本发明属于水产养殖领域，特别涉及一种鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
新本尼登虫(neobenedeniaspp.)是一类寄生于海水鱼类体表的单殖吸虫，隶属于扁形动物门(platyhelminthes)、单殖吸虫纲(monogenea)、分室科(capsalidae)、本尼登亚科(benedeniinae)。新本尼登虫分布广泛，对寄主的特异性不高，可寄生100多种海水鱼类。该虫寄生于鱼体表、鳍、眼球和鳃丝等部位，虫体破坏鱼体粘液层和上皮组织，大量吸取宿主血液，吞食宿主表皮细胞，导致鱼体表破损、溃烂，呼吸困难，贫血，眼球溃烂甚至失明，而且常引起继发性的细菌感染而大量死亡，给海水养殖业造成巨大损失。常用的治疗方法主要有淡水和化学杀虫剂治疗。但是，淡水治疗耗费人力物力巨大，对网箱养殖水域的虫卵和幼虫未起到杀灭作用，不能根治；而使用杀虫剂则存在药物残留，毒副作用较大，容易造成二次污染等问题。因此，迫切需要研发安全高效防治新本尼登虫病的产品。中草药是绿色天然药物，毒副作用小，多组分多靶点多功效，易降解，无残留和污染等优势，内服后能提高鱼体抗病能力，具有开发成安全高效绿色渔药的前景。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物。该中草药组合物能显著增强鱼体抗单殖吸虫病的能力；尤其适用于海水鱼养殖过程中新本尼登虫病的防治。
本发明的另一目的在于提供一种上述鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种上述鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物，该中草药组合物由以下按重量百分比计的原料药制备而成：猪苓(polyporusumbellatus)5％～10％，羌活(notopterygiumincisum)25％～40％，淡竹叶(lophatherumgracile)10％～20％，牡丹皮(paeoniasuffruticosa)15％～25％，紫草(lithospermumerythrorhizon)10％～20％。
优选的，该中草药组合物由以下按重量百分比计的原料药制备而成：猪苓5％～10％，羌活28％～40％，淡竹叶17％～20％，牡丹皮21％～25％，紫草16％～20％。
优选的，所述的单殖吸虫病为新本尼登虫病。
优选的，引起新本尼登虫病的病原为梅氏新本尼登虫。
上述鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物的制备方法，包括以下操作步骤：
(1)将原料药猪苓、羌活、淡竹叶、牡丹皮和紫草，分别干燥后粉碎，过筛，得到各原料药干粉；
(2)将步骤(1)所述的各原料药干粉按照上述重量百分比混合，得到鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物干粉。
步骤(1)中所述的干燥是在烘箱中于55～65℃烘干；
步骤(1)中所述的过筛的目数为200～300目。
步骤(2)中所得鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物干粉采用塑料袋密封，置于干燥处储存。
上述的一种鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物的制备方法，还可以包括以下操作步骤：
(1)将原料药猪苓、羌活、淡竹叶、牡丹皮和紫草，分别干燥后粉碎，过筛，得到各原料药干粉；
(2)将步骤(1)所述的各原料药干粉按照上述重量百分比混合，加水浸泡后，连续煎煮两次，过滤，合并滤液，得到滤液a；
(3)将步骤(2)所得的滤液a煮沸，浓缩，得到鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物液体制剂。
步骤(1)中所述的干燥是在烘箱中55～65℃烘干；
步骤(1)中所述的过筛的目数为40～60目。
步骤(2)中所述的加水的体积为各原料药干粉混合后总重量的15～30倍；
步骤(2)中所述的浸泡的温度为60～80℃，时间为60～120分钟；
步骤(2)中所述的煎煮两次的第一次煎煮是采用文火煎煮50～60分钟，第二次煎煮是采用文火煎煮40～45分钟；
步骤(2)中所述的过滤是先用三层纱布过滤，再用筛绢过滤。
步骤(3)中所述的鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物液体制剂的浓度按照1000g原料药制备得到1升鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物药液计算。
上述的一种鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物在制备防治鱼类寄生虫病的饲料添加剂或饲料中的应用。
所述的鱼类优选为金鲳鱼或大黄鱼。
本发明鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物不论是干粉还是液体制剂都能起到防治新本尼登虫病的作用。使用时将鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物干粉或液体制剂按照质量百分含量0.5～6％的比例添加到饲料中投喂鱼，饲料的投喂量为鱼体重的2～5％。
本发明的原理是：经过对该中草药组合物中每一种中草药离体杀灭梅氏新本尼登虫试验发现，猪苓、羌活、淡竹叶、牡丹皮和紫草对新本尼登虫均有一定杀灭效果。据文献报道，中草药猪苓为多孔菌科植物猪苓的干燥菌核，其主要有效成分为猪苓多糖，猪苓多糖具有抗肿瘤、抗菌、增强机体免疫、利尿等生物学功能。羌活主含挥发油、香豆素类化合物等化学成分，具有抗炎镇痛、抗心律失常、抗心肌缺血、促进脑循环、抗血栓形成及抗菌等药理作用。淡竹叶为禾本科草本植物淡竹叶的干燥茎叶，淡竹叶已知的化学成分主要以黄酮类为主，现代药理证明，淡竹叶有解热、利尿、抗菌作用。牡丹皮来源于毛茛科植物牡丹的根皮，其主要化学成分为酚类及酚苷类、单萜及单萜苷类，其他成分还有三萜、甾醇及其苷类、黄酮、有机酸、香豆素等，其药理作用主要有抗炎、抗菌、对心血管系统的调节作用、中枢抑制作用、影响免疫功能等。紫草的化学成分主要为萘醌类、单萜苯酚及苯醌类、酚酸及其盐类、生物碱类、脂肪族及酯类化合物，其药理活性主要有抑菌、抗炎、抗病毒、保肝、抗氧化抗肿瘤和免疫调节作用等。将这些中草药组合在一起，既有防治疾病的功能，也有调节免疫的功能。对不同比例组合反复试验，确定了上述各种药物组成的合适比例。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物具有显著防治新本尼登虫病的作用，是理想的内服防治鱼类单殖吸虫病尤其是新本尼登虫病的安全绿色产品；该组合物通过投喂的方式进入鱼体，对鱼毒性小，在环境中易降解，无残留，避免了化学药物残留造成的水产品质量安全风险，保障水环境和水产品质量安全，同时也减少了人力物力的消耗；易于产业化生产及推广，在水产上具有广阔应用前景。
(2)本发明原料药资源丰富，生产方法简单易行，用药成本不高，也适用自己配处方自制药剂。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中用到的寄主模型鱼为金鲳鱼(trachinotusovatus(linnaeus))，来源于中国水产科学研究院南海水产研究所。寄生虫模型为梅氏新本尼登虫(neobenedeniamelleni)，来源于湛江市恒兴渔业公司特呈岛养殖基地。
实施例1
(1)将原料药分别在烘箱中于55℃烘干后粉碎，过200目筛，得到各原料药干粉；
(2)将步骤(1)所得各原料药干粉按如下重量混合均匀：猪苓40g，羌活160g，淡竹叶85g，牡丹皮125g，紫草90g，得到鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物干粉；所得鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物干粉采用塑料袋以0.5kg每袋分装密封，置于干燥处储存。
本实施例的猪苓产自四川，羌活产自四川，淡竹叶产自湖南，牡丹皮产自广东，紫草产自山东。
实施例2
(1)将原料药分别在烘箱中于60℃烘干后粉碎，过250目筛，得到各原料药干粉；本实施例各原料药的来源同实施例1；
(2)将步骤(1)所得各原料药干粉按如下重量混合均匀：猪苓25g，羌活200g，淡竹叶90g，牡丹皮105g，紫草80g，得到鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物干粉；所得鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物干粉采用塑料袋以0.5kg每袋分装密封，置于干燥处储存。
实施例3
(1)将原料药分别在烘箱中于65℃烘干后粉碎，过300目筛，得到各原料药干粉；本实施例各原料药的来源同实施例1；
(2)将步骤(1)所得各原料药干粉按如下重量混合均匀：猪苓50g，羌活140g，淡竹叶100g，牡丹皮110g，紫草100g，得到鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物干粉；所得鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物干粉采用塑料袋以0.5kg每袋分装密封，置于干燥处储存。
实施例4
(1)将原料药分别在烘箱中于55℃烘干后粉碎，过40目筛，得到各原料药干粉；本实施例各原料药的来源同实施例1；
(2)将步骤(1)所得各原料药干粉按如下重量混合均匀：猪苓80g，羌活320g，淡竹叶170g，牡丹皮250g，紫草180g，加15升水于60℃浸泡120分钟，文火煎煮60分钟，再加15升水文火煎煮45分钟，用三层纱布过滤后，再用筛绢过滤，合并滤液，得滤液a；
(3)将滤液a煮沸，浓缩，得到1升鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物液体制剂。
实施例5
(1)将原料药分别在烘箱中于60℃烘干后粉碎，过50目筛，得到各原料药干粉；本实施例各原料药的来源同实施例1；
(2)将步骤(1)所得各原料药干粉按如下重量混合均匀：猪苓50g，羌活400g，淡竹叶180g，牡丹皮210g，紫草160g，加20升水于70℃浸泡100分钟，文火煎煮50分钟，再加20升水文火煎煮40分钟，用三层纱布过滤后，再用筛绢过滤，合并滤液，得滤液a；
(3)将滤液a煮沸，浓缩，得到1升鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物液体制剂。
实施例6
(1)将原料药分别在烘箱中于65℃烘干后粉碎，过60目筛，得到各原料药干粉；本实施例各原料药的来源同实施例1；
(2)将步骤(1)所得各原料药干粉按如下重量混合均匀：猪苓100g，羌活280g，淡竹叶200g，牡丹皮220g，紫草200g，加30升水于80℃浸泡60分钟，文火煎煮50分钟，再加30升水文火煎煮40分钟，用三层纱布过滤后，再用筛绢过滤，合并滤液，得滤液a；
(3)将滤液a煮沸，浓缩，得到1升鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物液体制剂。
实施例7
(1)中草药组合物乙醇浸膏的制备：称取实施例1中所得的鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物干粉20g，放入中药材提取罐中，再加入500ml95％的乙醇，室温浸泡提取24h，重复3次，得到总提取液；将总提取液在旋转蒸发仪中进一步减压浓缩，所得浓缩液置于55℃烘箱中干燥至恒重。
(2)中草药组合物乙醇浸膏药液的配制：称取中草药组合物乙醇浸膏2～5mg置于2.0ml的ep管中，用含0.1％二甲基亚砜的过滤海水(盐度为30‰)进行溶解，配成2560mg/l的药物原液，储存于4℃冰箱备用。采用2560mg/l的药物原液，用过滤海水配制成不同浓度(1024、512、256、128、64、32、24、16、8、4mg/l)的药液作为工作液备用。
(3)梅氏新本尼登虫成虫离体活性检测：在24孔板的各孔中分别加入300μl海水，然后用镊子从患新本尼登虫病的金鲳鱼体表小心取下成虫，每孔放入5只，各加入300μl不同浓度的药液，使最终浓度为512、256、128、64、32、16、12、8、4、2和0(对照，海水组)mg/l，每个浓度设置3个平行。4倍显微镜下统计8h内成虫的死亡时间。
结果显示：中草药组合物的乙醇粗提物对离体梅氏新本尼登虫成虫具有良好的杀灭活性，其8h内对梅氏新本尼登虫成虫的最低致死浓度为128mg/l。
实施例8
(1)中草药组合物液体制剂药液的配制：吸取实施例4中所得的鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物液体制剂2.0ml置于ep管中，以此作为药物原液，该原液浓度为1000g/l。然后用过滤海水将该药物原液配制成不同浓度的工作液(200、20、2、0.2、0.02、0.002g/l)，置于4℃冰箱中备用。
(2)梅氏新本尼登虫成虫离体活性检测：在24孔板的各孔中分别加入300μl海水，然后用镊子从患新本尼登虫病的金鲳鱼体表小心取下成虫，每孔放入5只，各加入300μl不同浓度的工作液，使最终浓度为100、10、1、0.1、0.01、0.001和0(对照，海水组)g/l，每个浓度设置3个平行。4倍显微镜下统计8h内成虫的死亡时间。
结果显示：中草药组合物液体制剂对离体梅氏新本尼登虫成虫也具有良好的杀灭活性，其8h内对梅氏新本尼登虫成虫的最低致死浓度为1g/l。
实施例9
(1)中草药组合物饲料的制作：将实施例1所得鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物干粉按质量百分含量6％的比例加入基础浮性饲料(购买于湛江恒兴珊瑚饲料有限公司)中，用饵料机加工成浮性颗粒料，即中草药组合物饲料，备用。其中，将基础浮性饲料用饵料机加工成浮性颗粒料为基础浮性颗粒饲料。
(2)实验动物：健康金鲳，体重为203.6±18.1g。架设6个海水网箱(4.0×4.0×4.5m)，分成两组，一组为实验组，另一组为对照组，每组设置3个重复；每个海水网箱中投入金鲳800尾，驯养2～4周后，放入标记好的50尾已感染梅氏新本尼登虫的病鱼进行感染。30天后随机选取200尾金鲳，检测体表，确定梅氏新本尼登虫的平均感染强度为22.5±3.2，进行后续试验。
(3)新本尼登虫病治疗实验：实验组按照金鲳鱼体重2％的重量比投喂中草药组合物饲料，每天于9:00和16:00分别投喂两次，对照组则投喂未添加中草药的浮性颗粒饲料(基础浮性颗粒饲料)。连续投喂饲料14天后，每个网箱分别取40尾金鲳，淡水浸泡后统计体表梅氏新本尼登虫的数量，计算在各时间点下梅氏新本尼登虫的平均感染强度和感染率。同时，在实验期间统计金鲳鱼的死亡情况，并计算金鲳鱼存活率。
平均感染强度＝梅氏新本尼登虫总数/感染梅氏新本尼登虫的鱼数；
感染率(％)＝(感染梅氏新本尼登虫的鱼数/总鱼数)×100％；
存活率(％)＝(实验后存活鱼数/实验前总鱼数)×100％；
结果显示：投喂本发明中草药组合物饲料可显著提高金鲳鱼抗梅氏新本尼登虫的效果，甚至可以完全去除梅氏新本尼登虫的感染，同时也极大地提高了金鲳鱼的存活率。
从平均感染强度和感染率上看，第14天时对照组梅氏新本尼登虫的平均感染强度和感染率分别为21.20和79.20％，而实验组梅氏新本尼登虫的平均感染强度和感染率均为0。另外，实验组的金鲳存活率高达87.00％，显著高于对照组(49.20％)。
实施例10
(1)中草药组合物饲料的制作：将实施例4制备的鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物液体制剂按照饲料质量6％的比例用喷壶均匀喷洒在基础浮性颗粒饲料上，放在干燥箱55℃烘干，得中草药组合物饲料，备用。
(2)实验动物：同实施例9。
(3)新本尼登虫病治疗实验：实验组按照金鲳鱼体重2％的重量比投喂上述中草药组合物饲料，每天于9:00和16:00分别投喂两次，对照组则投喂未添加中草药的浮性颗粒饲料(基础浮性颗粒饲料)。连续投喂饲料14天后，每个网箱分别取40尾金鲳，淡水浸泡后统计体表梅氏新本尼登虫的数量，计算在各时间点下梅氏新本尼登虫的平均感染强度和感染率。同时，统计金鲳鱼的死亡情况，并计算金鲳鱼存活率。梅氏新本尼登虫的平均感染强度、感染率和金鲳鱼存活率的计算方法同实施例9。
结果显示：投喂本发明中草药组合物饲料可显著提高金鲳鱼抗梅氏新本尼登虫的效果，从平均感染强度和感染率上看，对照组在第14天时梅氏新本尼登虫的平均感染强度和感染率分别为19.5和86.2％，而实验组梅氏新本尼登虫的平均感染强度和感染率均为0。另外，实验组的金鲳存活率为82.97％，较对照组(40.17％)提升了42.80％。
实施例11
(1)中草药组合物饲料的制作：将实施例4制备的鱼用防治单殖吸虫病的中草药组合物液体制剂按照饲料质量20％的比例用喷壶均匀喷洒在基础浮性颗粒饲料上，放在干燥箱55℃烘干，得中草药组合物饲料，备用。
(2)实验动物：健康金鲳共300尾，体重为21.8±3.3g。按照金鲳鱼体重2％的重量比投喂基础浮性颗粒饲料，每天于9:00和16:00分别投喂两次。实验室人工海水(盐度为30‰)驯养2～4周。
(3)中草药组合物对金鲳鱼的毒性实验：实验分成实验组和对照组两组，每组设置3个重复，每个重复50尾金鲳。实验组按照金鲳鱼体重2％的重量比投喂中草药组合物饲料，每天于9:00和16:00分别投喂两次，对照组则只投喂未添加中草药的浮性颗粒饲料(基础浮性颗粒饲料)。连续投喂饲料10天后，分别取两组金鲳5尾，尾静脉取血，在离心机中3000r/min离心6min后收集血清，测定谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)的活力。同时，统计实验期间金鲳鱼的死亡情况，计算金鲳鱼存活率。
存活率(％)＝(实验后存活鱼数/实验前总鱼数)×100％；
结果显示：投喂本发明中草药组合物饲料对金鲳鱼的毒性小，在中草药组合物液体制剂添加量为20％时，第10天实验组鱼体内的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力分别为14.02u/l和15.44u/l，对照组的谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力分别为13.83u/l和16.14u/l，两者相比无显著差异。另外，实验组在10天的实验过程中未出现金鲳鱼死亡的现象，存活率与对照组相同，均为100％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。