一种罗布麻叶多酚的用途的制作方法

本发明属于中药植物多酚的生物活性领域，涉及一种罗布麻叶多酚的用途，具体涉及罗布麻叶多酚在制备治疗高糖损伤引起视网膜病变的药物或保健品中的用途。通过细胞实验证实它具有改善高糖损伤引起视网膜病变。

背景技术：

罗布麻(apocynumvenetuml.)，夹竹桃科罗布麻属罗布麻属，据《中国植物志》记载，又称为茶叶花、野麻、泽漆麻、女儿茶、茶棵子、红麻、红花草、牛茶等，在我国分布于新疆、青海、甘肃、陕西、山西、河南、河北、江苏、山东、辽宁及内蒙古等省区。

罗布麻(apocynumvenetuml.)，是我国的一种天然植物，在民间有广泛的药用价值，《本草纲本》记载其有平心悸、止眩晕、消喘止咳、强心利尿之功，也收录于2015版《中国药典》第一部211页，“味甘、苦、凉。归肝经。平肝安神，清热利水。用于肝阳眩晕，心悸失眠，浮肿尿少”。

根据国际糖尿病联盟，全球约有4.25亿20至79岁的成年人患有糖尿病，预计2045年，全球将有6.28亿人，即每10个成年人中就有1人患有糖尿病。越来越多的糖尿病患者受到由糖尿病引起的并发症的影响，有些并发症影响日常活动和生活质量，而另一些并发症严重到危及生命的程度。

糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,dr)是糖尿病高度特异性的微血管并发症，在早期可能不明显，但可导致视力损害和失明。糖尿病可引起两种类型视网膜病变，增殖性和非增殖性视网膜病变，糖尿病性视网膜病变是主要致盲眼病之一。基本病理改变包括：周细胞的选择性丢失、基底膜增厚、微血管瘤的形成、内皮细胞增生和新生血管形成。据估计，每3名糖尿病患者中就有1人受该病影响，它是20至65岁人群失明的主要原因之一。

多元醇通路，又称山梨醇通路，是组织细胞葡萄糖代谢的重要途径，其通路异常是糖尿病视网膜病变重要发病机制之一。由醛糖还原酶(aldosereductase,ar)及山梨醇脱氢酶(sorbitoldehydrogenase,sdh)共同构成。醛糖还原酶主要存在于晶状体、视网膜、神经及肾脏等组织中，ar以nadph为辅酶,催化己糖的还原反应,将葡萄糖转化为相应的还原产物山梨醇，然后山梨醇再在山梨醇脱氢酶与辅酶i(nad+)的作用下氧化成果糖。血糖浓度升高时，己糖激酶被葡萄糖饱和，ar被激活表达增强，山梨醇水平增高，细胞内过多的葡萄糖通过ar转化为山梨醇，导致细胞内山梨醇和果糖积累，造成细胞损伤，诱发糖尿病视网膜病变。

糖尿病视网膜病变会有不同程度视网膜上皮细胞arpe-19损伤，多元醇通路异常，醛糖还原酶活性增强，胞内na⁺-k⁺-atp酶活性下降，山梨醇积累。现有上市醛糖还原酶抑制剂依帕司他，但有时会伴随红斑、水疱、呕吐等过敏症状及胃部不适等副作用，且患者不能长期服用。目前对罗布麻叶多酚的活性研究以抗氧化、降血压、抗抑郁的活性研究较多，关于罗布麻叶多酚在糖尿病视网膜病变还未见报道。

本发明利用发明专利20130509440.5名称为一种罗布麻叶多酚的制备方法及用途中获得的罗布麻叶多酚对其进行了高糖损伤引起视网膜病变的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种罗布麻叶多酚的用途，该罗布麻叶多酚是从罗布麻叶中经过提取、纯化、精制得到，通过体外细胞实验表明该罗布麻叶多酚具有在改善高糖损伤引起的视网膜病变的能力，它能显著的增加高糖诱导的高糖损伤人视网膜色素上皮arpe-19细胞模型的na⁺-k⁺-atp酶活性，降低山梨醇含量，显示出其具有调节多元醇通路，从而改善高糖损伤引起的视网膜病变。

本发明所述的一种罗布麻叶多酚的用途，所述罗布麻叶多酚在制备治疗高糖损伤引起视网膜病变的药物中的用途。

一种罗布麻叶多酚的用途，所述罗布麻叶多酚在制备治疗高糖损伤引起视网膜病变的保健品中的用途。

本发明所述的罗布麻叶多酚基于发明专利20130509440.5名称为一种罗布麻叶多酚的制备方法及用途，获得的罗布麻叶多酚，具体操作按下列步骤进行：

a.取罗布麻干燥叶，用质量体积比10-30倍量的的浓度为30-70％乙醇水浴加热，水浴温度为40-80℃提取1-3次，每次提取1-3小时，收集提取液；

b.提取液减压浓缩至浓度6mg/ml，大孔树脂纯化，吸附后水洗除杂，水洗体积2-5bv，再用30％-70％的乙醇洗脱，洗脱量2-4bv；

c.收集乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到罗布麻叶多酚。

本发明所述的罗布麻叶多酚的用途，所述罗布麻叶多酚在制备治疗高糖损伤引起视网膜病变的药物中的用途，所采取的技术方案如下：

本发明采用高糖诱导，构建人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)高糖损伤模型；检测细胞内na⁺-k⁺-atp酶活性和山梨醇含量，结合统计分析手段，对照组、高糖损伤组及给药组arpe-19细胞内na⁺-k⁺-atp酶活性和山梨醇含量变化，深入分析罗布麻叶多酚对糖尿病视网膜病变改善作用；结果表明：罗布叶麻多酚对人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)存活力未见明显影响，高糖损伤的人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)，其多元醇通路中的na⁺-k⁺-atp酶活性显著下降和山梨醇含量明显增多，通过罗布麻叶多酚对人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)高糖损伤模型进行干预，表明罗布麻叶多酚对于糖尿病视网膜病变具有显著的保护作用，可以在防治此类糖尿病视网膜病的药物中应用。

本发明通过罗布麻叶多酚的干预治疗作用，揭示罗布麻叶多酚对高糖损伤诱导视网膜病变具有显著的保护作用，为高糖损伤诱导视网膜病变提供了新的途径，对于罗布麻叶功能更进一步深入研究具有重要意义和价值，有很广阔的潜在市场和应用。

附图说明

图1为本发明高糖损伤对人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)na⁺-k⁺-atp酶活力的影响图；

图2为本发明高糖损伤对人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)山梨醇的影响图；

图3为本发明不同浓度罗布麻叶多酚对人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)活力的影响图；

图4为本发明不同浓度罗布麻叶多酚对高糖损伤人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)na⁺-k⁺-atp酶活力的影响图；

图5为本发明不同浓度罗布麻叶多酚对高糖损伤人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)山梨醇的影响图，其中：*p<0.05vs.模型组，**p<0.01vs.模型组。

具体实施方式

实施例1

a、取罗布麻干燥叶25g，用质量体积比25倍量的浓度为30％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为50℃，提取3次，时间2h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、采用真空旋转蒸发仪，温度45℃，将步骤a提取液浓缩至总多酚6.0mg/ml，再将浓缩液用型号为hpd-450大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为1bv/h，然后水洗，水洗脱体积为3bv，水洗流速2bv/h，再用浓度为40％乙醇洗脱，乙醇洗脱量为4bv，乙醇洗脱速度2bv/h；

c、收集b步骤的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到罗布麻多酚。

实施例2

a、取罗布麻干燥叶25g，用质量体积比10倍量的浓度为50％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为70℃，提取3次，时间2h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、采用真空旋转蒸发仪，温度45℃，将步骤a提取液浓缩至总多酚6.0mg/ml，再将浓缩液用型号为hpd-300大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为1bv/h，然后水洗，水洗脱体积为4bv，水洗流速3bv/h，再用浓度为50％乙醇洗脱，乙醇洗脱量为4bv，乙醇洗脱速度2bv/h；

c、收集b步骤的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到罗布麻多酚。

实施例3

a、取罗布麻干燥叶25g，用质量体积比30倍量的浓度为70％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为70℃，提取3次，时间2h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、采用真空旋转蒸发仪，温度45℃，将步骤a提取液浓缩至总多酚6.0mg/ml，再将浓缩液用型号为hpd-600大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为1bv/h，然后水洗，水洗脱体积为5bv，水洗流速4bv/h，再用浓度为70％乙醇洗脱，乙醇洗脱量为3bv，乙醇洗脱速度2bv/h；

c、收集b步骤的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到罗布麻多酚。

实施例4

a、取罗布麻干燥叶25g，用质量体积比10倍量的浓度为50％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为70℃，提取3次，时间2h，收集提取液，减压回收乙醇；

b、采用真空旋转蒸发仪，温度45℃，将步骤a提取液浓缩至总多酚6.0mg/ml，再将浓缩液用型号为hpd-300大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为1bv/h，然后水洗，水洗脱体积为4bv，水洗流速3bv/h，再用浓度为50％乙醇洗脱，乙醇洗脱量为4bv，乙醇洗脱速度2bv/h；

c、收集b步骤的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到罗布麻多酚。

实施例5

将实施例1-4获得罗布麻多酚的用途的生物活性筛选：用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)、dl-甘油醛混合液作为底物，以在阳性药槲皮素为对照，利用酶标仪进行醛糖还原酶抑制剂的高通量筛选，根据定量且过量的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)存在时，以dl-甘油醛为底物，通过检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)的减少来反映醛糖还原酶(aldosereductase,ar)的活性，酶反应体系组成如下：磷酸缓冲盐溶液(ph7.4)，醛糖还原酶，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)，dl-甘油醛，醛糖还原酶特异抑制剂槲皮素(6.25μg/ml)，反应体系混匀后闭光放置30min，置比色仪上测定340波长条件下的吸收值(a)，测定结果减去本底值后计算酶活性；

抑制率(i％)＝[(od340空白-od340样品)/od340空白]×100％

筛选结果：

结论：从实验结果表明，罗布麻多酚具有抑制醛糖还原酶活性的功效。

实施例6

细胞培养及构建人视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium,arpe-19)高糖损伤模型：人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)细胞用含有10％胎牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml的杜尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium,dmem)/f12培养基(d-葡萄糖浓度：4.5mmol/l)，在温度37℃、浓度5％co2条件下培养，取2-8代人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)用于实验，其高糖损伤模型条件：正常组采用10％胎牛血清+4.5mmol/ld-葡萄糖dmem/f12培养基，高糖组采用10％胎牛血清+30mmol/ld-葡萄糖dmem/f12培养基放置培养箱培养48小时，收集细胞,根据试剂盒方法，检测细胞内na⁺-k⁺-atp酶活力、山梨醇含量(图1、图2)。

高糖损伤对细胞na⁺-k⁺-atp酶活力结果：

高糖损伤对细胞山梨醇含量结果：

结果显示，人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)高糖损伤后na⁺-k⁺-atp酶活力显著降低，山梨醇含量显著增多，na⁺-k⁺-atp酶活力正常组vs.造模组具有极显著性差异(p<0.01)，山梨醇正常组vs.造模组具有显著性差异(p<0.05)，高糖损伤后细胞多元醇通路末端产物积累，诱发细胞损伤(图1、图2)。

实施例7

将实施例1-4获得罗布麻多酚对人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)活力的影响：人视网膜色素上皮细胞接种于96孔板，5000个/孔，培养12小时使细胞贴壁后，更换培养基建立高糖损伤模型，条件：正常组采用10％胎牛血清+4.5mmol/ld-葡萄糖dmem/f12培养基，高糖组采用10％胎牛血清+30mmol/ld-葡萄糖dmem/f12培养基，给药组采用高糖组条件同时加入不同浓度罗布麻叶多酚，24小时后，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐比色法(mtt)检测细胞活力；用graphpadprism统计分析，检验实验组与给药组统计学差异，研究表明：罗布麻叶多酚处理高糖损伤条件下arpe-19细胞24小时后，各浓度与对照组相比，细胞活力均在100％附近，结果证明罗布麻叶多对arpe-19细胞没有毒性作用(图3)。

细胞活力结果：

结论：

研究表明罗布麻叶多酚处理高糖损伤条件下人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)24小时后，各浓度与对照组相比，细胞活力均在100％附近，结果证明罗布麻叶多酚对人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)没有毒性作用。

实施例8

将实施例1-4获得罗布麻多酚的用途的细胞筛选：人视网膜色素上皮细胞接种于6孔板中培养12小时贴壁，更换培养基，条件：正常组采用10％胎牛血清+4.5mmol/ld-葡萄糖dmem/f12培养基培养48小时，高糖组采用10％胎牛血清+30mmol/ld-葡萄糖dmem/f12培养基刺激48小时，给药组采用高糖刺激24小时后加入不同浓度罗布麻叶多酚继续培养24小时，收集细胞，根据试剂盒方法，检测细胞内na⁺-k⁺-atp酶活力、山梨醇含量；

不同浓度罗布麻叶多酚对细胞na⁺-k⁺-atp酶活力结果：

在不同浓度罗布麻叶多酚给药24小时后，na⁺-k⁺-atp酶活力显著增强，25μg/ml剂量组vs.造模组具有极显著性差异(p<0.01)，12.5μg/ml剂量组vs.造模组具有显著性差异(p<0.05)，6.25μg/ml剂量组vs.造模组具有显著性差异(p<0.05)，表明罗布麻叶多酚在高糖损伤造成多元醇通路异常上具有保护作用，具有保护细胞抗高糖损伤作用，改善高糖损伤引起视网膜病变(图4)；

不同浓度罗布麻叶多酚对细胞山梨醇含量结果：

在不同浓度罗布麻叶多酚给药24小时后，山梨醇含量显著减少，50μg/ml剂量组vs.造模组具有显著性差异(p<0.05)，25μg/ml剂量组vs.造模组具有显著性差异(p<0.05)，表明罗布麻叶多酚具有抑制高糖损伤造成多元醇通路末端产物山梨醇在细胞内的积累，具有保护细胞抗高糖损伤作用，改善高糖损伤引起视网膜病变(图5)；

根据罗布麻叶多酚处理高糖损伤条件下人视网膜色素上皮细胞(arpe-19)内na⁺-k⁺-atp酶活力和山梨醇结果表明，罗布麻叶多酚对高糖损伤引起相关疾病的具有预防与治疗作用。