本发明涉及生物医药的研究和应用，具体是一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法。
背景技术：
内耳基因转染是各种感音性听力损失机制研究和生物治疗的重要技术，但是由于内耳结构相对封闭，与全身血液循环之间存在血-迷路屏障，系统给药途径进入内耳的药物剂量极为有限，而既往内耳基因转染是通过外科手术暴露鼓室的方式，对外耳道和中耳可造成永久性损害，具有副作用大和操作困难等缺陷。
目前，内耳药物载体主要包括病毒载体、纳米粒载体、蛋白质载体和原位凝胶，多种给药载体为内耳药物递送的研究带来了进步，而内耳基因载体主要是病毒载体和质粒，但迄今为止内耳基因转染仍然缺乏有效的，非侵入性递送系统，故建立一个新型的无创内耳基因转染给药系统具有极大的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，具体步骤如下：利用基因工程技术构建重组prestin腺相关病毒载体，将重组病毒载体与原位凝胶混合构成内耳基因转染载体混合液，再经鼓膜穿刺(非外科方法)鼓室给药的圆窗途径对实验对象耳蜗进行基因转染；
转染后通过免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布、耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白和prestin蛋白的表达及分布、western-blot检测耳蜗基底膜prestin表达水平，最后通过统计学分析结果。
作为本发明再进一步的方案，所述鼓膜穿刺鼓室给药的具体方法如下：取戊巴比妥钠对实验对象进行麻醉，麻醉完成后使用微量注射器于4℃下取药0.1ml经鼓膜穿刺注射入实验对象鼓室中，左耳注射的混合液为原位凝胶：重组病毒液＝1:9，右耳作为对照注射的混合液为原位凝胶：pbs液＝1:9。
作为本发明再进一步的方案，所述鼓膜穿刺鼓室给药过程中需保持全程无菌操作。
作为本发明再进一步的方案，所述免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个实验对象麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗，浸泡于4％多聚甲醛过夜，用6％稀硝酸脱钙4小时，梯度乙醇脱水，将耳蜗组织制成石蜡切片；
选择cy3标记的绿色荧光蛋白抗体，dapi染料标记细胞核显示耳蜗组织结构轮廓；用0.2％的tx-100打孔10分钟，pbs液漂洗3次，干燥后加cy3标记的绿色荧光蛋白抗体室温孵育两小时，pbs液漂洗3次，用dapi标记的羊抗兔igg，室温孵育2小时，pbs液漂洗3次，干燥后铺片，封片；置于激光共聚焦显微镜下观察拍照(10×10倍)，观察绿色荧光蛋白在耳蜗组织内的表达及分布。
作为本发明再进一步的方案，所述耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个实验对象麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗，于解剖显微镜下剥离基底膜，剥离后放置于孔板中，加入0.2％的tx-100打孔10分钟，pbs液漂洗3次，加入cy3标记的绿色荧光蛋白抗体，室温孵育2小时，pbs液漂洗3次，用羊抗兔igg与鬼笔环肽染料按1:200配比，加入孔板中室温孵育2小时，pbs液漂洗3次，取出基底膜铺片，封片，置于激光共聚焦显微镜下观察拍照(10×100倍)，观察绿色荧光蛋白在耳蜗基底膜毛细胞的表达及分布。
作为本发明再进一步的方案，所述耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测prestin的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个实验对象麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗，于解剖显微镜下剥离基底膜，剥离后放置于孔板中，加入0.2％的tx-100打孔10分钟，pbs液漂洗3次，加入cy3标记的prestin抗体，室温孵育2小时，pbs液漂洗3次，用羊抗兔igg与鬼笔环肽染料按1:200配比，加入孔板中室温孵育2小时，pbs液漂洗3次，取出基底膜铺片，封片，置于激光共聚焦显微镜下观察拍照(10×100倍)，观察prestin在耳蜗基底膜毛细胞的表达及分布。
作为本发明再进一步的方案，所述western-blot检测耳蜗基底膜prestin表达水平的具体方法如下：于鼓室注射给药后4d、7d、14d后，取戊巴比妥钠对多个实验对象麻醉，麻醉完成后取双侧耳蜗剥离基底膜，将各基底膜低温碾磨后加入ripa裂解液冰上裂解20min，10000rpm、4℃、10min离心后收集上清蛋白液备用；用wes仪进行western-blot检测，样品处理严格按照试剂盒wes12-230kdamousemasterkit和wes12-230kdamasterkitwithsplitbuffer的操作步骤，反应参数为：分离胶吸取200s、浓缩胶吸取15s、吸样9s、电泳25min(恒压375v)、凝胶清除230s、洗涤3次(每次150s)、封闭5min、prestin抗体孵育30min、cy3标记羊抗兔igg孵育30min、发光液曝光50s；实验结果显示各样品灰度值，以gapdh为内参计算prestin的相对灰度值表示其表达水平。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的新型无内耳耳蜗基因转染给药系统实现了内耳耳蜗无创给药基因转染的突破，避免了传统外科手术暴露鼓室对听觉器官的损伤，对内耳的基因转染具有一定的应用价值；重组prestin-aav-2载体外毛细胞靶向性强，能够将目的基因转染至外毛细胞，不仅可以实现prestin基因的外毛细胞过表达，而且对外毛细胞其它基因的转染具有很好的借鉴价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
名词解释
prestin蛋白：是内耳外毛细胞中独特表达的跨膜马达蛋白，是耳蜗音频信号放大的分子基础，是耳蜗外毛细胞特有的重要感音功能蛋白。doganm等利用prestin作为早期检测外毛细胞损伤的指标，展示出prestin蛋白是外毛细胞损伤相关研究的热点，parham等发现血液中的prestin浓度会随着噪声性外毛细胞损伤而上升，血液中prestin水平可以作为噪声性听力损失的标志物。另外，prestin蛋白在外毛细胞损伤时呈代偿性表达水平升高以弥补听力损失，prestin蛋白不仅在感音性耳聋的发生机制中具有重要作用，而且对感音性耳聋的修复可能具有一定的潜在价值。
实施例
一种新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统的构建方法，以无特定病原体级健康雄性红目豚鼠为实验对象，具体步骤如下：
(1)重组prestin腺相关病毒载体构建
利用ncbi中medgen数据库中查找豚鼠slc26a5基因(prestin)序列(id:xm_003469805.1)，并以此为模板设计引物序列进行pcr扩增(上游：gccgaattccgatggatcatgctgaag，下游：taactcgagggcctcgggtgtggc)，原腺相关病毒质粒由启动子cag调控增强绿色荧光蛋白(egfp)基因(报告基因)以及末端反向重复序列组成，将豚鼠prestin基因片段(2232bp)以单克隆的方式克隆进该质粒形成腺相关病毒-prestin原病毒质粒(paav-egfp-prestin)，paav-prestin原病毒质粒转染hek-293t细胞，分别在感染后1d、3d、5d于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况；
质粒采用aav-2包装质粒(paav2repcap)装配制备，制备病毒的滴度为2.68×1012gc/ml，并进行测序验证，验证后于负八十度冰箱存放。
(2)原位凝胶制备
取泊洛沙姆407与蒸馏水按1:5配于烧杯中，于4℃冰箱加入制备好的病毒液，按原位凝胶：病毒液＝1:9配比，构成内耳基因转染载体系统。
原位凝胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，在内耳小分子药物运输应用广泛，是一种特殊的内耳药物载体，以往研究利用原位凝胶将化学药物经鼓膜穿刺注射入中耳，在内耳圆窗膜上形成储层效应，可有效控制药物释放进入内耳的速度，达到缓释效果；研究发现应用泊洛沙姆407制备的原位凝胶在低于25℃时为液态，在32℃时变为半固态，该特点可被利用于保护对温度敏感的药物运输；原位凝胶作为内耳的药物载体具有制备工艺简单、毒副作用小、持续控制药物释放和无创等优点。
(3)选择实验对象
无特定病原体级健康雄性红目豚鼠60只，体质量200～250g，4月龄，耳廓反射正常，饲养环境背景噪声小于50dbspl。
(4)鼓膜穿刺鼓室给药
取戊巴比妥钠对豚鼠进行腹腔注射麻醉，麻醉完成后使用微量注射器于4℃下取药0.1ml经鼓膜穿刺注射入豚鼠鼓室中，左耳注射的混合液为原位凝胶：aav-2重组病毒液＝1:9，右耳作为对照注射的混合液为原位凝胶：pbs液＝1:9；用酒精棉擦拭外耳道及耳廓，全程无菌操作，避免感染。
(5)免疫荧光法观察耳蜗组织病毒转染分布
于鼓室注射给药后4d、7d、14d分别取实验豚鼠5只戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉完成后断头取双侧耳蜗，浸泡于4％多聚甲醛过夜，用6％稀硝酸脱钙4小时，梯度乙醇脱水，将耳蜗组织制成石蜡切片；
选择cy3标记的绿色荧光蛋白抗体，dapi染料标记细胞核显示耳蜗组织结构轮廓；用0.2％的tx-100打孔10分钟，pbs液漂洗3次，干燥后加cy3标记的绿色荧光蛋白抗体室温孵育两小时，pbs液漂洗3次，用dapi标记的羊抗兔igg，室温孵育2小时，pbs液漂洗3次，干燥后铺片，封片；
置于激光共聚焦显微镜下观察拍照(10×10倍)，观察绿色荧光蛋白在耳蜗组织内的表达及分布。
(6)耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测绿色荧光蛋白
于鼓室注射给药后4d、7d、14d分别取实验豚鼠5只戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉完成后断头取双侧耳蜗，于解剖显微镜下剥离基底膜，剥离后放置于孔板中，加入0.2％的tx-100打孔10分钟，pbs液漂洗3次，加入cy3标记的绿色荧光蛋白抗体，室温孵育2小时，pbs液漂洗3次，用羊抗兔igg与鬼笔环肽染料按1:200配比，加入孔板中室温孵育2小时，pbs液漂洗3次，取出基底膜铺片，封片，置于激光共聚焦显微镜下观察拍照(10×100倍)，观察绿色荧光蛋白在耳蜗基底膜毛细胞的表达及分布。
(7)耳蜗基底膜铺片免疫荧光检测prestin
于鼓室注射给药后4d、7d、14d分别取实验豚鼠5只戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉完成后断头取双侧耳蜗，于解剖显微镜下剥离基底膜，剥离后放置于孔板中，加入0.2％的tx-100打孔10分钟，pbs液漂洗3次，加入cy3标记的prestin抗体，室温孵育2小时，pbs液漂洗3次，用羊抗兔igg与鬼笔环肽染料按1:200配比，加入孔板中室温孵育2小时，pbs液漂洗3次，取出基底膜铺片，封片，置于激光共聚焦显微镜下观察拍照(10×100倍)，观察prestin在耳蜗基底膜毛细胞的表达及分布。
(8)western-blot检测耳蜗基底膜prestin表达水平
于鼓室注射给药后4d、7d、14d分别取实验豚鼠5只戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉完成后断头取双侧耳蜗剥离基底膜，将各基底膜低温碾磨后加入ripa裂解液冰上裂解20min，10000rpm、4℃、10min离心后收集上清蛋白液备用；
用wes仪进行western-blot检测，样品处理严格按照试剂盒wes12-230kdamousemasterkit和wes12-230kdamasterkitwithsplitbuffer的操作步骤，反应参数为：分离胶吸取200s、浓缩胶吸取15s、吸样9s、电泳25min(恒压375v)、凝胶清除230s、洗涤3次(每次150s)、封闭5min、prestin抗体孵育30min、cy3标记羊抗兔igg孵育30min、发光液曝光50s。
实验结果显示各样品灰度值，以gapdh为内参计算prestin的相对灰度值表示其表达水平。
(9)统计学分析
采用spss20.0软件进行数据分析，计量资料采用
(10)结果
10.1、重组腺相关病毒耳蜗转染分布
豚鼠耳蜗给药后第4天耳蜗未见绿色荧光蛋白表达，第7天开始出现绿色荧光蛋白表达，第14天中绿色荧光蛋白表达更明显，范围增大；绿色荧光蛋白可见于耳蜗血管纹、前庭膜、基底膜和corti器部位。
10.2、重组腺相关病毒毛细胞转染分布
豚鼠耳蜗给药后第4天耳蜗基底膜未见绿色荧光蛋白表达，第7天开始出现绿色荧光表达，第14天中绿色荧光蛋白表达更明显；绿色荧光蛋白可见于基底膜外毛细胞胞质内，未见于内毛细胞。
10.3、基底膜毛细胞prestin基因转染
prestin蛋白分布于外毛细胞膜，豚鼠耳蜗给药后第7天耳蜗基底膜可见prestin蛋白表达增强，第14天中prestin蛋白表达更明显；prestin蛋白可见于基底膜外毛细胞，未见于内毛细胞。
10.4、基底膜毛细胞prestin表达水平
wb(western-blot)检测各组基底膜prestin蛋白表达水平结果，对照组：
由上述新型无创的内耳耳蜗基因转染给药系统给药后：
重组prestin-aav-2载体与原位凝胶混合经豚鼠鼓室注射后，于第7天在内耳组织中出现绿色荧光蛋白表达，第14天表达效果更明显，重组prestin-aav-2载体成功转染了内耳基底膜、血管纹、前庭膜、corti器等部位，因此，新型无创内耳基因转染系统构建成功。
基底膜铺片发现基因转染主要表现于外毛细胞，内毛细胞表现不明显，基底膜wb检测显示prestin蛋白在7天后出现过表达，14天过表达更明显，说明重组prestin-aav-2载体具有很好的外毛细胞转染的靶向性，是良好的内耳外毛细胞基因转染载体。
病毒载体在细胞转染过程中具有很强的组织细胞特异性，常用于构建内耳细胞转染载体的病毒包括逆转录病毒(retrovirus，rv)、腺病毒(adenovirus)、慢病毒(lentivirus，lv)、腺相关病毒(adenoassociatedvirus，aav)及杆状病毒(baculovirus)等，不同的病毒载体各有其相应的靶细胞，耳蜗外毛细胞(outerhellcell，ohc)属于非分裂细胞，以往的研究发现大多数病毒载体无法有效的转染耳蜗ohc，能有效转染耳蜗ohc的病毒载体主要为aav类。
aav是一类单链线状dna缺陷型病毒，作为载体其基因容量为4000-5000bp，根据aav病毒衣壳蛋白的差异已确定了12种血清型(aav-1～aav-12)，不同血清型aav载体对内耳转染的靶细胞不同；在耳蜗内毛细胞方面，aav-1、2、4、5、6、7、8和9的载体主要转染内毛细胞，还可转染hensen细胞，而aav-3的载体只被发现高效转染耳蜗内毛细胞，未发现转染其他内耳细胞，其余类型的血清型(aav-10、11、12)暂未发现内毛细胞的转染研究；
此外，部分血清型(aav-1～aav9)和重组腺相关病毒可转染外毛细胞，但外毛细胞转染效率明显低于内毛细胞，目前具有耳蜗ohcs高转染能力的aav类主要是aav-2(aav2/1、aav2/2、aav2/9)。
2019年，tan等利用aav安全转染至小鼠耳蜗的内毛细胞、外毛细胞和支持细胞中，但依旧使用了耳后切口暴露耳蜗的外科手术方式进行实验，可能会对听力造成损伤。仅依靠aav-2载体不能有效地通过圆窗膜将目的基因以无创的方式转染至内耳细胞中，迄今内耳以病毒为载体的基因治疗研究的给药方式均以圆窗膜穿刺、鼓壁造孔穿刺或微渗透泵为主，外科损伤限制了临床应用价值，本发明利用了原位凝胶的温敏和缓释特性，混合后经鼓膜穿刺注射，可以使液体药物附着于圆窗膜变成固液状缓慢释放，达到无创靶向性给药的目的。
该新型无创给药系统的建立实现了内耳耳蜗无创给药基因转染的突破，避免了传统外科手术暴露鼓室对听觉器官的损伤，对内耳的基因转染具有一定的应用价值；重组prestin-aav-2载体外毛细胞靶向性强，能够将目的基因转染至外毛细胞，不仅可以实现prestin基因的外毛细胞过表达，而且对外毛细胞其它基因的转染具有很好的借鉴价值。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。