一种重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液及其制备方法和应用与流程

本发明涉及滴眼液的领域，更具体地说，它涉及一种重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液及其制备方法和应用。

背景技术：

角膜是眼前臂6/1处无血管生长的结缔组织，由于角膜暴露于各种恶劣环境下，极易受到化学，物理等外界刺激，导致角膜自体修复慢、病程长。同时，眼科手术后角膜完整性、透明性对视力的恢复也尤为重要。

目前，临床用于角膜修复的生物制品有小牛血清眼膏，贝复舒(重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液)，易贝(重组人表皮生长因子滴眼液)等，其中表皮生长因子通过与邻近创面基底膜的egf受体结合，使角膜边缘的基底膜细胞向表层移行，形成单细胞层，而后开始有丝分裂增殖，形成双层细胞加速角膜的修复；重组牛碱性细胞生长因子属于fgf家族，结合角膜上成纤维细胞特异性受体，促进细胞的有丝分裂与增殖，使胶原纤维增加，毛细血管增多，从而发挥促角膜修复作用[1生长因子对角膜上皮细胞损伤修复的作用]。目前国内上市的上述生物制品类角膜修复药物均有一定的局限性，因其都能促进毛细血管的增长，影响角膜透明性，导致视力降低。

据文献werners.keratinocytegrowthfactor:auniqueplayerinepithelialrepairprocess.cytokinegrowthfactorrev,1998,9(2):153-165报道，角质细胞生长因子也是成纤维细胞生长因子(fgf)家族的两员，为kgf-1(fgf-7)与kgf-2(fgf-10)，它通过结合只表达在上皮细胞的特异性受体结合促进不同组织上皮细胞的增殖、分化，降低细胞外部内部环境有毒物质的酶活，从而促进上皮细胞的更新和增殖，具有促进创伤性组织修复和愈合的作用。与成纤维细胞生长因子家族中其他因子不同的是，kgf在成纤维母细胞以及血管内皮细胞中促增殖作用不显著，这一特质有望成为角膜损伤修复的突破点。

kgf-1(fgf-7)已被开发用于治疗放化疗导致的口腔溃疡，是一种安全可靠的生长因子。gulsun、erdag等通过编码fgf-7基因修饰人二倍体角质细胞发现，使用基因改性的fgf-7的皮肤分泌水平显著提高且角质细胞的迁移增加，从而形成较厚的高增殖表皮。并且在细菌感染中测试时发现，表达fgf-7的皮肤的抑菌性能提高了约500倍，该项研究更加突出的显示fgf-7在皮肤修复中的作用。因此，kgf-1在上皮细胞的创伤修复方面有广阔的应用前景。

2008年，授权公告号为cn101537172b的中国专利公开了一种具有角膜上皮损伤修复作用的滴眼液及其制备方法，该滴眼液由重组人角质细胞生长因子-2与一定比例的抗氧化剂、螯合剂、稳定剂、渗透压调解剂、表面活性剂和合适的缓冲体系组成。上述专利表明该滴眼液能促进角膜损伤修复且不促进血管生长。nmpa已于2018年5月18日批准该公司的临床申请，公开数据表明，该滴眼液暂未开始临床试验。

本发明中的重组人截短型角质细胞生长因子-1来源为本公司自购建的菌种经发酵表达纯化制备而得。通过利用重组人截短型角质细胞生长因子-1的专一性和促进分裂分化和迁移的生物学活性、突变体的高活性和高稳定性制备成相应制剂，应用于促进角膜损伤修复，且不促血管生长。上述专利中的重组人角质细胞生长因子-2滴眼液以及本专利中重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液均为蛋白质类滴眼液，该类制剂重点关注蛋白质的稳定性与生物活性。

专利号为us8304387的美国专利中提到，重组人截短型角质细胞生长因子-1具有易形成不溶性聚集、对酸碱敏感的不稳定性质。因此，控制滴眼液的ph、溶解度等因素是提高滴眼液中重组人截短型角质细胞生长因子-1的稳定性与生物活性的关键。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液，其用于促进角膜修复且不促血管生长，具有稳定性与生物活性较高的优点。

本发明的第二个目的在于提供一种重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液的制备方法，其用于制备得到无菌的重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液。

本发明的第三个目的在于提供一种重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液的应用，使用该种重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液治疗角膜损伤且不促进血管生长，其具有良好的产业应用前景。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液，所述滴眼液由重组人截短型角质细胞生长因子-1和辅料组成，其中，所述重组人截短型角质细胞生长因子-1的氨基酸序列为seqidno:1，所述辅料由增稠剂、渗透压调节剂、蛋白保护剂、表面活性剂、柠檬酸盐缓冲盐体系组成。

通过采用上述技术方案，通过人角质细胞生长因子n端缺失23个氨基酸形成的重组人截短型角质细胞生长因子-1，其具有稳定性较高、且体内外生物学作用也保持不变的优点，利用人角质细胞生长因子-1有利于促进角膜上皮细胞的增殖和迁移而不影响血管内皮细胞生长的性质，进而达到促进角膜修复且不促血管生长的目的；

由于重组人截短型角质细胞生长因子-1具有易形成不溶性聚集、对酸碱敏感的不稳定性质，在上述辅料中，通过柠檬酸缓冲盐体系缓冲调节滴眼液的ph，并辅以蛋白保护剂保护重组人截短型角质细胞生长因子-1免受温度和震荡等外界因素变化的影响，从而提高重组人截短型角质细胞生长因子-1的稳定性；渗透压调节剂通过调节滴眼液渗透压，并辅以表面活性剂促进重组人截短型角质细胞生长因子-1溶解，使得滴眼液中的重组人截短型角质细胞生长因子-1与泪液等渗，在减少刺激的同时，提高滴眼液的角膜修复效果；增稠剂通过改变重组人截短型角质细胞生长因子-1的物理性状，从而降低液体表面张力，减弱蛋白质之间的相互碰撞，提高滴眼液贮存稳定性与病人的顺应性；

综上述所，重组人截短型角质细胞生长因子-1作为主要有效成分促进角膜修复且不促血管生长，并辅以辅料与重组人截短型角质细胞生长因子-1之间产生协同作用，最终达到提高重组人截短型角质细胞生长因子-1在滴眼液中的稳定性与生物活性的目的。

进一步地，所述重组人截短型角质细胞生长因子-1的浓度为0.01g/l-0.1g/l。

通过采用上述技术方案，重组人截短型角质细胞生长因子-1作为主要有效成分促进角膜修复且不促血管生长，同时角膜上皮细胞的dna生成与其呈剂量依赖性，故通过控制重组人截短型角质细胞生长因子-1的浓度，有利于达到较优的促进角膜修复的效果。

进一步地，所述辅料的浓度为：

通过采用上述技术方案，在选择较优的重组人截短型角质细胞生长因子-1的浓度后，对应地调节辅料的浓度，以选取更优的辅料浓度，进一步保证重组人截短型角质细胞生长因子-1在滴眼液中的稳定性与生物活性。

进一步地，所述柠檬酸盐缓冲盐体系由柠檬酸和柠檬酸钠组成，所述柠檬酸盐缓冲盐体系的ph为6-7。

通过采用上述技术方案，由于角膜损伤患者的泪液的ph通常高于正常人，通过柠檬酸钠与柠檬酸配组成柠檬酸盐缓冲盐体系，其具有较强的ph缓冲作用，有利于减少泪液与滴眼液混合环境中的ph变化量，同时有利于降低滴眼液的酸涩感，提高病人的依从性。

进一步地，所述蛋白质保护剂为组氨酸。

通过采用上述技术方案，组氨酸通过增加可溶性聚集、防止热破坏或增加蛋白质的转变温度的，以达到保护重组人截短型角质细胞生长因子-1的目的。

进一步地，所述增稠剂为聚乙烯醇。

通过采用上述技术方案，医药级的聚乙烯醇是一种合成高分子增稠剂，其具有良好的生物相容性，可应用于眼部滴眼液产品中；通过加入聚乙烯醇降低滴眼液的表面张力，减弱重组人截短型角质细胞生长因子-1的分子间碰撞，在兼顾重组人截短型角质细胞生长因子-1的稳定性与生物活性的同时，可以作为人工泪液成分润湿角膜表面，提高病人的依从性。

进一步地，所述表面活性剂为吐温20。

通过采用上述技术方案，通过在滴眼液中加入吐温20，有利于提高重组人截短型角质细胞生长因子-1的溶解度。

进一步地，所述渗透压调节剂为氯化钠和甘露醇，其中，所述氯化钠的浓度为2g/l-4g/l，所述甘露醇的浓度为15g/l-40g/l。

通过采用上述技术方案，甘露醇具有调节眼内压的作用，氯化钠具有调节细胞外液渗透压的作用，通过调节渗透压调节剂的种类与浓度，使滴眼液与泪液等渗或低渗，在减少刺激的同时，提高滴眼液的角膜修复效果。

为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液的制备方法，包括以下步骤：

s1将增稠剂分散于注射用水中，并在121℃热压灭菌，冷却至室温，得到增稠剂储备液；

s2将重组人截短型角质细胞生长因子-1、渗透压调节剂、蛋白保护剂、表面活性剂、柠檬酸盐缓冲盐体系依次溶解于注射用水中，用0.22μm的滤膜无菌过滤，得到重组人截短型角质细胞生长因子-1混合液；

s3在无菌条件下，将s1得到的增稠剂储备液与s2得到的重组人截短型角质细胞生长因子-1混合液混合均匀，并用无菌注射用水定容，得到重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液。

通过采用上述技术方案，由于制备过程采用无菌的三步法操作，制备方法简单快捷，因此无需加入抑菌剂，即可得到无菌要求合格的重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液，有利于减少滴眼液对眼部的刺激，提高病人的依从性。

为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液的应用，所述滴眼液应用于治疗角膜损伤，所述角膜损伤包括角膜酸碱烧伤、角膜烫伤、角膜溃疡、角膜手术损伤。

通过采用上述技术方案，重组人截短型角质细胞生长因子-1通过结合只表达在上皮细胞的特异性受体结合促进不同组织上皮细胞的增殖、分化，降低细胞外部内部环境有毒物质的酶活，从而促进上皮细胞的更新和增殖，且重组人截短型角质细胞生长因子-1在成纤维母细胞以及血管内皮细胞中促增殖作用不显著，因此通过采用重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液，应用于角膜酸碱烧伤、角膜烫伤、角膜溃疡、角膜手术损伤等角膜损伤，其具有良好的产业应用前景。

本发明通过重组人截短型角质细胞生长因子-1在制药领域中的应用，使用该种重组人截短型角质细胞生长因子-1制造药物，其具有良好的产业应用前景。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1.由于本发明利用重组人截短型角质细胞生长因子-1促进角膜修复且不促血管生长的特性，并辅以辅料，使辅料与重组人截短型角质细胞生长因子-1之间产生协同作用，最终达到提高重组人截短型角质细胞生长因子-1在滴眼液中的稳定性与生物活性的目的。

2.本发明的方法，通过采用三步法制备得到重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液，操作简易快捷。

3.本发明通过重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液治疗角膜损伤，其具有良好的产业应用前景。

附图说明

图1是本发明的实施例8的大鼠上皮缺损率统计图。

图2是实现本发明的实施例8的角膜荧光素钠染色图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

重组人截短型角质细胞生长因子-1的制备例

根据重组人截短型角质细胞生长因子-1的氨基酸序列(seqidno:1)而设计的cdna序列，委托人工全基因合成核苷酸序列，嵌入puc-57载体，命名为puc-57-△n23kgf。

以puc-57-△n23kgf质粒为模板，用ndeⅰ核酸内切酶和bamhⅰ核酸内切酶双酶切，回收目的片段，再用t4dna连接酶与质粒pet-3c(购于大连takara公司)同样经ndeⅰ和bamhⅰ酶切回收的片段连接，转化大肠杆菌克隆宿主菌top10，用酶切和pcr验证的方法筛选重组质粒pet-3c-△n23kgf。经dna测序证明重组质粒中△n23kgf的cdna序列正确后，将上述重组质粒转化至大肠杆菌表达宿主菌bl21(de3)plyss(购于))，最后经表达筛选获得pet-3c-△n23kgf/bl21(de3)plyss重组工程菌。

选取表达最佳的pet-3c-△n23kgf/bl21(de3)plyss重组工程菌，将其接种于含氨苄与氯霉素抗性的lb培养基中，培养至一定浓度时，接种于yt培养液，30℃培养，控制溶氧在30％以上，调节ph并保持在7.0。发酵液od600达到10-14时，加入终浓度为0.2mmol/l的iptg，继续培养诱导4小时后停止发酵。取离心后重组工程菌重悬于ph9.0的缓冲液中，高压破碎重组工程菌，收集上清液。而后，通过强阳离子交换层析捕获上清中蛋白，蛋白稀释至一定浓度，补入适量浓度的半胱氨酸帮助其二硫键形成，最后通过source30s柱层析进行纯化，得到重组人截短型角质细胞生长因子-1。

实施例

实施例1：一种重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液的制备方法：

s1将聚乙烯醇分散于500ml的注射用水中，在121℃热压灭菌，冷却至室温，得到增稠剂储备液；

s2将重组人截短型角质细胞生长因子-1、柠檬酸盐缓冲体系、组氨酸、甘露醇、氯化钠、吐温20和2mg蔗糖溶解于400ml注射用水中，用0.22μm滤膜无菌过滤，得到重组人截短型角质细胞生长因子-1混合液；

s3在无菌条件下将s1所得的增稠剂储备液和s2的重组人截短型角质细胞生长因子-1混合液混合均匀，用无菌注射用水定至1l，然后用0.22μm除菌级滤膜过滤，得到重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液；

s4将上述重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液无菌灌装，得到0.5ml-1.0ml的成品滴眼液。

其中，重组人截短型角质细胞生长因子-1的氨基酸序列为seqidno:1，柠檬酸盐缓冲体系由柠檬酸和柠檬酸钠组成，其ph为6.5。各组分及其用量如表1所示。

实施例2：与实施例1的不同之处在于，各组分及其用量如表1所示。

实施例3：与实施例1的不同之处在于，各组分及其用量如表1所示。

实施例4：与实施例1的不同之处在于，各组分及其用量如表1所示。

实施例5：与实施例1的不同之处在于，各组分及其用量如表1所示。

对比例

对比例1：与实施例1的不同之处在于，各组分及其用量如表1所示。

对比例2：与实施例1的不同之处在于，各组分及其用量如表1所示。

表1

由于重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液为蛋白质类滴眼液，该类制剂重点关注蛋白质的稳定性与生物活性，且制备重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液应当符合2015年版滴眼液项下的规定。因此，需要考察上述滴眼液在外观、ph、重组人截短型角质细胞生长因子-1含量和细胞活性(ec50)等方面的性能。

实施例6：重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液的稳定性考察

1)重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液中重组人截短型角质细胞生长因子-1的含量测定，采用humankgf/fgf-7(catalognumber:dy251)试剂盒以定量测定重组人截短型角质细胞生长因子-1。

含量测定方法：将小鼠抗fgf抗体包被于96孔板上；适当清洗后加入待测重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液和标准品于室温反应2h；适当清洗后再以生物素标记的山羊抗fgf抗体侦测抗体，于室温反应2h；最后再加入辣根氧化酶标记链霉亲和素室温反应20min，加入tmb显色液避光显色20min，最终用2m硫酸终止反应，于450nm波长下进行测定。

2)重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液的生物活性测定，重组人截短型角质细胞生长因子-1生物活性采用本公司转染fgfr2ⅲ3b受体的重组baf-3-fgfr2ⅲ3b细胞进行体外活性测定。

生物活性测定方法：将不同稀释倍数的重组人截短型角质细胞生长因子滴眼液及标准品分别以100μl/孔的量加入96孔板并做复孔；将对数生长期的baf-3-fgfr2ⅲ3b细胞悬浮液1000rpm离心5min，用rpmi1640洗涤3次后用样品测活培养液重悬细胞至5×10⁵个/ml，依次加入上述96孔板，每孔100μl；然后将96孔板置于37℃，5％co2条件下，培养细胞72小时；72小时后各孔依次加入cck-8试剂10μl，在37℃，5％co2下继续培养反应8小时，于450nm下测定结果。用“sigmaplot”软件做四参数回归曲线拟合，进而计算其半效浓度(ec50)。

3)稳定性试验

测定方法：分别将实施例1-5与对比例1的滴眼液灌装于3ml西林瓶中，压塞，轧盖，置于25±2℃进行加速考察，分别于0天、1个月、3个月进行外观、无菌、ph、含量、细胞活性检验。检验结果如表2所示。

表2

从表2可以看出，考察期间采用上述制备方法得到的滴眼液的外观、无菌指标均符合2015年版滴眼液项下的规定。实施例1-5的ph变化值在±0.1内，几乎无变化；而对比例1-2的变化值均大于0.1。稳定性试验的关键质量属性为含量与细胞活性，在25℃±2℃下考察1个月、3个月时实施例1-5均优于对比例1-2。综上所述，通过采用重组人截短型角质细胞生长因子-1、柠檬酸盐缓冲体系、组氨酸、甘露醇、氯化钠、吐温20和聚乙烯醇制备得到的滴眼液，其符合2015年版滴眼液项下的规定，且具有较好的稳定性和生物活性。

实施例7：重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液碱烧伤模型药效学研究

健康新西兰大白兔(体重2kg-3kg)，雌雄并用。随机分组75只动物，每组25只动物，以滤纸圆片于naoh溶液中浸透，小心贴敷于已固定眼球位置的右眼角膜正中区数分钟，取下滤纸圆片后立即用生理盐水冲洗角膜和角膜囊，即制成角膜碱烧伤模型。以阴性对照品为不含重组人截短型角质细胞生长因子-1的滴眼液，辅料组成同实施例3；本发明样品为实施例3滴眼液为供试品；阳性对照药为重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液(贝复舒、珠海亿胜)，均以每日4次，每次1滴的剂量给药，连续给药14天。分别在治疗1天、2天、4天、6天、10天、14天时将荧光素染色裂隙灯显微镜标准照相照片，经过计算机图像系统测量分析出各组不同时间角膜上皮愈合面积和角膜上皮愈合率。同时在治疗的1天、6天、14天用裂隙灯显微镜观察测量、照相本发明组与阳性对照组动物的角膜新生血管长度，以robert模型计算新生血管面积，分析各组不同时间对新生血管的影响。

结果表明：本试验建立的新西兰大白兔角膜碱烧伤模型中，给药前角膜碱烧伤的面积为45-55mm2。本发明组在给药2天后即可见有完全愈合的兔眼，随着给药天数的增加，完全愈合的兔眼数量亦增加，给药10天时阴性对照组、本发明组、阳性对照组兔眼完全愈合率分别为21％、86％、79％；新生血管观察得知，14天时本发明组、阳性对照组的新生血管面积分别为6933±1022、15203±4100。

由上可知，重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液可显著促进兔角膜碱烧伤的愈合，本发明组治疗效果与阳性对照药无显著差异；另本发明组滴眼液与阳性对照组滴眼液在促进角膜新生血管方面有显著性差异。重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液可促进碱烧伤角膜愈合且不促进新生血管生长。

实施例8：重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液手术损伤模型药效学研究

将健康无眼疾sd大鼠，气体麻醉后，盐酸利多卡因点右眼表面麻醉，用直径4mm的角膜环钻置角膜正中压痕，环内注入20％酒精40μl，浸泡角膜30s后用胶原海绵吸除环内酒精，立即用生理盐水冲洗角膜，用角膜上皮刀刮除与环钻直径大小相同的中央角膜上皮，造模后立即行角膜上皮荧光素染色，染色面积93-100％，如图2所示。造模成功后动物随机分3组，每组有35只大鼠，分别为，阴性对照组：辅料同实施例3，不含重组人截短型角质细胞生长因子-1；本发明组：实施例3的滴眼液；阳性对照组：重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液(贝复舒、珠海亿胜)。上述三组均以每日3次、每次50μl的剂量给药，连续给药7天。以1％荧光素钠染色，利用ipp6.0软件测量角膜上皮缺损面积，origin9.0统计软件进行分析，角膜上皮缺损率＝角膜上皮荧光染色面积/整个角膜面积。

如图1所示，造模后各时间点，角膜无明显异常，都表现为较为透明，大鼠晶状体可见。角膜上皮修复较为迅速,一周后各组动物角膜缺损率分别为：阴性对照组：30.2±2.28％；本发明组：4.8±2.45％；阳性对照组7.23±3.21％。说明本发明组与阳性对照组大鼠角膜上皮缺损基本修复，本发明组重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液具有促进角膜损伤修复的作用。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

序列表

<110>重庆派金生物科技有限公司

<120>一种重组人截短型角质细胞生长因子-1滴眼液及其应用

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