一种天麻提取物及其用途的制作方法

本发明涉及医药
技术领域：
，尤其涉及一种天麻提取物及其用途。
背景技术：
：脑卒中后下肢肌肉功能障碍、老年性肌少症、缺血性肌肉萎缩等疾病都会发生骨骼肌萎缩，骨骼肌萎缩的一个主要后果是肌肉力量的下降和肌肉功能的严重恶化，目前临床上尚缺乏确切的预防或治疗药物。脑卒中是由于脑血流骤然减少或中断，脑组织出现缺血、缺氧，继而导致不同程度神经功能损伤的疾病，是世界第二大致残原因。骨骼肌萎缩还是中风患者的严重并发症，致使中风患者出现偏瘫，肌肉力量下降或肌张力增高等异常肌肉功能障碍，从而影响下肢肌肉功能，出现运动功能障碍，严重影响患者愈后生活，给患者自己、家庭甚至社会带来了沉重的负担。肌少症是一种与年龄相关的骨骼肌质量和功能下降的老年病，发病率较高，随着老龄化人口比例的不断上升，提高老年人寿命及生活质量是医疗保健的一个重大挑战。因此，防治骨骼肌萎缩，研制有效的药物迫在眉睫。天麻又名赤箭，是我国的名贵中药。《本经》记载：“赤箭辛，温，无毒，久服益力气，长阴肥健，轻身增年”，可见，天麻自古以来就有作为保健食品食用的记载，现代药理学研究证明天麻具有多样的药理活性。然而，迄今尚未有关于天麻及其酚酯类成分用于治疗和/或预防骨骼肌萎缩的公开报道。技术实现要素：本发明的其中一个目的是提出一种天麻提取物及其用途，解决了现有技术中骨骼肌萎缩缺乏确切的预防或治疗药物的技术问题。本发明优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：本发明的天麻提取物是以天麻为原料制得的，所述天麻提取物包括以下酚酯类成分：对甲氧基苄醇、对羟基苯甲醛、3,4-二羟基苯甲醛。根据一个优选实施方式，所述天麻提取物的制备方法包括如下步骤：醇提：称取天麻，粉碎后过10目筛，按照每千克天麻加入4～8l的量加入质量浓度为70％～90％的乙醇，回流提取1～3次，每次1～3h，合并回流提取后的上清黄色液体，浓缩得醇提物；洗脱：醇提取物经过大孔树脂以30％-90％的乙醇梯度洗脱得天麻提取物。根据一个优选实施方式，醇提步骤中，采用旋转蒸发仪或水浴浓缩得醇提物。本发明的另一方面还提供了本发明任一技术方案所述的天麻提取物在制备治疗和/或预防骨骼肌萎缩药物的用途。根据一个优选实施方式，所述药物用于治疗和/或预防脑卒中后下肢肌肉功能障碍、老年性肌少症、缺血性肌肉萎缩中的一种或几种。根据一个优选实施方式，所述药物是以有效量的天麻提取物为活性成分，并加入辅料和/或辅助性成分制备而成的制剂。根据一个优选实施方式，所述药物是以有效量的天麻提取物所含的酚酯类成分为活性成分，并加入辅料和/或辅助性成分制备而成的制剂，其中，所述的酚酯类成分包括：对甲氧基苄醇、对羟基苯甲醛、3,4-二羟基苯甲醛。根据一个优选实施方式，所述制剂为口服制剂。根据一个优选实施方式，所述口服制剂为胶囊剂、颗粒剂或片剂。本发明提供的天麻提取物及其用途至少具有如下有益技术效果：本发明提供的天麻提取物用于制备治疗和/或预防骨骼肌萎缩药物，其可恢复下肢平衡能力，减轻对称性的自体感觉缺失情况，提高前肢的运动协调能力，能促进缺血区血管新生，增加缺血部位血流量，促进侧支循环建立，从而达到治疗和/或预防骨骼肌萎缩的效果，解决了现有技术中骨骼肌萎缩缺乏确切的预防或治疗药物的技术问题。本发明提供的天麻提取物制备方法简单，原料来源广泛、价格低廉、疗效显著，具有良好的临床应用前景。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明的天麻提取物对大鼠前肢肌肉功能障碍影响的结果图；图2是本发明的天麻提取物对大鼠四肢协调平衡能力及肌肉损伤程度影响的结果图；图3是本发明的天麻提取物对大鼠对称性自体感觉缺失情况影响的结果图；图4是本发明的天麻提取物对小鼠下肢缺血模型缺血部位血流量影响的结果图；图5是本发明的天麻提取物对小鼠下肢缺血模型缺血侧下肢腓肠肌新生血管影响的结果图(7d)；图6是本发明的天麻提取物对小鼠下肢缺血模型缺血侧下肢腓肠肌新生血管影响的结果图(14d)；图7是本发明的天麻酚酯类成分对大鼠四肢协调平衡能力及肌肉损伤程度影响的结果图；图8是本发明的天麻酚酯类成分对小鼠下肢缺血模型缺血部位血流量影响的结果图；图9是本发明的天麻酚酯类成分对小鼠下肢缺血模型缺血侧下肢腓肠肌新生血管影响的结果图(7d)；图10是本发明的天麻酚酯类成分对小鼠下肢缺血模型缺血侧下肢腓肠肌新生血管影响的结果图(14d)。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。下面结合附图对本发明的天麻提取物及其用途进行详细说明。本发明的天麻提取物是以天麻为原料制得的，所述天麻提取物包括以下酚酯类成分：对甲氧基苄醇、对羟基苯甲醛、3,4-二羟基苯甲醛。优选的，所述天麻提取物的制备方法包括如下步骤：醇提：称取天麻，粉碎后过10目筛，按照每千克天麻加入4～8l的量加入质量浓度为70％～90％的乙醇，回流提取1～3次，每次1～3h，合并回流提取后的上清黄色液体，浓缩得醇提物；洗脱：醇提取物经过大孔树脂以30％-90％的乙醇梯度洗脱得天麻提取物。优选的，醇提步骤中，采用旋转蒸发仪或水浴浓缩得醇提物。本发明的另一方面还提供了本发明任一技术方案所述的天麻提取物在制备治疗和/或预防骨骼肌萎缩药物的用途。优选的，所述药物用于治疗和/或预防脑卒中后下肢肌肉功能障碍、老年性肌少症、缺血性肌肉萎缩中的一种或几种。优选的，所述药物是以有效量的天麻提取物为活性成分，并加入辅料和/或辅助性成分制备而成的制剂。优选的，所述药物是以有效量的天麻提取物所含的酚酯类成分为活性成分，并加入辅料和/或辅助性成分制备而成的制剂，其中，所述的酚酯类成分包括：对甲氧基苄醇、对羟基苯甲醛、3,4-二羟基苯甲醛。优选的，所述制剂为口服制剂。更优选的，所述口服制剂为胶囊剂、颗粒剂或片剂。本发明提供的天麻提取物用于制备治疗和/或预防骨骼肌萎缩药物，其可恢复下肢平衡能力，减轻对称性的自体感觉缺失情况，提高前肢的运动协调能力，能促进缺血区血管新生，增加缺血部位血流量，促进侧支循环建立，从而达到治疗和/或预防骨骼肌萎缩的效果，解决了现有技术中骨骼肌萎缩缺乏确切的预防或治疗药物的技术问题。本发明提供的天麻提取物制备方法简单，原料来源广泛、价格低廉、疗效显著，具有良好的临床应用前景。以下通过实验证明本发明的天麻提取物及其用途的有益效果。1.实验材料1.1实验动物成年健康雄性sd大鼠，体重250～300g，spf级，购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号：scxk(川)2015-030，批号：no.51203500005578、no.51203500005580。1.2实验药品天麻提取物，实验室自制；对甲氧基苄醇，购于北京百灵威科技有限公司，批号：134868；对羟基苯甲醛，购于北京百灵威科技有限公司，批号：187581；3,4-二羟基苯甲醛，购于北京百灵威科技有限公司，批号：256775。1.3受试物配制(1)天麻提取物：分析天平精密称取天麻提取物适量，加入适量吐温(1％吐温-80)，完全溶解后加入蒸馏水定容，4℃密封保存，每三天配药一次，配药浓度为26.23mg/ml(即262.3mg/kg)。(2)天麻酚酯类成分：分析天平分别准确称取140mg对甲氧基苄醇、对羟基苯甲醛、3,4-二羟基苯甲醛，用1ml吐温-80助溶，双蒸水溶解并定容至100ml，4℃避光保存，每三天配药一次，配药浓度为2mg/ml(即20mg/kg)。2.实验方法2.1天麻提取物对大鼠前肢肌肉功能障碍的影响2.1.1复制大鼠脑中动脉阻塞再灌注(mcao/r)模型雄性sd大鼠以10％水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧固定在37℃恒温台上，大鼠颈部脱毛，在颈部正中开1cm小口，颈正中偏左0.5cm处切口约1.5cm，分离右侧颈总动脉至分叉处，结扎颈总动脉近心端，在距分叉1cm处剪一缺口，将线栓经缺口插入。调整进线角度，使线栓通过颈内动脉到达较细的大脑前动脉(线栓插入深度为18-20mm、微遇阻力时停止)，此时即完成一侧大脑中动脉阻塞(mcao)，记录此时的时间，并计算2h后再灌注的时间。mcao后2h缓慢拔出线栓即可实现大脑中动脉再灌注，完成脑缺血再灌注损伤模型(mcao/r)。在缺血及再灌注期间保持室温在25℃左右。2.1.2天麻提取物对mcao/r模型大鼠前肢肌肉功能障碍的影响动物随机编号，复制大鼠mcao/r模型，确认手术成功后，随机且均匀地分为假手术(sham)组、模型(model)组、天麻提取物(ge2-1)组，每组6只，受试物组分别于术后6h首次灌胃给药(1ml/100g)，受试物给予天麻提取物，正常组、模型组给予相同体积的溶媒。于给药后7d、14d、21d、28d采用攀绳实验(详见表1)以评价天麻提取物对大鼠前肢肌肉功能障碍的影响。表1攀绳实验评分表攀绳实验(正常0分，最多3分)评分大鼠前肢抓住一直径2mm的钢绳，抓住5s以上，并有后肢攀上绳子0能抓住5s，但后肢不能攀上绳子1能抓住3～4s2仅能抓住0～2s32.2天麻提取物对大鼠四肢协调平衡能力及肌肉损伤程度的影响动物随机编号，复制大鼠mcao/r模型，确认手术成功后，随机且均匀地分为假手术(sham)组、模型(model)组、天麻提取物(ge2-1)组，每组6只，受试物组分别于术后6h首次灌胃给药(1ml/100g)，受试物给予天麻提取物，正常组、模型组给予相同体积的溶媒。于给药后7d、14d、21d、28d采用平衡木行走实验(详见表2)以评价天麻提取物对大鼠四肢协调平衡能力及肌肉损伤程度的影响。表2平衡木行走实验评分表平衡木行走实验(正常0分，最多6分)评分顺利走过0能走过去，偶尔打滑1能走过去，超过50％的步子打滑2能走过去，但患侧后肢不起作用3在行走时掉下来4能呆在平衡木上面，但不能走5不能呆，掉下来62.3天麻提取物对大鼠对称性自体感觉缺失情况的影响动物随机编号，复制大鼠mcao/r模型，确认手术成功后，随机且均匀地分为假手术(sham)组、模型(model)组、天麻提取物(ge2-1)组，每组6只，受试物组分别于术后6h首次灌胃给药(1ml/100g)，受试物给予天麻提取物，正常组、模型组给予相同体积的溶媒。于给药后7d、14d、21d、28d采用步态分析(肢体对称)实验(详见表3)以及转角实验以评价天麻提取物对大鼠对称性自体感觉缺失情况的影响。表3步态分析试验评分表步态分析实验(正常0分，最多3分)评分轻提大鼠尾巴末端，使后肢离地行走，双前肢对称伸展，沿直线协调行走0对侧前肢较同侧前肢伸展少，稍向对侧倾行走1对侧前肢稍有伸展，行走时向对侧打转2无法行走3转角测试实验：实验装置为由两块60cm×40cm×1cm的平板构成30°的夹角。当实验动物(小鼠或大鼠)进入夹角(corner)深部，双侧的触须将受到刺激，继而大鼠将站立并转身面向夹角的开口端。正常大鼠向左向右转身的几率基本相等，而一侧脑损伤的大鼠则以向脑损伤同侧转身为主。不对称分值＝(向出血侧作“站立转身”的次数/总的“站立转身”的次数)×100％，正常基线为50％，分值越高，反映损伤越严重。2.4天麻提取物对小鼠下肢缺血模型血管新生的影响雄性昆明种小鼠，随机分为假手术(sham)组、模型(model)组、天麻提取物(ge2-1)组，造模后连续给予天麻提取物，分别于给予受试物后第1d、3d、7d、14d，采用激光散斑扫描仪检测血流量，观察血流恢复情况；术后7d、14d采用免疫荧光三标法(ki67/tomato-lectin/dapi)标记腓肠肌组织新生血管。2.5天麻酚酯类成分对大鼠四肢协调平衡能力及肌肉损伤程度的影响动物随机编号，复制大鼠mcao/r模型，确认手术成功后，随机且均匀地分为假手术(sham)组、模型(model)组、天麻成分对甲氧基苄醇组、对羟基苯甲醛组、3,4-二羟基苯甲醛组，造模后连续给予酚酯类成分，每组6只，受试物组分别于术后6h首次灌胃给药(1ml/100g)，受试物给予天麻成分对甲氧基苄醇、对羟基苯甲醛、3,4-二羟基苯甲醛，正常组、模型组给予相同体积的溶媒。于给药后1d、7d、14d采用平衡木实验(详见表4)以评价天麻酚酯类成分对大鼠四肢协调平衡能力及肌肉损伤程度的影响。表4平衡木实验试验评分表神经学症状评分可通过平衡木，未出现失足6可通过平衡木，仅出现一次失足5可穿过平衡木，出现失足且后肢失足率<50％4可通过平衡木，出现失足且后肢失足率>50％3不能通过平衡木，但可坐在上面2不能通过平衡木，坐在平衡木上时会掉落下来12.6天麻酚酯类成分对小鼠下肢缺血模型血管新生的影响雄性昆明种小鼠，随机分为假手术(sham)组、模型(model)组、天麻成分对甲氧基苄醇组、对羟基苯甲醇组、对羟基苯甲醛组、3,4-二羟基苯甲醛组，造模后连续给予酚酯类成分，分别于给予受试物后第1d、3d、7d、14d，采用激光散斑扫描仪检测血流量，观察血流恢复情况；术后7d、14d采用免疫荧光三标法(ki67/tomato-lectin/dapi)标记腓肠肌组织新生血管。3.数据处理本实验所得数据用graphpadprism软件进行统计分析，结果以均数±标准差(mean±sd)表示，数据先进性正态分布检验，数据不符合正态分布采用非参数检验；当数据符合正态分布则进行方差齐性检验，方差齐时采用单因素方差分析(one-wayanove)，先进行dunnett分析，如组间需要进行比较再进行tukey分析，当方差不齐时采用秩合检验(kruskal-wallistest)，以p<0.05为差异具有统计学意义。4.实验结果4.1天麻提取物对大鼠前肢肌肉功能障碍的影响详见表5、图1，结果显示，与sham组比较，model组在灌注7d、14d攀绳实验评分升高，差异具有统计学意义(▲▲p<0.01，▲p<0.05)；与model组比较，天麻提取物(ge2-1)给予大鼠14天、21天后，能明显降低模型大鼠攀绳实验评分，差异具有统计学意义(**p<0.01，*p<0.05)，表明：天麻提取物可改善脑卒中引起的大鼠前肢肌肉功能障碍。表5天麻提取物对大鼠前肢肌肉功能障碍的影响(mean±sd，n＝6)注：与sham组比较：▲p<0.05，▲▲p<0.01；与model组比较：*p<0.05，**p<0.01。4.2天麻提取物对大鼠四肢协调平衡能力及肌肉损伤程度的影响详见表6、图2，结果显示，与sham组比较，model组在灌注7d、14d、21d、28d平衡木行走实验评分均升高，差异具有统计学意义(▲▲▲p<0.001，▲▲p<0.01，▲p<0.05)；与model组比较，天麻提取物(ge2-1)给予大鼠7天、14天、28天后，能明显降低模型大鼠平衡木行走实验评分，差异具有统计学意义(**p<0.01，*p<0.05)，表明：天麻提取物可恢复脑卒中大鼠四肢协调平衡能力，并减轻肌肉损伤程度。表6天麻提取物对大鼠四肢协调平衡能力及肌肉损伤程度的影响(mean±sd，n＝6)注：与sham组比较：▲▲p<0.01，▲▲▲p<0.001；与model组比较：*p<0.05，**p<0.01。4.3天麻提取物对大鼠对称性自体感觉缺失情况的影响详见表7、表8、图3，结果显示，与sham组比较，model组再灌注7d、14d、21d、28d步态分析实验评分及转角实验评分均升高，差异具有统计学意义(▲▲▲p<0.001，▲▲p<0.01，▲p<0.05)；与model组比较，天麻提取物(ge2-1)给予大鼠7天、14天后，能明显降低模型大鼠转角实验评分，差异具有统计学意义(**p<0.01，*p<0.05)，步态分析实验评分有降低趋势，表明：天麻提取物可改善脑卒中大鼠对称性自体感觉缺失情况。表7天麻提取物对大鼠对称性自体感觉缺失情况的影响(mean±sd，n＝6)注：与sham组比较：▲p<0.05，▲▲▲p<0.001。表8天麻提取物对大鼠对称性自体感觉缺失情况的影响(mean±sd，n＝6)注：与sham组比较：▲▲p<0.05，▲▲▲p<0.01；与model组比较：*p<0.05。4.4天麻提取物对小鼠下肢缺血模型血管新生的影响4.4.1天麻提取物对小鼠下肢缺血模型缺血部位血流量的影响详见表9、图4，结果显示，与sham组比较，model组小鼠手术侧血流量明显下降(p<0.001)，缺血侧下肢血流量下降至未缺血侧50％的动物视为造模成功；与model组比较，术后3d、7d，ge2-1组小鼠手术侧血流量增加(p<0.001)。表明：天麻提取物能增加下肢缺血模型小鼠缺血部位血流量的作用。表9天麻提取物对下肢缺血小鼠手术侧血流量的影响注释：与sham组比较，▲▲▲p<0.001；与model组比较，***p<0.001。4.4.2天麻提取物对小鼠下肢缺血模型缺血侧下肢腓肠肌新生血管的影响详见图5、图6，结果显示，与model组比较，天麻提取物给予小鼠7d、14d后，能明显增加下肢缺血模型小鼠缺血侧下肢腓肠肌tomato-lectin和ki67的阳性表达。表明：天麻提取物能促进下肢缺血模型小鼠缺血部位的血管新生，具有促进侧支循环建立的作用。4.5天麻酚酯类成分对大鼠四肢协调平衡能力及肌肉损伤程度的影响详见图7，结果显示，天麻成分对甲氧基苄醇(c-20)预防性给药5d后，有升高mcao/r模型大鼠平衡木评分的趋势；天麻成分对羟基苯甲醛(d-20)治疗性给药14d后，能明显升高mcao/r模型大鼠平衡木评分；天麻成分3,4-二羟基苯甲醛(h-10)治疗性给药7d后，能明显升高mcao/r模型大鼠平衡木评分。表明：天麻酚酯类成分可恢复脑卒中大鼠四肢协调平衡能力，并减轻肌肉损伤程度。4.6天麻酚酯类成分对小鼠下肢缺血模型血管新生的影响4.6.1天麻酚酯类成分对天麻酚酯类成分对小鼠下肢缺血模型缺血部位血流量的影响详见图8，结果显示，与sham组比较，model组小鼠手术侧血流量明显下降(p<0.001)，缺血侧下肢血流量下降至未缺血侧50％的动物视为造模成功；与model组比较，治疗性给予天麻酚酯类成分1d、3d、7d，对甲氧基苄醇(c-20)、对羟基苯甲醛(d-20)、3,4-二羟基苯甲醛(h-10)均能明显增加小鼠下肢血流量(p<0.001)；治疗性给予天麻酚酯类成分14d，有增加小鼠下肢血流量的趋势。表明：天麻酚酯类成分能增加下肢缺血模型小鼠缺血部位血流量的作用。4.6.2天麻酚酯类成分对小鼠下肢缺血模型缺血侧下肢腓肠肌新生血管的影响详见图9、图10，结果显示，与model组比较，天麻酚酯类成分治疗性给予小鼠7d、14d后，对甲氧基苄醇(c-20)、对羟基苯甲醛(d-20)、3,4-二羟基苯甲醛(h-10)均能明显增加下肢缺血模型小鼠缺血侧下肢腓肠肌tomato-lectin和ki67的阳性表达。表明：天麻酚酯类成分能促进下肢缺血模型小鼠缺血部位的血管新生，具有促进侧支循环建立的作用。5.结论从上述实验结果证明，本发明提供的天麻提取物及其所含酚酯类成分可恢复下肢平衡能力，减轻对称性的自体感觉缺失情况，提高前肢的运动协调能力，能促进缺血区血管新生，增加缺血部位血流量，促进侧支循环建立，从而达到治疗或/和预防骨骼肌萎缩的效果。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12