搜风散结中药组合物及其应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，特别是涉及一种搜风散结中药组合物及其制药应用。

背景技术：

类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)被称为“不死的癌症”(罗安明等人.论癌症归属中医“痹痰”的范畴.中国中医基础医学杂志2015,21(01):14-15)，是以侵蚀性多关节炎为主要表现的全身性自身免疫病，ra早期表现为对称性关节炎，晚期关节僵硬和发生畸形，是一种致残率高，危害性大的常见病、疑难病。全世界范围内有0.5-1％的成人发病，女性发病率高于男性(chungim,etal.rheumatoidarthritis:thestridefromresearchtoclinicalpractice.internationaljournalofmolecularsciences,2016；17)。我国ra患病率约为0.3％-0.42％，有超过500万人口长期受到ra症状的困扰，特别是在经济欠发达地区，ra流行更为严重。患者常常因为疾病失去工作能力而导致家庭经济困难和社会负担的增加。ra的治疗药物以缓解病情的抗风湿药物(disease-modifyinganti-rheumaticdrugs，dmards)为主(ichikawan,etal.disease-modifyingantirheumaticdrugs.clincalcium,2012,22(2):215-221))，分为非生物制剂(tdmards)和生物制剂(bdmards)两类。tdmards的特点是起效缓慢、成本低、在ra炎症控制后，骨破坏仍在进行，难以抑制骨破坏的进展。bdmards起效迅速，但费用非常昂贵(每年医疗费用10万左右)，因其是单靶点起效，并不能适合所有患者复杂的病情，相当一部分患者疗效不理想；又因其有潜在诱发感染的副作用，难以被大多数患者所接受(dimitroulast,etal.biologictherapiesandsystemicbonelossinrheumatoidarthritis.autoimmunrev,2013,12(10):958-966)。目前临床上治疗ra多采用dmards+甲氨蝶呤联合用药(wassenbergs,etal.verylow-doseprednisoloneinearlyrheumatoidarthritisretardsradiographicprogressionovertwoyears:amulticenter,double-blind,placebo-controlledtrial.arthritisandrheumatism2005；52:3371-3380)，仅从症状缓解角度治疗ra，不能完全根治疾病，需要患者持续长时间用药，ra医疗费用成为我国卫生事业的沉重负担。因此加强对ra的药物研究已经成为我国重大疾病防治体系亟需解决的问题之一。

骨侵蚀是ra的主要特征。现代研究发现，ra骨侵蚀伴随ra整个病程，并且在ra发生的早期骨质丢失即已开始，往往是在病程的最初2年，病情处于活动期时，骨侵蚀发生的速度最快。且一旦骨质遭到破坏，则意味着其病理改变进入不可逆期，随着时间的推移，ra患者关节局部骨侵蚀可导致关节畸形和功能丧失，患病5-10年致残而使患者丧失劳动能力比例达33％-39％。目前临床上治疗ra的标准仅为缓解症状，还没有很好的根治方法。破骨细胞过度分化是导致ra骨侵蚀的重要原因，rankl是直接诱导产生破骨细胞的因子，nf-κb是rankl诱导破骨细胞分化与成熟的关键转录因子，破骨前体细胞表面的rank与rankl结合后，ikk被激活，导致iκbα的磷酸化，进而与泛素连接酶作用被泛素化，经蛋白酶降解，形成游离的nf-κb(p65)，入核后启动破骨相关基因(组织蛋白酶k，抗酒石酸酸性磷酸酶等)的转录(lorenzoj.themanywaysofosteoclastactivation.thejournalofclinicalinvestigation2017；127:2530-2532)。骨保护素(opg)，是破骨细胞生成抑制因子，在骨代谢调节中起关键性作用，可与rankl高度结合而阻碍rank同rankl的结合，其主要作用是抑制破骨细胞的分化和活化，促进破骨细胞凋亡，抑制骨吸收(corradoa,etal.osteoblastroleinrheumaticdiseases.intjmolsci.2017jun15；18(6))。在ra炎症状态下，各种炎症因子释放如tnf-a，il-6,，il-17等增加，促进了破骨细胞的分化，使破骨细胞活性增强、成骨细胞活性受限，造成骨代谢紊乱，导致骨侵蚀(1.abdelmeguidmh,etal.relationofinterleukin-6inrheumatoidarthritispatientstosystemicbonelossandstructuralbonedamage.rheumatolint.2013mar；33(3):697-703.2.luog,etal.tnf-aandranklpromoteosteoclastogenesisbyupregulatingrankviathenfkappabpathway.molecularmedicinereports2018；17:6605-6611.3.ganesanr,etal.interleukin17regulatesshp-2andil-17ra/stat-3dependentcyr61,il-23andgm-csfexpressionandranklmediatedosteoclastogenesisbyfibroblast-likesynoviocytesinrheumatoidarthritis.molecularimmunology2017；91:134-144)综上所述，骨侵蚀是目前ra治疗的瓶颈，破骨细胞过度分化是导致ra骨侵蚀的重要原因，rankl/nf-κb/nfatc1是介导破骨细胞分化的关键信号通路，多种促炎细胞因子促进破骨细胞的分化，因此ra的骨侵蚀，是由多途径，多机制引起的，单一靶点的药物的治疗，难以达到较好的效果。

目前临床上使用抗类风湿药物(dmards)主要是缓解患者关节肿胀及炎症，但是对骨侵蚀改善效果不显著。特异性靶向rankl的抗体药物，虽然能够减缓病情进展，但是对骨侵蚀没有确定的疗效。

技术实现要素：

发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种搜风散结中药组合物，及其在制备治疗骨侵蚀相关疾病药物中的应用，还提供了其在制备治疗类风湿性关节炎骨侵蚀以及类风湿关节炎药物中的应用。

技术方案：本发明公开的一种搜风散结中药组合物，包括以下组分：全蝎、蜈蚣、黄芪、黑豆衣。

优选的，所述搜风散结中药组合物(下称“搜风散结方”)由全蝎1.5g、蜈蚣1.5g、黄芪20g、黑豆衣30g配伍得到。

本发明还公开了所述搜风散结中药组合物在制备治疗骨侵蚀药物中的应用。

本发明还公开了所述搜风散结中药组合物在制备治疗类风湿性关节炎骨侵蚀药物中的应用。

本发明还公开了所述搜风散结中药组合物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

本申请经过研究发现所述搜风散结中药组合物可抑制关节部位各种炎症细胞中的il-6、rankl的表达，增加骨保护素opg的表达，增加骨密度和减少破骨细胞的数量，有效缓解cia小鼠关节的肿胀及降低关节滑膜的损伤，减轻cia小鼠的骨侵蚀。

配伍方解：本申请搜风散结方由全蝎、蜈蚣、黄芪、黑豆衣四味药组成。全蝎味辛，性平，归肝经，具有熄风镇痉，攻毒散结，通络止痛之功，其性善于走窜，穿筋透骨，为治疗久痹、顽痹之要药。蜈蚣味辛，性微温，归肝、心经，功专镇痉解毒，能通经络而熄肝风。二者相须使用，其力相得益彰，共为君药，搜风走窜，内而脏腑，外而经络，凡气血凝聚之处皆能开之。黄芪为臣，其味甘气微温，生者微凉，《本草汇言》云：“黄芪，补肺健脾、实卫敛汗、驱风运毒之要药也。”该书尚言，黄芪具体功效为“实卫而敛汗”、“济津而助汗”、“荣筋骨”、“生肌肉”。然痹痛患者多久病缠绵，耗气伤阴，黄芪一方面可以补益中土以扶正气，“荣筋骨”、“生肌肉”，加强通络之功；另一方面可以制约虫药过于辛散温通，缓解虫药攻窜耗气之弊。黑豆衣，味甘性平，入血分，归肾经。《本草求真》谓之“能治水消胀，下气制风热，而活血解毒”。故国医大师邹燕勤常用之以解毒祛风、养血利水，该药既可助黄芪健运中焦脾胃，使津血生化有源，使邪去而正不伤；还可以协同生黄芪佐制全蝎蜈蚣毒性，以防耗伤阴血，为佐使之药。全方攻补兼施，配伍得当。

根据ra的临床表现，中医将其归属“痹证”范畴。因此，使用搜风散结中药组合物来治疗ra符合中医辨证施治的理论思想，是对传统中药的继承与再开发。

有益效果：相比较于现有临床上使用抗类风湿药物(dmards)主要是患者缓解患者关节肿胀及体内炎症，但是对骨侵蚀改善效果不显著；特异性靶向rankl的抗体药物虽然能够减缓骨侵蚀，但是对炎症和关节肿胀没有明显的效果(kamijos,etal.ameliorationofbonelossincollagen-inducedarthritisbyneutralizinganti-ranklmonoclonalantibody.biochemicalandbiophysicalresearchcommunications.2006；347:124-132)。本申请搜风散结中药组合物不仅可以缓解cia小鼠的关节肿胀及炎症，还能够明显改善骨侵蚀，可能具有双重调节作用，有望开发成为相关疾病药物的新药。

附图说明

图1是搜风散结方缓解cia小鼠关节肿胀；

图2是搜风散结方改善cia小鼠关节破坏；

图3是搜风散结方抑制cia小鼠踝关节骨密度的降低；

图4是搜风散结方抑制cia小鼠关节炎症细胞浸润、软骨及滑膜的损伤；

图5是搜风散结方减少cia小鼠关节的破骨细胞数量；

图6是搜风散结方抑制cia小鼠关节rankl表达；

图7是搜风散结方促进cia小鼠关节骨保护素opg表达；

图8是搜风散结方抑制cia小鼠关节部位il-6表达；

其中，图5-图8中箭头指示为阳性染色的细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

药物来源：甲氨蝶呤，全蝎及蜈蚣饮片均来源于江苏省中西医结合医院药房。

搜风散结方的制备：取全蝎饮片，粉碎成粗粉，50-60℃烘干，再粉碎，过80目筛，取1.5g备用；取蜈蚣饮片，去头、足，粉碎，过80目筛，取1.5g备用；取上述全蝎、蜈蚣过80目粉碎物，重量比1:1，混匀。黄芪20克，黑豆衣30克煎煮后加入全蝎蜈蚣粉，混匀，制备成相应浓度的动物实验用药物。小鼠ra模型造模

将60只6-7周健康雄性dba/1j小鼠(从南京大学模式生物研究所购买)，采用完全随机分组方法，分为正常组10只和造模组50只。模型组小鼠全部采取牛ⅱ型胶原两次免疫的方法造模。第一次免疫，首先使用超声乳化仪在冰浴无菌试管中使完全弗氏佐剂(从chondrex公司购买)和牛ⅱ型胶原(从chondrex公司购买)完全乳化，使用1ml注射器吸取乳化液，每只小鼠距离尾根2cm处皮下插入针尖，避开尾静脉，向尾根部平行插入1.5cm距离尾根部0.5cm处注射100ul。第21天，进行第二次加强免疫，乳化胶原和不完全弗氏佐剂，距离尾根3cm插入针尖，皮下平行插入1.5cm，距离尾根部1.5cm处注射100ul乳化液。

一.ra动物分组和给药

二次免疫后，等造模小鼠发病率达到接近80％的时候将已造模成功的cia小鼠分三组：模型对照组，搜风散结方组，甲氨蝶呤阳性药组，并设定正常对照组。次日开始给药，搜风散结方灌胃给药(含生药9.72g/kg)组，甲氨蝶呤片(0.9g/kg，每周2次)组灌胃给药，模型对照组和正常对照组给予同体积蒸馏水，连续给药28天后，处死收样检测指标。

(1)实验前几天观察dba/1j小鼠的一般情况，包括毛发、精神状态、活动力、肌肉、关节，选择状态良好的小鼠进行造模及给药。首次免疫开始及每周记录小鼠体重，关节的变化情况，死亡情况。打分记录关节炎小鼠四肢发病程度：自第二次免疫后有小鼠开始发病起，对小鼠的发病情况每三天一次进行四肢打分记录。四肢关节炎评分标准(4分制)：0分：无红肿和肿胀的证据；1分：红斑和轻度肿胀局限于足中段(跗骨)或踝关节(一个脚趾有轻微红肿)；2分：红斑和轻度肿胀从踝关节蔓延至足中段(有2个或者2个以上的脚趾红肿)；3分：红斑和中度肿胀从踝关节蔓延至跖关节(踝关节或髋关节红肿)；4分：红斑和重度肿胀包括了踝，足和趾(所有的关节和脚趾均红肿，不能弯曲)。所有的四肢均单独计分，故每只小鼠最高分为16分。

(2)micro-ct仪器扫描不同组别的鼠足爪及各关节结构，将活体小鼠麻醉后在micro-ct仪器下进行足趾影像学分析观察小鼠足爪等各关节结构，比较各组小鼠关节变形及破坏程度，并通过骨密度分析软件比较各组小鼠关节的骨密度。

(3)取各组小鼠踝关节和滑膜组织，h&e染色，光镜下观察关节滑膜衬里细胞增生，衬里下层炎细胞浸润以及软骨破坏程度及血管翳形成等病理变化；(按照程度不同进行评分：0分：正常；1分：轻微局灶性浸润，极少炎性细胞浸润或轻微水肿；2分：中度浸润；3分：严重炎症浸润，但无血管翕形成及软骨损坏；4分：非常严重的浸润形成血管翕和或软骨，骨侵蚀)。

(4)取各组小鼠踝关节，经固定脱钙后，石蜡包埋、切片，trap染色观察各组中关节破骨细胞数量的变化。

(5)取各组小鼠踝关节石蜡切片，通过免疫组化检测各组关节的il-6、rankl、opg的表达情况。

二.结果

1.搜风散结方缓解cia小鼠关节肿胀：如图1所示，相比cia对照组小鼠足趾红肿，足部肿胀逐渐蔓延至踝关节，搜风散结方治疗后cia小鼠足趾以及踝关节的红肿明显减轻。

2.搜风散结方改善cia小鼠关节破坏程度：micro-ct仪器扫描不同组别的小鼠足爪及各关节结构。从图2所示，正常对照组小鼠骨表面光滑，结构完整；而模型对照组小鼠骨侵蚀严重，有的甚至形成空洞。经过搜风散结方治疗后，cia小鼠骨表面侵蚀程度得到明显改善，表明搜风散结方能有效延缓关节炎的骨侵蚀。

3.搜风散结方增加cia小鼠踝关节的骨密度：取各组小鼠踝关节，经micro-ct扫描后，分析测定各组cia小鼠踝关节的骨密度。由图3可以看出，cia对照组小鼠骨密度值相比正常组小鼠显著降低。搜风散结方治疗组小鼠骨密度值相比模型组小鼠显著升高。说明搜风散结方可以增高cia小鼠的骨密度，改善骨侵蚀。

4.搜风散结方抑制cia小鼠骨关节炎症细胞浸润、软骨及滑膜的损伤：取各组小鼠踝关节，经固定脱钙后，石蜡包埋、切片，h&e染色观察各组关节及滑膜的变化。如图4所示相比正常小鼠踝关节结构完整，滑膜光滑，无炎症细胞浸润，cia对照小鼠关节软骨及滑膜大量炎性细胞浸润导致滑膜增厚，软骨破坏，骨质侵蚀，关节结构严重破坏变形，搜风散结方明显减轻cia小鼠关节的膜增生和炎性细胞浸润，软骨破坏和骨侵蚀程度。

5.搜风散结方减少cia小鼠关节组织中的破骨细胞数量：取各组小鼠踝关节，经固定脱钙后，石蜡包埋、切片，trap染色观察各组中关节破骨细胞数量的变化。如图5所示相比正常对照小鼠踝关节几乎无可见的呈酒红色着色的破骨细胞，cia小鼠踝关节处发现大量破骨细胞，关节结构严重破坏变形，搜风散结方治疗组相比cia对照组破骨细胞数量明显减少。

6.搜风散结方抑制cia小鼠关节部位细胞rankl表达:取各组小鼠踝关节石蜡切片，通过免疫组织化学技术检测小鼠关节部位细胞中rankl表达。如图6所示相比正常小鼠踝关节中低表达的rankl，cia对照组小鼠高表达rankl，搜风散结方明显降低了关节部位的rankl的表达。

7.搜风散结方增加cia小鼠关节部位骨保护素opg的表达:取各组小鼠踝关节石蜡切片，通过免疫组化检测各组关节的opg的表达。结果如图7所示，相比cia对照组小鼠opg的表达，搜风散结方治疗组小鼠opg表达增多，说明搜风散结方可以增加cia小鼠关节的opg的表达。

8.搜风散结方对cia小鼠关节部位细胞中il-6表达的影响:取各组小鼠踝关节石蜡切片，免疫组化检测il-6的表达，结果如图8所示，相比于正常对照组，cia对照组小鼠il-6表达明显增多，搜风散结方治疗组踝关节细胞中il-6表达对比cia对照组明显降低。