本发明涉及一种骨伤科中药全粉末制剂的灭菌方法，属于药品及其制备方法的技术领域。
背景技术：
制药卫生是药品生产管理的一项重要内容，涉及到药品生产的全过程，在药品生产的各个环节，强化制药卫生管理，落实各项制药卫生措施，是确保药品质量的重要手段，也是实施GMP的具体要求。药品不仅要有确切的疗效，还必须使用安全，质量稳定可靠。药品一旦受到微生物的污染，在一定的条件下微生物就会生长繁殖，从而导致药品变质、腐败、疗效降低或失效，甚至可能产生对人体有害的物质，因此，严格的药品卫生标准是判断药品质量优劣的重要指标。
药品微生物灭菌方法以及微生物的限度的制定普遍受到各国的极大重视，20世纪60年代初一些发达国家相继将非规定灭菌药物染菌限度纳入国家标准，成为药品检验的常规检验项目之一。国家食品药品监督管理局(CFDA)颁布了新版GMP，对药物制剂的灭菌操作做了更详细的规定，《中国药典》2015年版也对微生物检测方法进行了修订，提出了更严格的要求。
国内传统的灭菌技术是以干热灭菌、湿热灭菌和环氧乙烷气体灭菌为主，这些方法利用物理、化学因素对微生物的化学成分和新陈代谢产生影响，从而达到灭菌的效果，灭菌效果可靠，操作简便，仪器设备较便宜，在制剂生产中得到了广泛的应用。辐射灭菌法是最近40年来发展起来的一种较新的灭菌技术，可常温灭菌，时间更短，穿透力强，适用于含挥发性成分、热敏性成分完好包装的药品，具有较好的发展前景。然而，上述方法也有不足，有的方法会破坏药物的有效成分，影响疗效；或有辐射残留、溶剂残留等，影响用药安全；或能耗大、时间长，影响经济效益。这些方法存在的缺陷和问题对中药及其制剂的质量影响非常大。
国际上灭菌技术的发展趋于冷灭菌新型灭菌技术的开发，如高压脉冲电场灭菌法，低温等离子体灭菌法以及常温瞬时超高压灭菌法等，相对于传统的高温灭菌法，具有处理时间短、耗能低、升温小、灭菌效率高和不影响药物有效成分等显著优点，尤其表现在对热敏性药品的灭菌中，因此，这些技术以其良好的应用特征被国外学者广泛研究。美国、德国、日本、加拿大等国家都竞相开展新型灭菌技术的研究，但大多还处于实验室研究、小试或中试阶段，尚未广泛应用于工业化生产，未能改变以传统灭菌方法为主导的生产现状。
灭菌操作既要除去或杀灭微生物，又要保证药物的质量稳定性、治疗作用及用药安全，因此灭菌时必须结合药物的性质、剂型等综合选择有效的灭菌方法，合理地运用灭菌技术。目前，中成药的灭菌尤其是含中药原粉或含有挥发性成分的制剂的灭菌技术仍旧是亟待解决的难题。
技术实现要素：
本发明针对现有中药全粉末制剂灭菌技术的不足，从灭菌原理、应用现状、优点和存在的问题对中药及其制剂中各种灭菌技术进行系统分析，对存在的问题探讨应对策略，并根据制剂药物成分特点和制剂的特性，结合目前国内、国际的中药制剂灭菌技术的经验，研究开发了一种高效率、成本低、灭菌效果显著、不影响药品原有质量的灭菌技术。
本品为全生药粉制备的水丸，处方共计32味中药，处方中当归、川芎、肉桂，醋乳香、醋没药等多味中药饮片含有挥发性成分，本次早期试验采用了干热灭菌法及湿热灭菌法，实验过程中，在高温、高湿的环境中，处方中挥发性成分损失较大，说明热力灭菌法不适用本品的灭菌。同时药味成分较多，动物药、植物药、矿物药均有，成分复杂，辐射灭菌对药品的质量可能会引起处方中化学成分、生物活性物质的变化，如造成蒽醌类成分的氧化；而且辐射残留检测技术还不是很成熟，其安全性在学术界仍有争议，故产品拟不使用辐照灭菌的方法。
常温间歇灭菌法灭菌温度在25℃～35℃之间，灭菌温度低，适用于不耐高温的灭菌，但不能杀灭芽孢，待芽孢发育成繁殖体后重复灭菌，循环3次以上，灭菌时间长，杀灭芽孢常不够完全。乙醇灭菌法通过渗透微生物繁殖体的细胞内，使蛋白质变性，从而杀灭繁殖体，但对于处于休眠期的微生物芽孢来说，由于芽孢较厚，乙醇不易穿透，造成乙醇对芽孢的杀灭效果不理想。经过对上述两种方法的初始试验研究，实验结果确定其方法灭菌效果不理想。本次研究结合两种灭菌方法的优点，各取所长，创造性的使用了75％乙醇灭菌+常温间歇灭菌法的综合灭菌方法。
前期试验研究，探索了影响灭菌效果的主要工艺参数和水平范围，确定乙醇的用量、第一次灭菌的时间、第二次灭菌的时间为影响灭菌效果的主要工艺参数；参数水平为75％乙醇用量(V)约占灭菌总药粉重量(W)的25％左右，第一次灭菌时间为7分钟左右；第二次灭菌时间为4分钟左右,75％乙醇用量(V)约占灭菌总药粉重量(W)的12.5％左右。小试试验研究：以75％乙醇的用量，第一次灭菌的时间，第二次灭菌的时间为考察因素，因素水平为上述参数水平值浮动±50％，以《中国药典》2015年版四部通则1105、1106的微生物限度的标准以及处方中异补骨脂素的总量为指标，采用正交试验L9(33)表对生药粉的灭菌因素以及水平进行方案设计，进行试验，优选出小试最佳灭菌工艺。
中试研究以及验证：按小试试验的优化工艺参数进行中试生产，对小试工艺参数进行确认和优化，并通过中试3批样品的放大生产对不同批次产品的重现性进行考察，考察并确立最终适宜的工艺参数。
一种中药制剂全粉末的灭菌技术，包括如下步骤：
(1)将处方药物混合粉碎，过80目筛；
(2)将步骤(1)所述过80目筛的混合粉末，密封于不锈钢桶中，加入75％乙醇，用量为药粉总重的四分之一，喷洒搅匀，密闭，进行闷润灭菌6分钟；
(3)将步骤(2)所述的第一次灭菌粉末取出，平摊于不锈钢托盘中，密闭晾干，持续时间为24小时；
(4)将步骤(3)所述的第一次灭菌粉末取出，置于不锈钢桶中，加入75％乙醇，用量为药粉总重的八分之一，喷洒拌匀，密闭，进行闷润灭菌4分钟；
(5)将步骤(4)所述的第二次灭菌的粉末取出，置于不锈钢托盘中，挥干溶剂，即可。
步骤(1)的操作过程中，制剂中含有植物药及矿物药，其中，植物药占多数，可以混合粉碎，并过80目筛，得到混合均匀的药物粉末；
步骤(2)中使用的75％乙醇，为经过预试验筛选的浓度，此浓度下，灭菌效果最佳；
步骤(3)中指出，将药粉和75％乙醇搅匀，并密闭，有助于75％乙醇渗入到药粉内部，灭菌效果更好；
步骤(4)中指出，第一次灭菌的是细菌的成熟体，需要常温放置24小时，待细菌芽孢成熟，进行第二次灭菌，即可达到灭菌效果。
本发明的有益效果是：
1.采用75％乙醇灭菌+常温间歇灭菌法的综合灭菌方法，与传统灭菌工艺如热压灭菌、干热灭菌、辐射灭菌灯做了详细的对比研究，本法比之传统灭菌方法，具有可常温灭菌，灭菌成本低，无辐射及化学试剂残留，灭菌效果理想的优点。
2.本灭菌方法操作简便，灭菌成本比之辐照灭菌降低至少50％，安全性更高；比之热压灭菌法和干热灭菌法，对药品的生物活性成分尤其是挥发性成分无影响，更能保证药品的质量。75％乙醇灭菌时间短，平均在5分钟左右，且乙醇为挥发性物质，不会产生溶剂残留，不会对人体造成损害，使用更安全。
3.使用正交设计L9(33)表设计实验，科学优选适宜的工艺参数，用较少的试验次数得到最优化的试验参数，改变了以往经验式探索参数的试验方式，不但节省实验成本，而且得到更加科学准确的试验结果。
4.质量指标：在样品符合剂型检验通则的基础上，采用微生物限度数据和样品的含量测定数据双指标，对灭菌的各项工艺参数进行优选，科学评价各灭菌方法的差异性。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例提供了制剂的配方、灭菌详细工艺及对灭菌后的效果进行了微生物限度和含量指标的测定，以确定灭菌效果。制剂每1000丸中由以下重量的中药饮片组成，如表1所示：
表1实施例1中制剂的配方表
将以上32味中药饮片，混合粉碎，过80目筛，将过80目筛的混合粉末放置于不锈钢桶内，将配置好的75％乙醇溶液，取药粉总重量的四分之一，喷散入药粉中，边喷洒边搅拌，直至拌匀，将不锈钢桶密闭10分钟。10分钟后，打开不锈钢桶，将药粉取出，平摊于已经灭菌的不锈钢托盘中，在密闭环境中放置24小时。将药粉再次置于不锈钢桶中，将配置好的75％乙醇溶液，取药粉总重量的八分之一，喷散入药粉中，边喷洒边搅拌，直至拌匀，将不锈钢桶密闭5分钟。5分钟后，打开不锈钢桶，将药粉取出，即可。依据《中国药典》2015年版四部1105、1106通则，进行检验，检验结果如下表2：
表2实施例1微生物检测结果
表2的结果表明,3批中试样品采用上述条件灭菌，灭菌效果很好，符合药典标准。
再根据含量测定方法进行检测采用HPLC法进行检测，结果如下表3：
表3实施例1含量测定结果
表3的结果表明，3批中试样品采用上述条件灭菌，灭菌效果良好，符合质量标准。
实施例2
处方与实施例1相同，但灭菌的工艺条件进行调整，灭菌过程如下：
将以上32味中药饮片，混合粉碎，过80目筛，将过80目筛的混合粉末放置于不锈钢桶内，将配置好的75％乙醇溶液，取药粉总重量的四分之一，喷散入药粉中，边喷洒边搅拌，直至拌匀，将不锈钢桶密闭8分钟。8分钟后，打开不锈钢桶，将药粉取出，平摊于已经灭菌的不锈钢托盘中，在密闭环境中放置24小时。将药粉再次置于不锈钢桶中，将配置好的75％乙醇溶液，取药粉总重量的八分之一，喷散入药粉中，边喷洒边搅拌，直至拌匀，将不锈钢桶密闭4分钟。4分钟后，打开不锈钢桶，将药粉取出，即可。依据《中国药典》2015年版四部1105、1106通则，进行检验，检验结果如下表4：
表4实施例2微生物检测结果
表4的结果表明,3批中试样品采用上述条件灭菌，灭菌效果很好，符合药典标准。
再根据含量测定方法进行检测采用HPLC法进行检测，结果如下表5：
表5实施例2含量测定结果
表5的结果表明，3批中试样品采用上述条件灭菌，灭菌效果良好，符合质量标准。
实施例3
处方与实施例1相同，但灭菌的工艺条件进行持续优化，灭菌过程如下：
将以上32味中药饮片，混合粉碎，过80目筛，将过80目筛的混合粉末放置于不锈钢桶内，将配置好的75％乙醇溶液，取药粉总重量的四分之一，喷散入药粉中，边喷洒边搅拌，直至拌匀，将不锈钢桶密闭6分钟。6分钟后，打开不锈钢桶，将药粉取出，平摊于已经灭菌的不锈钢托盘中，在密闭环境中放置24小时。将药粉再次置于不锈钢桶中，将配置好的75％乙醇溶液，取药粉总重量的八分之一，喷散入药粉中，边喷洒边搅拌，直至拌匀，将不锈钢桶密闭4分钟。4分钟后，打开不锈钢桶，将药粉取出，即可。依据《中国药典》2015年版四部1105、1106通则，进行检验，检验结果如下表6：
表6实施例3微生物检测结果
表6的结果表明,3批中试样品采用上述条件灭菌，灭菌效果很好，符合药典标准。
再根据含量测定方法进行检测采用HPLC法进行检测，结果如下表7：
表7实施例3含量测定结果
表7的结果表明，3批中试样品采用上述条件灭菌，灭菌效果良好，符合质量标准。
实施例4
处方与实施例1相同，但灭菌的工艺条件进行持续优化，灭菌过程如下：
将以上32味中药饮片，混合粉碎，过80目筛，将过80目筛的混合粉末放置于不锈钢桶内，将配置好的75％乙醇溶液，取药粉总重量的四分之一，喷散入药粉中，边喷洒边搅拌，直至拌匀，将不锈钢桶密闭5分钟。5分钟后，打开不锈钢桶，将药粉取出，平摊于已经灭菌的不锈钢托盘中，在密闭环境中放置24小时。将药粉再次置于不锈钢桶中，将配置好的75％乙醇溶液，取药粉总重量的八分之一，喷散入药粉中，边喷洒边搅拌，直至拌匀，将不锈钢桶密闭3分钟。3分钟后，打开不锈钢桶，将药粉取出，即可。依据《中国药典》2015年版四部1105、1106通则，进行检验，检验结果如下表8：
表8实施例4微生物检测结果
表8的结果表明,3批中试样品采用上述条件灭菌，灭菌效果不佳，不符合药典标准。
再根据含量测定方法进行检测采用HPLC法进行检测，结果如下表9：
表9实施例3含量测定结果
表9的结果表明，3批中试样品采用上述条件灭菌，灭菌效果良好，符合质量标准。
通过对实施例1、实施例2、实施例3以及实施例4的检测结果分析：各试验参数条件下，制剂的含量检测指标数据基本相同，说明，该灭菌方法对药物的成分基本不产生影响，没有破坏药物成分的现象发生。对微生物检测的数据分析表明，实施例1、实施例2以及实施例3微生物均符合药典标准，实施例4细菌总数超标，说明灭菌时间过短，灭菌效果不好。实施例1、实施例2、实施例3微生物检测限度均符合标准，但实施例3中，灭菌时间最短，灭菌速度快，能够节约时间成本，因此可选择实施例3的方式进行灭菌。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。