一种HIV-1潜伏感染激活剂硫链丝菌素的制作方法

本发明涉及hiv病毒的防治技术领域，更具体地，涉及一种hiv-1潜伏感染激活剂硫链丝菌素。

背景技术：

人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)是在1981年被发现，并且在随后被证实为能导致获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，aids)，这是一种对人类危害极大的逆转录病毒。hiv进入体内后，主要攻击人体免疫系统的cd4淋巴细胞，使机体内cd4细胞数量急剧下降，免疫细胞遭受大量破坏，机体免疫系统出现崩溃，从而导致各种机会性感染和癌症的高发，最终造成感染患者的死亡。

联合抗逆转录病毒疗法(cart)的出现有效地控制hiv-1病毒，并代表了现代医学的里程碑。art可持久抑制hiv-1复制，恢复免疫系统，防止疾病进展，并降低病毒传播给未感染个体的风险。

由于hiv-1能够整合至宿主细胞基因组，形成稳定的病毒潜伏库并长期存在，一旦停止用药，患者体内的病毒载量会迅速反弹。病毒潜伏库的存在是导致hiv-1难以被治愈的主要原因。目前，提出了许多治疗策略靶向病毒潜伏库，其中之一叫做“激活再杀灭，”这一策略的提出旨在通过潜伏感染逆转药物(激活剂)特异性地激活储存库中的hiv-1病毒，然后再借助病毒引起的细胞病变效应或者机体免疫系统对细胞特异性杀伤，最终实现艾滋病的功能性治愈。许多潜伏感染激活剂在不同的hiv-1潜伏模型中可有效诱导病毒产生，其中一些已被批准用于临床试验。

在各种临床试验中都没有证据表明潜伏感染激活剂能够安全有效地诱导潜伏hiv-1再激活。由于多种分子机制维持hiv-1的潜伏储存库，潜伏感染激活剂的次优功效或作用于单一机制都导致重新激活不完全。另外，已证明pkc激动剂可在体内和体外有效诱导hiv-1活化，但是由于非特异性诱导可引起t细胞全局活化，细胞因子风暴和威胁生命的炎症反应。另一种潜伏感染激活剂saha会损害hiv-1特异性细胞毒性淋巴细胞的功能，并且被证实无法减小hiv-1潜伏储存库。因此，我们迫切需要找到具有更高功效和低毒性的新型化合物。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种hiv-1潜伏感染激活剂硫链丝菌素。

本发明的第一个目的是提供硫链丝菌素和/或其药学上可接受的盐作为hiv-1潜伏感染激活剂的应用。

本发明的第二个目的是提供硫链丝菌素和/或其药学上可接受的盐制备hiv-1潜伏感染激活剂的应用。

本发明的第三个目的是提供一种hiv-1潜伏感染激活剂。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

硫链丝菌素结构式如式(i)所示，其是一种从天蓝链霉素中分离的多肽抗生素。它不仅对革兰氏阳性细菌，疟疾和真菌有很大的活性，而且在近年来报道，也发现其具有抗癌活性。本发明对其对于hiv-1病毒的最佳作用浓度、药物安全性以及作用机制等进行了探究。

因此本发明要求保护硫链丝菌素和/或其药学上可接受的盐作为hiv-1潜伏感染激活剂的应用。

本发明还要求保护硫链丝菌素和/或其药学上可接受的盐制备hiv-1潜伏感染激活剂的应用。

进一步本发明还要求保护一种hiv-1潜伏感染激活剂，含有硫链丝菌素和/或其药学上可接受的盐。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一个新型的小分子化合物硫链丝菌素(thiostrepton)，其能有效的激活潜伏的hiv-1感染细胞，同时其细胞毒副作用小，不引起全局t细胞的活化，有望在未来开发成为新型的潜伏感激活剂并进入临床试验，有很好的推广应用价值。

附图说明

图1为bcl-2转导细胞的cd4和bcl-2双染色流式图。

图2为gfp阴性细胞流式分选策略及纯度流式分选策略及纯度

图3为能激活潜伏hiv-1的化合物。

图4为x4的最佳作用浓度测试图。

图5为不同浓度硫链丝菌素在j-lat10.6细胞系中再激活效率的比较。

图6为annexinv/pi双染色法检测硫链丝菌素作用后细胞凋亡。

图7为cck8法检测细胞硫链丝菌素对细胞活性影响。

图8为检测硫链丝菌素对细胞表面hiv-1共受体cxcr4和ccr5表达的影响。

图9为硫链丝菌素对cd4+t淋巴细胞表面活化标志cd25，cd69和hla-dr表达的影响。

图10为硫链丝菌素作用于hiv-1感染病人离体样本结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

样本来源

健康人外周血白膜(浓缩细胞)，来自广州市血液中心，常规检测乙型肝炎(hbsag)、丙型肝炎(hcv)、艾滋病(hiv)及梅毒螺旋体及梅毒螺旋体(syphilis)均阴性。

病人样本外周血来自于珠海市中山大学第五医院，病人选择基于病毒载量低于50拷贝每毫升，且cd4+t细胞超过400细胞每微升，保持这个标准超过两年以上。

实施例1hiv-1原代细胞潜伏感染模型的构建

一、bcl-2的转导与扩增

首先用磁珠筛选出正常人pbmcs中的cd4+t细胞，anti-cd3/28和il-2活化后感染携带抗凋亡基因bcl-2的慢病毒eb-flv，在没有tcr刺激及外源性细胞因子存在的条件下培养3～4周后，通过ficoll密度梯度离心法去除死细胞，得到可稳定表达bcl-2的原代cd4+t细胞系。

(一)实验方法

1.分离健康捐献者pbmc，bd阴选磁珠分得到cd4+t细胞，重悬于stcm，细胞密度为1×10⁶/毫升，在6孔板中进行激活。

2.收集活化的cd4+t细胞，离心后取适量细胞，离心后取适量细胞，离心后取适量stcm重悬(细胞浓度为2～4×10⁶/毫升)，加入携带bcl-2的慢病毒eb-flv浓缩液(每20～30×10⁶个细胞加入3个10cm培养皿包装所得的病毒量)，充分振荡混匀。

3.将细胞-病毒混合液转移至v型加样槽，排枪吸取混合液至圆底96孔板，每孔100μl。

4.1200g，30℃离心2小时。

5.取出96孔板，每孔补加100μlstcm，37℃过夜培养。

6.将细胞吹打混匀，从96孔板转至培养瓶，补充足量stcm，使细胞密度为，使细胞密度为0.5×10⁶细胞/毫升。

7.37℃培养2天后，将细胞悬液移取至50ml离心管，台盼蓝计数细胞，同时离心，350g，4℃离心10分钟。

8.用cfm重悬细胞，细胞密度为1～2×10⁶细胞/毫升，混匀，37℃培养3周

9.收集培养的细胞，350g室温离心10分钟，弃上清，然后用37℃温育的cfm重悬，每9ml最多重悬10⁸个细胞。

10.过minificoll，即移取4.5ml人淋巴细胞分离液于15ml离心管，然后沿管壁小心加入9ml细胞悬液，335g室温离心10分钟，降速为0。

11.死细胞降至管底，淋巴细胞分离液与cfm之间细胞层为活细胞，吸取中间层活细胞到50ml离心管，加wm至40ml，颠倒混匀，350g室温离心10分钟。

12.加入适量wm重悬细胞，台盼蓝计数，同时进行离心，至此获得稳定表达bcl-2的原代cd4+t细胞，此后成为bcl-2细胞。

13.将bcl-2细胞重悬于stcm，使细胞密度为1×10⁶细胞/ml，6孔板中激活。

14.3天后，收集细胞离心，cfm重悬，每1×10⁶个细胞/ml，同时加入人细胞因子il-2，使其终浓度达到100u/ml。

15.37℃培养，每隔2天计数一次，补充cfm使细胞密度维持在10⁶细胞/毫升，同时补充il-2使终浓度维持在100u/ml，扩增7～10天。

16.重复步骤9-12，获得扩增后的bcl-2细胞，并根据实验需要进行激活或者冻存。

接着用流式抗体cd4及bcl-2对所得的原代cd4+t细胞系进行染色，以证实bcl-2的成功导入。

(二)、实验结果

实验结果显示，在获得的原代cd4+t细胞中，bcl-2和cd4的表达水平均较高，几乎接近100％(图1)。原代cd4+t细胞bcl-2的高度表达为后续长时间的潜伏建立过程提供了重要保障。

二、hiv-1假病毒的感染与潜伏细胞分选

为进一步得到hiv-1潜伏感染细胞，我们用anti-cd3/28和il-2将bcl-2过表达的原代cd4+t细胞系再次激活，然后感染带gfp报告基因的hiv-1假病毒，在无细胞因子及其他刺激剂的条件下培养4周以上，让活化的细胞恢复到静息状态，最后通过流式分选出gfp阴性的细胞，至此完成了hiv-1原代细胞潜伏感染模型的建立。

(一)、实验方法

1.stcm重悬bcl-2细胞6孔板内激活。

2.离心收集细胞，stcm重悬后，加入携带绿色荧光蛋白基因的重悬后，加入携带绿色荧光蛋白基因的hiv-1假病毒cm6(病毒用量为500～800ng/10⁶)，将细胞-病毒混合液转至96孔板，1200g，30℃离心感染2小时。

3.每孔补stcm100μl，37℃培养过夜，将细胞从96孔板转到培养瓶，根据细胞数补加stcm至0.5×10⁶细胞/毫升。

4.37℃培养2天，计数细胞，取1×10⁶个细胞，wm洗涤后用流式细胞分析仪洗涤后用流式细胞分析仪检测病毒感染率，其余细胞350g，4℃离心10分钟。

5.cfm重悬细胞，细胞密度控制在1～2×10⁶细胞/毫升，37℃培养4～6周放至静息，第2～3周时取一半细胞悬液，350g，4℃离心，用相同体积新鲜cfm重悬细胞后转至原培养瓶。

6.过minificoll，去除死细胞，所得活细胞计数，离心后，按15～20×10⁶细胞/毫升重悬于wm，转移到带帽的流式管。

7.流式细胞分选仪分选gfp-细胞，该细胞包含hiv-1潜伏感染细胞及未感染细胞，离心后重悬于cfm，37℃培养，供后续实验使用。

按照图2所示进行gfp阴性细胞的分选。

8.经流式分选出的gfp-细胞，分别用pma/ionomycin、anti-cd3/28、saha和brysotatin-1进行刺激，2天后，检测gfp阳性细胞所占百分比。pma和ionomycin的用量分别是50ng/ml和1μm，anti-cd3和anti-cd28的用量均为1μg/ml，saha和brysotatin-1的用量均为1μm，同时设置未加药的对照组。对照组和处理组均设3个复孔。

(二)、实验结果

将稳定表达bcl-2的cd4+t细胞再次激活，感染带gfp的hiv-1假病毒，经4～6周培养，待细胞回到静息状态，分选出gfp阴性的细胞，该中含未感染和潜伏感染细胞。经过gfp阴性细胞的分选，所得细胞纯度接近100％。

结果如图所示，用强效激活剂pma和ionomycin共刺激细胞时，能诱导2.47％的细胞表达gfp，而anti-cd3/28组gfp阳性细胞也能达到1.87％，但未刺激组细胞gfp阳性率仅为0.105％，这表明gfp阴性细胞中富含hiv-1潜伏感染细胞。与此同时，用经典激活剂saha和brostatin-1分别刺激细胞，能诱导1.48％和1.23％的细胞表达gfp，这进一步证实了，所构建的模型用于潜伏感染激活剂筛选的可靠性。

实施例2硫链丝菌素对潜伏的hiv-1的激活作用

一、实验方法

应用基于流式细胞仪的对分选出的gfp阴性细胞进行刺激活化并通过流式细胞仪检测细胞gfp的表达。阴性对照为dmso,阳性对照为pma/ionomycin，同时使用已报道的潜伏激活剂如panobinostat，bryostatin，disulfiram，jq1进行对照。

二、实验结果

通常情况下，对该模型的gfp阴性细胞再激活，可诱导1％～6％的细胞表达gfp荧光。在保证pma/ionomycin组再激活细胞gfp阳性率至少达到1％以上后，对小分子化合物硫链丝菌素对潜伏的hiv-1的激活作用进行检测。

结果显示，硫链丝菌素的作用强于其他已知激活剂对照，甚至高于pma/ionomycin组(图3)。

实施例3硫链丝菌素最佳作用浓度的筛选

一、实验方法

为确定硫链丝菌素的最佳作用浓度，设置了不同的药物浓度进行激活实验，包括100nm、250nm、500nm、1μm、2.5μm、5μm和10μm7个组，同时以稀释液dmso处理组作为阴性对照，pha作为阳性对照。作用时间为3天。

二、实验结果

结果显示，随着硫链丝菌素用量的增加，激活效率均逐渐上升，在1μm时再激活比例达到最大，并且donor1在浓度为1μm时，激活效果甚至高于阳性对照组。而之后随着药物浓度的加大，激活率开始逐渐下降(图4)。这一结果表明硫链丝菌素的最佳作用浓度为1μm，在此浓度下，能最大比例的激活hiv-1潜伏感染细胞。

实施例4硫链丝菌素在j-lata10.6细胞系中再激活效率的检测

采用另一个hiv-1潜伏感染细胞系j-lat10.6细胞来进一步证实硫链丝菌素对潜伏病毒的再激活能力。

一、实验方法

采用了另一个潜伏感染细胞系j-lat10.6对x4的潜伏激活能力进行验证。首先用不同浓度的硫链丝菌素刺激细胞48h，然后通过流式检测细胞gfp的表达，gfp的表达水平即代表hiv-1的再激活水平。

二、实验结果

与hiv-1原代细胞潜伏感染模型结果一样，硫链丝菌素在j-lat10.6细胞中也能显著激活潜伏感染的细胞，除阳性对照pma及tnf-α能有效激活j-lat10.6中潜伏的hiv-1外，硫链丝菌素对该细胞系中潜伏感染的病毒也具有显著的激活效果。且与bcl-2细胞潜伏感染模型的结果相似，在j-la10.6细胞中，随着硫链丝菌素药物浓度的增加，潜伏感染细胞再激活比例逐渐增大，在1μm时达到最佳激活效果，gfp阳性细胞比例约为55％，与其他药物浓度组相比，差异具有统计学意义(图5)。有力的证明了硫链丝菌素能诱导潜伏hiv-1的有效重激活，且1μm为最佳药物施用浓度。

实施例5药物安全性评价

药物安全性评价是激活剂筛选工作中的一个重要组成部分。虽然硫链丝菌素能有效激活潜伏的hiv-1前病毒，但其对细胞活力的影响也将影响其未来开发成为潜伏激活剂的可能性。

一、双染色法检测了硫链丝菌素作用后细胞的凋亡情况

1、实验方法

利用annexinv/pi双染色法检测了硫链丝菌素作用后细胞的凋亡情况(图6a所示)。在新鲜分离的人pbmcs中分别加入硫链丝菌素和其他的激活剂，3天后进行流式抗体染色，检测不同药物组细胞pi和annexinv的阳性率。

2、实验结果

结果显示，同未处理组相比，pma/ionomycin引起细胞凋亡的比例大增加。而作为常用hiv-1潜伏感染激活剂之一的saha，在最适药物浓度时，也会导致部分细胞的凋亡，其中annexinv的表达较阴性对照组明显增高，两组结果具有统计学差异。但是，在加入1μm硫链丝菌素和0.5μmdisulfiram时，均未引起明显的细胞凋亡反应，两组细胞pi和annexinv的阳性率与未处理组水平相当，且其中的阳性率与未处理组水平相当，且其中硫链丝菌素组pi阳性细胞比例稍低于disulfiram组(图6b)。由以上结果我们可得知硫链丝菌素的细胞毒性作用较小，它的使用不会诱发大量细胞凋亡。

二、cck8法检测细胞的活力

1、实验方法

1、取健康人pbmcs制备细胞悬液，细胞密度控制在1～2×10⁶细胞/毫升。

2、加入硫链丝菌素和其他的激活剂，37℃培养箱3天。

3、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。

4、加入10ulcck8培养4小时。

6、测定450nm吸光度。

2、实验结果

结果显示(图7)，硫链丝菌素最佳药物施用浓度1μm时，对细胞活性影响较小。

实施例6硫链丝菌素处理后对细胞hiv-1的易感性的影响

hiv-1在感染细胞时，除需要受体cd4外，还需要共受体cxcr4或ccr5的共同作用。已有研究表明外周血cd4+t淋巴细胞表面共受体的表达与hiv的易感性、疾病进展情况密切相关。

一、实验方法

为了明确硫链丝菌素在激活潜伏感染细胞的同时是否会引起细胞对病毒易感性的增加，对于硫链丝菌素处理后的原代cd4+t细胞，使用流式细胞术检测细胞表面ccr5和cxcr4的表达。

二、实验结果

除pma/ionomycin组因细胞毒性过大，cxcr4表达明显下调外，硫链丝菌素、disulfiram和saha三组细胞cxcr4的表达均未发生明显变化，与阴性对照组(dmso)相比，不存在统计学差异(图8a)。而同样的，硫链丝菌素的使用也不影响细胞ccr5的表达(图8b)。

实施例7硫链丝菌素的使用不会引发整体t细胞活化

除特异性激活潜伏的hiv-1前病毒外，潜伏感染细胞的广泛活化也能诱导潜伏hiv-1的转录和复制。然而，如果潜伏感染激活剂在激活潜伏病毒的同时会引起cd4+t细胞的全局活化，则会诱导细胞分泌大量的细胞因子，引发细胞因子风暴综合征，对机体造成严重损伤。pkc激活剂如pma虽然具有很强的激活潜伏hiv-1的能力，但因其会造成广泛性t细胞活化而被限制使用。因此，在本研究中通过检测硫链丝菌素作用后细胞表面活化标志物cd25、cd69和hla-dr的表达来评估其是否会引起全局t细胞活化。

一、实验方法

分别加入硫链丝菌素、saha、disulfiram以及pma/ionomycin去处理新鲜分离的原代cd4+t细胞，3天后离心收集细胞，经流式抗体染色利用流式细胞仪检测活化标志cd25，cd69和hla-dr在细胞表面的达水在细胞表面的达水平。

二、实验结果

结果如图9所示，阳性对照pma/ionomycin处理后，cd25和cd69的表达均显著性增加，而硫链丝菌素处理后，cd69，cd25及hla-dr表达水平并未发生明显变化，其中cd25及hla-dr的表达甚至要低于saha和disulfiram对照组。而cd69的表达虽略高于上述两组，但与阴性对照组相比，不存在统计学差异。这一结果说明x4在激活原代cd4+t细胞中潜伏的hiv-1时，不会引发非特异性t细胞活化。

实施例8硫链丝菌素对长期服药的病人的影响

一、实验方法

在长期使用cart控制病毒血症超过两年且病毒载量低于临床检测限以下的hiv感染患者中提取cd4+t细胞进行药物的激活试验。选用硫链丝菌素(1μm)刺激cd4+t细胞48h后提取细胞rna逆转录后进行qpcr实验，检测hivrna的表达情况。同时采用pma/ionomycin作为阳性对照药物。

二、实验结果

结果显示(图10)，长期服药的病人中分离的cd4+t细胞，使用硫链丝菌素刺激后，也观察到hiv转录水平的显著提高。