一种3D打印柔性多孔支架材料及其制备方法与流程

本发明涉及再生医学技术领域，更具体地说，是涉及一种3d打印柔性多孔支架材料及其制备方法。

背景技术：

材料的结构和形貌特征决定着细胞的粘附、增殖和分化等生物学过程。宏观结构调节细胞的粘附和增殖，微观结构能够通过所担载的生长因子和药物的释放特性和其周边的细胞的营养物质的交换过程来影响细胞的生物学行为。因此，一个理想的组织工程支架，应该充分模拟细胞外基质的力学性能和生物学性能，使制备的支架具有良好的生物相容性、生物降解性，并且能够实现多级结构或梯度结构的精准控制，从而诱导组织的再生。

从原材料选择角度看，由于天然高分子如多糖类、胶原、明胶、蛋白质、多肽类等具有与细胞外基质的相似性、生物可降解性等优势被用于皮肤组织修复与再生的基质材料。如公开号为cn106668927a的中国专利公开了一种天然高分子材料护创贴，内层材料为海藻酸钠膜，外层覆盖物为聚酯/粘胶/纸质材料，有止血、抗感染、促进伤口愈合等功效；但是，由于天然高分子制备的支架力学性能差，还需要使用外层覆盖物。而中国专利cn106860918a公开了一种使用生物3d打印制备人工皮肤的方法，首先通过除脂、酶处理、盐析等过程处理胶原；然后将得到的胶原作为打印墨水进行3d打印，得到人工皮肤，打印室温度为4℃，打印接收台温度为37℃；最后进行后处理，包括：将打印的皮肤冷冻干燥，然后置于甲醛或戊二醛中交联6小时，并用磷酸盐缓冲液洗净，最后浸没于乙醇水溶液中冻干保存；但是，其使用鱼皮、软骨、肌腱、牛蹄筋、猪蹄作为基质材料进行生物3d打印，在用于皮肤组织修复时，有可能会产生免疫排斥反应，并且该方案采用了戊二醛作为交联剂用以提高材料的成型能力和力学性能，而不使用交联剂，很难获得一体化的组织工程支架；但是如果在后期处理时交联剂有残留，会给人体带来危害。

从加工工艺角度分析，目前3d打印技术主要包括：熔融沉积(fdm)成型技术、光固化(sla)技术、激光烧结技术(sls)等。fdm打印技术使用的是1.75-3mm直径的高分子纤维，高分子材料在打印头处熔融、挤出，然后在接收平台上形成器件结构；这就要求聚合物具备良好的可加工性，并且它的熔体状态和固化状态能够迅速转变，如果在熔融加工过程中加热时间过长或者温度过高，容易导致高分子的降解，并且聚合物熔融时黏度过大，也给加工带来困难，并且在高温条件下，生长因子等活性物质容易失活；这些缺点使该技术在组织工程领域的应用受到了限制。sla打印技术使用的是光固化成型技术，这种技术能够快速固化成型，打印精度很高，但在这种方法对材料的选择范围很有限，打印材料里面需要添加一系列的光固化引发剂单体等成分，这样打印的器件由于会残留单体和引发剂等物质，并且很难去除，在植入体内适合会引起很大的风险。sls技术使用的是激光烧结法进行3d打印，打印过程温度很高，这种方法适合金属材料的3d打印，也不适合担载组织工程支架所需的生长因子和药物。同时，以上几种方法制备的器件表面都呈现实体光滑结构，无微纳米结构的表面孔隙。

因此，再生医学领域亟需开发一种材料选择范围广、制备过程简单、可在低温下进行，并且能够担载生长因子或药物的3d打印技术。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种3d打印柔性多孔支架材料及其制备方法，本发明提供的制备方法材料选择范围广、制备过程简单、可在低温下进行，并且制备得到3d打印柔性多孔支架材料表面具有微纳米的孔隙结构，能够担载生长因子或药物。

本发明提供了一种3d打印柔性多孔支架材料的制备方法，包括以下步骤：

a)配制3d打印墨水；所述3d打印墨水的溶质为pla、plga、pcl和pc中的一种或多种；所述3d打印墨水的溶剂为nmp、dmf和dmso中的一种或多种；

b)在气源动力下，采用步骤a)得到的3d打印墨水在接收装置上进行3d打印，得到纤维支架；

c)将步骤b)得到的纤维支架进行溶剂置换，冷冻干燥后，得到3d打印柔性多孔支架材料。

优选的，步骤a)中所述3d打印墨水的浓度为0.2g/ml～0.45g/ml，粘度为50mpa.s～2000mpa.s。

优选的，步骤a)中所述溶质的重均分子量为10万～30万，分子量分布在1.8以下。

优选的，步骤b)中所述气源动力的压力为0.1mpa～0.4mpa。

优选的，步骤b)中所述接收装置为固定在接收板上的被接收液充分浸润的吸水材料；

所述接收液为浓度为0～99.5％的醇的水溶液。

优选的，步骤b)中所述3d打印的打印针头尺寸为200μm～500μm，打印温度为20℃～30℃，打印速度为30mm/s～80mm/s。

优选的，步骤b)中所述3d打印按照solidworks设计的模型进行打印；所述打印的纤维间距为200μm～500μm。

优选的，步骤c)中所述溶剂置换的过程具体为：

将得到的纤维支架浸泡在乙醇溶液中置换，去除溶剂。

优选的，所述浸泡在乙醇溶液中置换的时间为20h～30h。

本发明还提供了一种3d打印柔性多孔支架材料，采用上述技术方案所述的制备方法制备而成。

本发明提供了一种3d打印柔性多孔支架材料及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：a)配制3d打印墨水；所述3d打印墨水的溶质为pla、plga、pcl和pc中的一种或多种；所述3d打印墨水的溶剂为nmp、dmf和dmso中的一种或多种；b)在气源动力下，采用步骤a)得到的3d打印墨水在接收装置上进行3d打印，得到纤维支架；c)将步骤b)得到的纤维支架进行溶剂置换，冷冻干燥后，得到3d打印柔性多孔支架材料。与现有技术相比，本发明提供的制备方法采用溶剂置换-直写(oss-dw)3d打印技术，能够满足再生医学领域对3d打印技术的要求；该制备方法材料选择范围广、制备过程简单、可在低温下进行；采用生物相容性好、可生物降解的特定高分子材料的有机溶液作为3d打印墨水，通过相分离方法使挤出的纤维快速固型，再通过置换作用去除溶剂，使制备得到的纤维表面具有微纳米的孔隙结构，这种结构有利于生长因子、药物等活性物质的担载，并且粗糙的纤维表面有利于细胞的粘附及增殖。

另外，本发明提供的制备方法制备得到的3d打印柔性多孔支架材料的纤维韧性良好，多孔的柔性组织工程支架可用于组织损伤修复领域。

附图说明

图1为本发明实施例1中打印过程的示意图；

图2为本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料的外观与对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的外观的对比图；

图3为本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料和对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的表面微观sem形貌；

图4为本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料和对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的淬断面sem形貌；

图5为本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料和对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的力学性能对比图；

图6为本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料和对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的溶菌酶吸附能力的对比图；

图7为本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料吸附egf前后，小鼠胚胎成纤维细胞培养3天后的生长情况；

图8为实施例2～3制备得到的3d打印柔性多孔支架材料、对比例2及本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料(40％)的固形能力比较图；

图9为实施例5～8制备得到的3d打印柔性多孔支架材料、对比例3及本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料(nmp)的外观比较图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种3d打印柔性多孔支架材料的制备方法，包括以下步骤：

a)配制3d打印墨水；所述3d打印墨水的溶质为pla、plga、pcl和pc中的一种或多种；所述3d打印墨水的溶剂为nmp、dmf和dmso中的一种或多种；

b)在气源动力下，采用步骤a)得到的3d打印墨水在接收装置上进行3d打印，得到纤维支架；

c)将步骤b)得到的纤维支架进行溶剂置换，冷冻干燥后，得到3d打印柔性多孔支架材料。

本发明首先配制3d打印墨水。在本发明中，所述3d打印墨水的溶质为pla(聚乳酸)、plga(聚乳酸羟基乙酸)、pcl(聚己内酯)和pc(聚碳酸酯)中的一种或多种，更优选为plga。本发明采用上述聚酯材料，生物相容性好、可生物降解；本发明对其来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的市售商品或自制品均可(如plga可由pla和pga共聚而成)。在本发明中，所述溶质的重均分子量优选为10万～30万，更优选为20万；所述溶质的分子量分布优选在1.8以下。

在本发明中，所述3d打印墨水的溶剂为nmp(n-甲基吡咯烷酮)、dmf(n,n-二甲基甲酰胺)和dmso(二甲基亚砜)中的一种或多种，优选为nmp。本发明对上述溶剂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的市售商品即可。

在本发明中，所述3d打印墨水的浓度优选为0.2g/ml～0.45g/ml，更优选为0.3g/ml～0.4g/ml；所述3d打印墨水的粘度优选为50mpa.s～2000mpa.s，更优选为1000mpa.s～1600mpa.s。在本发明中，所述3d打印墨水的粘度越大，所需给料压力越大，否则会造成堆料或者断丝等情况。

配制得到3d打印墨水后，本发明在气源动力下，采用得到的3d打印墨水在接收装置上进行3d打印，得到纤维支架。在本发明中，所述气源动力的压力优选为0.1mpa～0.4mpa，更优选为0.2mpa～0.3mpa；所述气源动力的压力在打印过程中还需要与打印速度相匹配。在本发明中，所述气源动力的气源优选自空气、二氧化碳、氮气或氩气，更优选为氮气。

在本发明中，所述接收装置优选为固定在接收板上的被接收液充分浸润的吸水材料。在本发明中，所述接收液优选为浓度为0～99.5％的醇的水溶液；所述醇优选为甲醇或乙醇；当浓度为0时即为水。在本发明中，随着醇浓度的提高，置换速度增快，3d打印墨水中溶质固化成型速度增快；在本发明优选的实施例中，所述接收液为浓度为50％的乙醇溶液。本发明对所述吸水材料没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的滤纸或海绵均可。

本发明对所述3d打印的设备没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的3d打印机即可。在本发明中，所述3d打印的打印针头尺寸优选为200μm～500μm，更优选为300μm～400μm；所述3d打印的打印温度优选为20℃～30℃；所述3d打印的打印速度优选为30mm/s～80mm/s，更优选为50mm/s～60mm/s；打印速度需要与上述气源动力的压力互相匹配，在3d打印墨水的粘度和气源动力的压力一定时，打印过快会出现物料的堆积现象，打印过慢会出现断丝现象。

在本发明中，所述3d打印优选按照solidworks设计的模型进行打印；所述打印的纤维间距优选为200μm～500μm，更优选为300μm～400μm。

得到所述纤维支架后，本发明将得到的纤维支架进行溶剂置换，冷冻干燥后，得到3d打印柔性多孔支架材料。在本发明中，所述溶剂置换的过程优选具体为：

将得到的纤维支架浸泡在乙醇溶液中置换，去除溶剂。在本发明中，所述浸泡在乙醇溶液中置换的时间优选为20h～30h，更优选为24h。

本发明对所述冷冻干燥的过程没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的冷冻干燥的技术方案即可。

本发明提供的制备方法采用溶剂置换-直写(oss-dw)3d打印技术，能够满足再生医学领域对3d打印技术的要求；该制备方法材料选择范围广、制备过程简单、可在低温下进行；采用生物相容性好、可生物降解的特定高分子材料的有机溶液作为3d打印墨水，通过相分离方法使挤出的纤维快速固型，再通过置换作用去除溶剂，使制备得到的纤维表面具有微纳米的孔隙结构，这种结构有利于生长因子、药物等活性物质的担载，并且粗糙的纤维表面有利于细胞的粘附及增殖；另外，纤维韧性良好，可用于促进皮肤组织修复纤维支架。

本发明还提供了一种3d打印柔性多孔支架材料，采用上述技术方案所述的制备方法制备而成。本发明提供的制备方法制备得到的3d打印柔性多孔支架材料，相比于熔融沉积3d打印和生物3d打印制备的支架韧性更好，纤维表面粗糙且具有孔隙，有利于细胞的粘附和生长因子的担载，该多孔的柔性组织工程支架可用于组织损伤修复领域。

本发明提供了一种3d打印柔性多孔支架材料及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：a)配制3d打印墨水；所述3d打印墨水的溶质为pla、plga、pcl和pc中的一种或多种；所述3d打印墨水的溶剂为nmp、dmf和dmso中的一种或多种；b)在气源动力下，采用步骤a)得到的3d打印墨水在接收装置上进行3d打印，得到纤维支架；c)将步骤b)得到的纤维支架进行溶剂置换，冷冻干燥后，得到3d打印柔性多孔支架材料。与现有技术相比，本发明提供的制备方法采用溶剂置换-直写(oss-dw)3d打印技术，能够满足再生医学领域对3d打印技术的要求；该制备方法材料选择范围广、制备过程简单、可在低温下进行；采用生物相容性好、可生物降解的特定高分子材料的有机溶液作为3d打印墨水，通过相分离方法使挤出的纤维快速固型，再通过置换作用去除溶剂，使制备得到的纤维表面具有微纳米的孔隙结构，这种结构有利于生长因子、药物等活性物质的担载，并且粗糙的纤维表面有利于细胞的粘附及增殖。

另外，本发明提供的制备方法制备得到的3d打印柔性多孔支架材料的纤维韧性良好，多孔的柔性组织工程支架可用于组织损伤修复领域。

为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。本发明以下实施例所用的3d打印机为山东潍坊chduino3d打印机，型号为a8。

实施例1

(1)3d打印墨水的配制：配制0.40g/ml的plga的nmp溶液，plga的重均分子量为20万，分子量分布1.8；墨水的粘度为1600mpa.s。

(2)设置氮气动力压力为0.25mpa；打印针头尺寸为400μm；接收板上固定被接收液(浓度为50％的乙醇溶液)充分浸润的滤纸，作为打印的接收装置；打印温度为室温；

将步骤(1)得到的3d打印墨水加入直写成型3d打印机料筒，设置打印参数，按照solidworks设计的模型进行打印，打印速度为60mm/s，纤维间距为300μm，具体打印过程的示意图参见图1所示；得到plga纤维支架。

(3)将步骤(2)得到的plga纤维支架浸泡在乙醇溶液中置换24h，去除溶剂后冷冻干燥，得到3d打印柔性多孔支架材料。

对比例1

熔融沉积成型3d打印纤维支架；具体制备方法如下：

(1)3d打印墨水是与实施例1重均分子量和分子量分布相同的plga固体长丝。

(2)打印温度190℃，打印针头尺寸400μm，接收板温度为室温。

将步骤(1)中的固体长丝在打印针头处充分熔融、挤出，在室温下沉积成型；按照solidworks设计的打印参数和模型进行熔融挤出打印，打印速度为30mm/s，纤维间距为300μm，得到熔融沉积成型3d打印纤维支架。

相关表征：

(1)外观：本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料的外观与对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的外观的对比图参见图2所示，其中，左图为本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料的外观，右图为对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的外观。由图2可以看出，本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料的外观与对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的的透明度不同，对比例1中熔融加工过程使plga的结晶度发生变化，从而使plga透明性发生改变，进而影响到plga的力学性能，使其显刚性，并且该方法制备的支架表面形貌光滑(如sem图)。

(2)扫描电镜(sem)：本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料和对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的扫描电镜图参见图3～4所示；其中，图3为本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料和对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的表面微观sem形貌(a～c为本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料的表面微观sem形貌；d～e为对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的表面微观sem形貌)；图4为本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料和对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的淬断面sem形貌(f为本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料的淬断面sem形貌；g为对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架的淬断面sem形貌)。

(3)力学性能：本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料(oss-dw)和对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架(fdm)的力学性能对比图参见图5所示；其中，a为拉伸强度；b为断裂伸长率；c为应力-应变曲线。

(4)蛋白吸附能力：本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料(oss-dw)和对比例1中熔融沉积成型3d打印纤维支架(fdm)的溶菌酶吸附能力的对比图参见图6所示；其中，所述溶菌酶为一种模型蛋白。

(5)小鼠胚胎成纤维细胞状肌动蛋白(f-actin)和细胞核(dapi)染色：本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料吸附egf前后，小鼠胚胎成纤维细胞培养3天后的生长情况参见图7所示。

实施例2

采用实施例1提供的制备方法，区别在于：3d打印墨水为0.20g/ml的plga的nmp溶液；得到3d打印柔性多孔支架材料(20％)。

实施例3

采用实施例1提供的制备方法，区别在于：3d打印墨水为0.30g/ml的plga的nmp溶液；得到3d打印柔性多孔支架材料(30％)。

实施例4

采用实施例1提供的制备方法，区别在于：3d打印墨水为0.45g/ml的plga的nmp溶液；得到3d打印柔性多孔支架材料(45％)。

对比例2

采用实施例1提供的制备方法，区别在于：3d打印墨水为0.50g/ml的plga的nmp溶液；由于plga溶解不完全，不能得到3d打印柔性多孔支架材料(50％)。

实施例2～3制备得到的3d打印柔性多孔支架材料、对比例2及本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料(40％)的固形能力比较图参见图8所示。

实施例5

采用实施例1提供的制备方法，区别在于：3d打印墨水为0.40g/ml的plga的dmf溶液；得到3d打印柔性多孔支架材料(dmf)。

对比例3

采用实施例1提供的制备方法，区别在于：3d打印墨水为0.40g/ml的plga的dmso溶液；由于溶液粘度过大，出料困难，不能得到3d打印柔性多孔支架材料。

实施例6

采用实施例1提供的制备方法，区别在于：3d打印墨水为0.40g/ml的plga的dmf：dmso＝90:10溶液；得到3d打印柔性多孔支架材料(dmf：dmso＝90:10)。

实施例7

采用实施例1提供的制备方法，区别在于：3d打印墨水为0.40g/ml的plga的dmf：dmso＝80:20溶液；得到3d打印柔性多孔支架材料(dmf：dmso＝80:20)。

实施例8

采用实施例1提供的制备方法，区别在于：3d打印墨水为0.40g/ml的plga的dmf：dmso＝60:40溶液；得到3d打印柔性多孔支架材料(dmf：dmso＝60:40)。

实施例5～8制备得到的3d打印柔性多孔支架材料、对比例3及本发明实施例1制备得到的3d打印柔性多孔支架材料(nmp)的外观比较图参见图9所示。由图9可知，选择不同溶剂(nmp，dmso，dmf)或它们的共混溶剂，导致plga的固化成型速度不同，使用nmp作为溶剂的plga，在40％的浓度(0.40g/ml)下，打印的材料形貌更均匀。

所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。