，得到稀释100倍的菌 液。依次稀释，直至得到稀释108倍的菌液，移取1mL至平板内，倾入琼脂培养基12mL， 金黄色葡萄球菌37℃培养24h，痤疮丙酸杆菌厌氧37℃培养48h，大肠杆菌培养，淋病双球 菌培养，分别对生长的菌落进行计数。
4.抑菌实验操作
(1)管碟法测试中药抑菌活性
将45℃已融化的营养琼脂培养基19mL与稀释至1×108cfu/mL的金黄色葡萄球菌、大肠 杆菌1mL混匀，倾注于内径9cm的灭菌平皿内，待凝固。将牛津杯(内径6mm，外径8mm， 高10mm)轻放在相应位置上，分别加入200μL(或加入量达牛津杯4/5高度)配好的药物溶 液(浓度为0.5g/mL)。将平皿放入恒温培养箱中，37℃培养24h，取出，反转平皿，以肉眼 所见明显不生长真菌的区域为抑菌圈的边缘，用刻度尺从4个不同方向测量抑菌圈的直径， 计算平均值。
判断标准：抑菌圈直径在8mm以上者具有抑菌作用；抑菌圈直径在8mm及以下者无抑 菌作用；抑菌圈直径在8mm至10mm之间为低度敏感；10mm以上至15mm之间为中度敏感； 在15mm以上为高度敏感。
(2)微量稀释法检测最小抑菌度(MIC)
①药液稀释
采用试管两倍稀释法。分别选用2种致病菌，将所有消毒好的装有2mL含有酚红指示剂 培养基的试管平均分成4排，每排15支。在每排中用无菌刻度吸管吸取Echioidin溶液2mL 于每排的第一管中，混匀，再取出2mL到第2管中混匀。如此稀释至13支试管，混匀后取 出2mL弃去，第14、15两支试管不加药液。1～13号试管中药液的浓度分别为：250mg/mL、 125mg/mL、62.5mg/mL、31.3mg/mL、15.6mg/mL、7.81mg/mL、3.91mg/mL、1.95mg/mL、 0.977mg/mL、0.488mg/mL、0.244mg/mL、0.122mg/mL、0.061mg/mL。
②抑菌实验
在4排试管中分别加入稀释好的同一种菌液。从第1管到第13管分别加入2μL，第14 管加入菌液作为阳性对照，第15管不加菌液作为阴性对照，37℃培养24h观察抑菌结果。
③结果判断
若有细菌生长，细菌会发酵葡萄糖产酸，使酚红指示剂变成黄色，反之若无细菌生长则 培养基仍为红色。
5.试验结果
Echioidin在2048ug/ml浓度时对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑制作用。