本发明属于天然产物分离领域，涉及一种从柿叶中提取三萜类化合物的方法。
背景技术：
三萜类化合物是由一类基本木盒由30个碳原子构成的基本碳架，大多数三萜化合物是由6个异戊二烯单体联结而成，三萜类化合物大多为四环三萜和五环三萜，少数有链状、单环和三环等结构。
柿叶，为柿科植物柿的叶，具有止咳定喘，生津止渴，活血止血的功效，主治咳喘，消渴及各种内出血，臁疮等等，长期作为天然药物入药，含有多种活性物质，主要有黄酮、三萜等物质。
cn103724186a公开了一种贝壳杉烷型二萜的分离纯化方法，包括以下步骤：a、用无水乙醇溶解总二萜混合物粗品，得到溶解液；b、将步骤a的溶解液加入大孔树脂柱，利用不同浓度的乙醇梯度洗脱；c、识别收集含目标物的洗脱液，减压浓缩干燥，得到11α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸粗品；d、将步骤c所得11α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸粗品用混合有机溶剂溶解，得到溶解液；e、将步骤d的溶解液加入硅胶柱，利用混合有机溶剂阶段洗脱；f、识别收集含目标物的洗脱液，减压蒸馏得到高纯度的11α-羟基-15-氧-16-烯-对映贝壳杉烷-19-酸。此方法采用大孔树脂分离结合硅胶柱纯化的方法，得到高纯度化合物，该方法操作简便、成本低廉，适合于批量放大生产。此方法主要是利用柱层析、大孔树脂等吸附分离对映异构体，方法较为局限，不适用于其他萜类化合物。
cn103113194a公开了桑黄菌中一种新的桉烷型倍半萜的分离技术，首先制备桑黄菌粗提物，然后是正相硅胶层析，使用氯仿与甲醇梯度洗脱，重复一次正相硅胶层析，接着进行氯仿甲醇凝胶层析，再次进行正相硅胶层析，最后减压蒸干得到新的桉烷型倍半萜。此方法针对特定的桉烷型倍半萜进行分离，同样不具有普适性。
cn108164578a公开了一种万丈深总三萜提取物的制备方法及其在抗炎药物中的应用，首先将万丈深经粉碎后得到粗粉，将粗粉加入到甲醇中浸提，将浸提液减压浓缩后得到的甲醇浸膏；将得到的甲醇浸膏采用水进行分散后，加入乙酸乙酯进行萃取，将萃取液减压浓缩得乙酸乙酯浸膏；将得到的乙酸乙酯浸膏采用ab-8树脂进行纯化，洗脱液经减压浓缩、干燥后得到万丈深总三萜提取物。此方法虽然操作简单、成本低廉，易于工业化生产，但是，此方法主要采用甲醇、乙酸乙酯的方法进行提取，提取效率不高，收率还需要进一步加强。
目前从天然产物或者柿叶中提取三萜类物质主要采用柱色谱的方法，但是工艺的操作性较为复杂、产品收率低，导致产物的成本昂贵，不利于大规模应用。因此，如何开发一种工艺简单、无需使用酸碱、环保的方法对于三萜类化合物的应用具有重要意义。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种从柿叶中提取三萜类化合物的方法，以解决现有技术中存在的提取工艺复杂、提取收率低、提取过程中使用酸碱等造成的不环保的问题。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种从柿叶中提取三萜类化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将柿叶后使用醚类物质进行洗脱；
(2)将步骤(1)洗脱后的柿叶置于溶剂中，进行微波提取后再使用醚类物质洗脱后得到总三萜类化合物。
本发明提供的方法，通过醚类物质洗脱和微波提取的过程，除去了一部分脂溶性的杂质，提升了产物的纯度，并且由于微波的电磁场作用，迅速使得总三萜类化合物与柿叶分离，在使用相同质量原料的前提下，提取得到的总三萜类化合物质量更多，收率更高，避免了使用柱层析等复杂的分离工艺，节省了操作的成本。总三萜类化合物的收率可以达到5.20％～5.45％，纯度可达到60％以上。
本发明所述洗脱指的是使用液体溶剂将柿叶浸润后，溶解掉柿叶中的与三萜类物质不相关的物质，例如一些脂溶性成分，然后再将液体溶剂除去的过程。
优选地，步骤(1)中所述醚类物质包括乙醚、甲基叔丁基醚、石油醚中的任意一种或至少两种的组合；优选为甲基叔丁基醚。
本发明发现，柿叶中很多成分可以溶于醚类物质，而三萜类化合物在醚类的溶解性并不好，在适当的温度、液固比等条件下，醚类物质可以洗脱除去柿叶的一部分杂质尤其是脂类物质。
在本发明中，使用甲基叔丁基醚洗脱后的柿叶相比于使用其他醚类物质洗脱后的提取效果更好。在实际应用中，甲基叔丁基醚可以与汽油以任意比例互溶而不发生分层现象，因此其具有良好的油溶解性。但目前还没有应用到天然产物的提取当中。
优选地，步骤(1)中所述洗脱的温度为40～80℃，例如可以是40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃等，优选为50℃。
在本发明中，50℃洗脱时，去除杂质的效果最佳。
优选地，步骤(1)中所述柿叶经过粉碎处理成为粉状。
优选地，步骤(1)中所述醚类物质与柿叶的液固比为(4～8):1，例如可以是4:1、5:1、6:1、7:1或8:1等。优选为5:1。
本发明所述液固比的单位是ml/g。
在本发明中，适宜的液固比可以使得洗脱的效率更高，最优选5:1的液固比，能够使得杂质的去除效果达到最佳。
优选地，步骤(2)中所述溶剂与柿叶的液固比为(5～6):1，例如可以是5:1、5.1:1、5.2:1、5.3:1、5.4:1、5.5:1、5.6:1、5.7:1、5.8:1、5.9:1或6:1等。
优选地，步骤(2)中所述溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、乙醇或甲醇中的任意一种或至少两种的二者组合。
优选地，步骤(2)中所述溶剂为乙酸乙酯和乙醇的组合。
优选地，所述乙酸乙酯和乙醇的体积比为(3～7):1，例如可以是3:1、4:1、5:1、6:1或7:1等，优选为(4～5):1，优选为5:1。
在本发明中，虽然上述所列举的溶剂均可以作为萃取的溶剂，但是最终发现，当乙醇和乙酸乙酯搭配组成混合溶剂时，终产物的总三萜化合物产率和纯度均较高，而当乙酸乙酯与乙醇的体积比控制为5:1时，萃取效果最佳。并且乙醇和乙酸乙酯的毒性均较小。综合考虑，优选使用乙醇和乙酸乙酯组成的混合溶剂。
优选地，所述微波提取的微波功率为600～800w，例如可以是600w、620w、650w、700w、720w、750w、780w或800w等，优选为700～750w。
在微波提取的过程中，微波的功率对于溶解三萜化合物的效率会产生一定的影响，这是由于电磁场的作用强度与三萜化合物的溶解相关。优选700～750w时，微波提取的效率最高。
优选地，所述微波提取的时间为60～120s，例如可以是60s、65s、70s、75s、80s、85s、90s、95s、100s、105s、110s、115s或120s等，优选为90～100s。
单独使用微波进行提取时，总三萜化合物的收率一般为4.25％～4.55％之间。
优选地，步骤(2)中所述微波提取前还包括将柿叶进行超临界co2流体萃取。
在本发明中，本领技术人员可根据本领域熟知的超临界co2流体萃取的流程进行萃取操作。通过超临界co2流体萃取与微波提取联用，能够使得总三萜化合物的收率提升，总三萜化合物的收率一般在5.20％～5.45％之间。
优选地，超临界co2流体萃取的压力为20～40mpa，例如可以是20mpa、25mpa、30mpa、35mpa或40mpa等，优选为30mpa。
优选地，超临界co2流体萃取的温度为30～50℃，例如可以是30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等。
优选地，超临界co2流体萃取的时间为1～3h，例如可以是1h、1.5h、2h、2.5h或3h等。
优选地，超临界co2流体萃取的夹带剂用量为20～40ml，例如可以是20ml、25ml、30ml、35ml或40ml等，优选为25ml。
在本发明中，本领域技术人员可根据实际情况选择超临界co2流体萃取的夹带剂，一般可选地为乙醇、乙酸乙酯等等。
优选地，步骤(2)中所述醚类物质为石油醚。
在本发明中，步骤(2)中使用石油醚洗脱可以进一步去除部分杂质，提升产物的纯度。
优选地，步骤(2)中所述微波提取后，得到的提取液蒸干得到提取物，再使用醚类物质洗脱，洗脱后再将提取物进行干燥得到总三萜类化合物。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)将柿叶经过粉碎处理成为粉状后，使用醚类物质在温度为40～80℃下进行洗脱，其中醚类物质与柿叶的液固比为(4～8):1；
(2)将步骤(1)洗脱后的柿叶置于溶剂中，溶剂与柿叶的液固比为(5～6):1，然后将柿叶在压力为20～40mpa，温度为30～50℃条件下进行超临界co2流体萃取1～3h，其中夹带剂的用量为20～40ml，再在功率为600～800w条件下进行微波提取60～120s后得到提取液，蒸干得到提取物，再使用醚类物质洗脱，洗脱后再将提取物进行干燥得到总三萜类化合物。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的从柿叶中提取三萜类化合物的方法，通过醚类物质洗脱和微波提取的过程，除去了一部分脂溶性的杂质，提升了产物的纯度，并且由于微波的电磁场作用，迅速使得总三萜类化合物与柿叶分离，在使用相同质量原料的前提下，提取得到的总三萜类化合物质量更多，收率更高，避免了使用柱层析等复杂的分离工艺，节省了操作的成本，总三萜类化合物的收率可以达到5.20％～5.45％，纯度可达到60％以上，对于降低三萜类化合物的生产成本与大规模的应用具有重要的意义和实际价值。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种从柿叶中提取三萜类化合物的方法
(1)将柿叶经过粉碎处理成为粉状后，使用甲基叔丁基醚在温度为50℃下进行洗脱，其中甲基叔丁基醚与柿叶的液固比为5:1；
(2)将步骤(1)洗脱后的柿叶置于体积比为5:1乙酸乙酯和乙醇组成的混合溶剂中，混合溶剂与柿叶的液固比为5:1，然后将柿叶在压力为30mpa，温度为40℃条件下进行超临界co2流体萃取2h，其中夹带剂的用量为25ml，再在功率为700w条件下进行微波提取95s后得到提取液，蒸干得到提取物，再使用石油醚洗脱，洗脱后再将提取物进行干燥得到总三萜类化合物。
实施例2
本实施例提供一种从柿叶中提取三萜类化合物的方法
(1)将柿叶经过粉碎处理成为粉状后，使用石油醚在温度为80℃下进行洗脱，其中石油醚与柿叶的液固比为8:1；
(2)将步骤(1)洗脱后的柿叶置于二氯甲烷中，二氯甲烷与柿叶的液固比为4:1，然后将柿叶在压力为40mpa，温度为50℃条件下进行超临界co2流体萃取1h，其中夹带剂的用量为20ml，再在功率为600w条件下进行微波提取120s后得到提取液，蒸干得到提取物，再使用石油醚洗脱，洗脱后再将提取物进行干燥得到总三萜类化合物。
实施例3
本实施例提供一种从柿叶中提取三萜类化合物的方法
(1)将柿叶经过粉碎处理成为粉状后，使用石油醚在温度为40℃下进行洗脱，其中石油醚与柿叶的液固比为4:1；
(2)将步骤(1)洗脱后的柿叶置于丙酮中，丙酮与柿叶的液固比为3:1，然后将柿叶在压力为20mpa，温度为30℃条件下进行超临界co2流体萃取3h，其中夹带剂的用量为40ml，再在功率为800w条件下进行微波提取60s后得到提取液，蒸干得到提取物，再使用石油醚洗脱，洗脱后再将提取物进行干燥得到总三萜类化合物。
实施例4
本实施例提供一种从柿叶中提取三萜类化合物的方法
(1)将柿叶经过粉碎处理成为粉状后，使用乙醚在温度为40℃回流状态下进行洗脱，其中乙醚与柿叶的液固比为8:1；
(2)将步骤(1)洗脱后的柿叶置于甲醇中，甲醇与柿叶的液固比为7:1，然后将柿叶在压力为40mpa，温度为45℃条件下进行超临界co2流体萃取2.5h，其中夹带剂的用量为35ml，再在功率为600w条件下进行微波提取120s后得到提取液，蒸干得到提取物，再使用石油醚洗脱，洗脱后再将提取物进行干燥得到总三萜类化合物。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例步骤(1)中将甲基叔丁基醚替换为石油醚，其余与实施例1相同得到总三萜类化合物。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例步骤(1)中的温度为40℃，其余与实施例1相同得到总三萜类化合物。
实施例7
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例步骤(2)中溶剂为乙酸乙酯，其余与实施例1相同得到总三萜类化合物。
实施例8
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例步骤(2)中溶剂为乙醇，其余与实施例1相同得到总三萜类化合物。
实施例9
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例步骤(1)中液固比为8:1，其余与实施例1相同得到总三萜类化合物。
实施例10
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例步骤(2)中微波的提取功率为600w，其余与实施例1相同得到总三萜类化合物。
实施例11
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例步骤(2)中不包括超临界萃取的步骤，而是直接进行微波提取，其余与实施例1相同得到总三萜类化合物。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例步骤(2)中不包括超临界萃取和微波提取的步骤，仅使用溶剂萃取，其余与实施例1相同得到总三萜类化合物。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例步骤(1)使用乙醇进行洗脱，其余与实施例1相同得到总三萜类化合物。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例步骤(2)中不包括超临界萃取和微波提取的步骤，而是置于溶剂后，加热至90℃进行回流提取，提取液蒸干得到提取物，再使用醚类物质洗脱，洗脱后再将提取物进行干燥得到总三萜类化合物。
将实施例1-11与对比例1-3提取的总三萜类化合物进行收率测定和纯度测定。
纯度测定：将样品待测样品溶于甲醇中，采用高效液相色谱法进行检测：安捷伦液相色谱仪1200，g1311a四元梯度泵，g1314b紫外检测器；色谱柱为：agilentzorbaxsb-c18反相色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，柱温30℃；流动相：乙腈-水0-40min内，乙腈由5％到100％；流速0.6ml/min，检测波长210nm。
收率测定：绘制标准曲线，选用熊果酸为对照品，使用5％香草醛-冰醋酸溶液0.3ml，高氯酸1ml显色，60℃水浴45min后，在0℃下冷却，最后加冰醋酸定容至5.0ml，在最大吸收波长548nm出测定。做出标准曲线为y＝0.0163x-0.0015，r2＝0.9991。通过标准曲线方程换算总三萜的质量，收率即为总三萜的质量与柿叶质量的比值。
测定的结果如表1所示：
表1
通过实施例1-5的对比可知，不同的洗脱溶剂对于三萜类化合物的收率和纯度影响不同，实施例1中使用甲基叔丁基醚进行洗脱时，收率可达到5.42％，而使用其他醚类物质时，收率有所降低，收率在5.1％左右。
通过实施例1与实施例6的对比可知，步骤(1)中洗脱的温度对收率会产生较小的影响，当温度较低时，收率会有所下降。
通过实施例1与实施例7-8的对比可知，步骤(2)中使用乙酸乙酯和乙醇的混合溶剂时，产物的收率更为理想，相比于单独的溶剂，收率可以提升0.1％～0.2％左右。
通过实施例1与实施例9的对比可知，步骤(1)中洗脱时的液固比对于收率也会产生影响，优选的液固比是5:1，当液固比为8:1时，收率降低了0.1％左右。
通过实施例1与实施例10的对比可知，步骤(2)中的微波提取功率优选在700～750w之间提取的效果更好。
通过实施例1与实施例11、对比例1、对比例3的对比可知，超临界萃取和微波提取的联用，可以使得三萜类化合物的收率更高；而仅使用溶剂进行萃取或者回流萃取的方法，无法达到理想的提取效果。
通过实施例1与对比例2的对比可知，当洗脱溶剂不使用醚类物质时，产物的收率和纯度都出现了较大的降幅，纯度仅有50％左右，而使用醚类物质进行洗脱时，纯度一般在60％左右，并且收率较高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的从柿叶中提取三萜类化合物的方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。