本发明是关于药材纯化技术领域，特别是关于一种甘草黄酮的纯化方法及应用。
背景技术：
甘草为豆科多年生草本植物，以根和根茎入药，具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和诸药的功效。黄酮类化合物为甘草的主要有效成分之一，是一类具有c3-c6-c3基本母核的生物活性较强的天然产物。迄今已从甘草中分离鉴定出300多个黄酮类化合物，其中给出结构和名称的有150多个。甘草黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗心律失常、抗溃疡、保肝、解痉、抗菌、抗炎和抗变态反应、抗氧化、酶抑制、调血脂、镇痛、镇咳祛痰、抗艾滋病病毒的活性等多种生物活性，因而使甘草黄酮类天然产物成为国内外新药研究和开发的热点。然而，甘草中黄酮成分种类虽多，但每种黄酮的含量较低，如甘草主要黄酮成分甘草苷含量一般在1％以下(《中国药典》2015年版，一部，甘草苷含量限度要求为≥0.45％)，光果甘草中有“美白黄金”的光甘草定含量一般也仅有0.1％～0.3％，因此，开发利用甘草黄酮成分，提取、富集、纯化甘草黄酮成为业界共识性要解决的问题。
然而目前甘草行业提取物现状是只将甘草中的甘草酸作为主要有效成分进行提取，而富含大量黄酮类化合的甘草渣则作为废料弃去。人们基于对甘草资源的综合利用，也开展了甘草药渣黄酮成分的提取工艺开发，然而收效甚微。传统工艺提取完甘草酸后所剩药渣：1)甘草酸提取过程使用氨水，导致提取完的药渣中含有大量的氨、药渣存放过程中气味难闻、药材中的淀粉等营养成分被破坏，药渣的后续应用受到了极大的限制；2)提取完甘草酸的甘草药渣，水溶性的甘草苷含量很少；3)甘草药渣提取黄酮普遍采用碱溶酸沉的工艺，过程中使用大量的酸水和碱水，一方面破坏目标成分，另一方面给企业带来较大的环保成本。甘草黄酮生产成本较高，限制了甘草黄酮的应用，甘草药渣循环利用受阻，这对有限的甘草资源是极大的浪费。
随着近些年来我国甘草资源的逐年短缺，以及国家对于绿色制造、环境保护的大力提倡，甘草提取行业亟待清洁、高效的甘草有效成分提取工艺开发。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种甘草黄酮的纯化方法及应用，该甘草黄酮的纯化方法实现甘草总黄酮成分的高效纯化，甘草总黄酮含量在23％以上，转移率≥60％，同时避免了传统甘草黄酮纯化工艺中使用的碱水和酸水环节，降低了环境污染压力。
为实现上述目的，本发明提供了一种甘草黄酮的纯化方法，包括以下步骤：甘草黄酮提取液浓缩：将甘草黄酮提取液中加入膨松剂，混匀，烘干，粉碎，得甘草黄酮浸膏粉；初级纯化：将第一溶剂和第二溶剂组成混合溶剂，然后与所述甘草黄酮浸膏粉以(2-10)：1(v/w)的配比混合，搅拌并进行一级提取，收集一级提取液和滤渣，将一级提取液进行溶剂回收，得初级纯化甘草黄酮粉；以及精细纯化：将乙酸乙酯、丙酮中的至少一种与所述初级纯化甘草黄酮粉以(2-10)：1(v/w)混合，搅拌并进行一级提取，收集一级提取液和滤渣，将该一级提取液进行溶剂回收，得精细纯化后的甘草黄酮粉；其中，所述第一溶剂选自氯仿和二氯甲烷中的至少一种，所述第二溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至少一种，通过该方法所获得的甘草总黄酮含量在23％以上，转移率≥60％。
本发明还提供了一种甘草黄酮的纯化方法，包括以下步骤：甘草黄酮提取液浓缩：将甘草黄酮提取液中加入膨松剂，混匀，烘干，粉碎，得甘草黄酮浸膏粉；初级纯化：将第一溶剂和第二溶剂组成混合溶剂，然后与所述甘草黄酮浸膏粉以(2-10)：1(v/w)的配比混合，搅拌并进行一级提取，收集一级提取液和滤渣，将一级提取液进行溶剂回收，得初级纯化甘草黄酮粉；k级提取：将所述混合溶剂与上一级提取获取的滤渣以(2-20)：1(v/w)的配比混合，搅拌并进行k级提取，收集k级提取液和k级滤渣；从k＝2开始执行所述k级提取直至n级提取，从而完成完整的一轮提取，n大于等于2小于等于5；精细纯化：将乙酸乙酯、丙酮中的至少一种与所述初级纯化甘草黄酮粉以(2-10)：1(v/w)混合，搅拌并进行一级提取，收集一级提取液和滤渣，将该一级提取液进行溶剂回收，得精细纯化后的甘草黄酮粉；以及m级提取：将乙酸乙酯、丙酮中的至少一种与上一级提取获取的滤渣以(2-20)：1(v/w)的配比混合，搅拌并进行m级提取，收集m级提取液和m级滤渣；从m＝2开始执行所述m级提取直至n级提取，从而完成完整的一轮提取，n大于等于2小于等于5；其中，所述第一溶剂选自氯仿和二氯甲烷中的至少一种，所述第二溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至少一种。
在本发明的一实施方式中，每级提取的时间均为0.5-2h。
在本发明的一实施方式中，在每轮提取过程中，所述混合溶剂也包括上一轮/批次提取中除所述一级提取液以外的各级提取液(即，所述混合溶剂也包括上一轮/批次提取中所有的k级提取液和m级提取液)。
在本发明的一实施方式中，所述甘草黄酮提取液浓缩步骤中，膨松剂包括硅藻土和珍珠岩，所述膨松剂与所述甘草黄酮提取液的配比为(0.01-0.15)：1(w/v)。
在本发明的一实施方式中，所述甘草黄酮提取液浓缩步骤中，烘干所使用的温度为40～80℃。
在本发明的一实施方式中，所述初级纯化步骤中，所述第一溶剂和所述第二溶剂的体积比为(1-4)：(0.5-3)。
在本发明的一实施方式中，所述初级纯化所获得的甘草黄酮含量≥15％，所述精细纯化所获得的甘草黄酮含量≥23％。
在本发明的一实施方式中，所述精细纯化步骤中，当乙酸乙酯与丙酮同时使用时的体积比为(1-4)：(4-1)。
本发明还提供了上述甘草黄酮的纯化方法在药材纯化中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明甘草黄酮的纯化方法优势在于甘草总黄酮纯化过程中，选择合适的有机溶剂、并将溶剂进行循环使用对有效成分进行提取纯化，既避免了传统黄酮纯化工艺碱溶酸沉过程中使用的大量的酸水和碱水，提高了甘草黄酮成分的转移率，又提高有机溶剂的利用率，从而降低了甘草黄酮的生产成本，提高了甘草资源的利用率。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
以下通过多个实施例对甘草黄酮的纯化方法进行描述。
实施例1
(1)甘草黄酮提取液浓缩：取甘草药材一级提取液经除去非黄酮成分后滤液2000l，减压蒸馏回收液体至适量，加入硅藻土，混匀，80℃烘干，粉碎，得甘草黄酮浸膏粉125.6kg；
(2)一次纯化：取上述甘草黄酮浸膏粉，加入二氯甲烷/水(v/v,2.5/1)混合溶剂进行提取，提取3次，每次0.5小时；每次分别加入混合溶剂377l、251l，251l，分别收集各级提取液和滤渣；一级提取液进行溶剂回收，浸膏60℃烘干，得一次纯化甘草黄酮粉36.72g(芦丁对照uv检测法，甘草总黄酮含量≥15％)，二级、三级提取液继续用于新一轮甘草黄酮浸膏粉的纯化提取；
(3)二次纯化：取上述一次纯化甘草黄酮粉，加入乙酸乙酯/丙酮(v/v,1/1)混合溶剂进行提取，提取2次，每次0.5h；各级提取分别加入混合溶剂147l、110l，分别收集各级提取液和滤渣；一级提取液进行溶剂回收，浸膏60℃烘干，得二次纯化甘草黄酮粉15.93kg，2级提取液继续用于新一轮一次纯化甘草黄酮粉的纯化提取；
(4)甘草总黄酮含量测定：
标准液的制备：称取芦丁标准品20mg(精确到0.1mg)，以60％乙醇溶解于100ml容量瓶中，并稀释至刻度。取此样液20ml于50ml容量瓶中，加60％乙醇溶液5ml，以水稀释至刻度，即得标准液(1ml标准液约含0.08mg芦丁标准品)。
试样液的制备：分别精密称取一次纯化甘草黄酮粉、二次纯化甘草黄酮粉各20mg,至50ml容量瓶中，以60％乙醇稀释至刻度，即得试样液。
分别取上述两液各5ml于10ml容量瓶中，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，静置6min，加10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，静置6min，加入1mo/l氢氧化钠溶液4ml，摇匀，用30％乙醇定容，静置15min，用1cm比色皿，在波长510nm处测吸光度。
总黄酮的浓度c，按下式计算
c＝k*m1*a/a0/2500
式中：
m1—标准品中黄酮重量(mg)；
a—试样的吸光度；
a0—标准品的吸光度；
k—试样的稀释倍数。
统计应用一次纯化甘草黄酮粉、一次纯化甘草黄酮粉的含量和收率，数据见表1。
表1实施例1甘草黄酮粉含量测定
由表中数据看出，经过上述纯化步骤处理，一次纯化甘草黄酮粉含量为18.83％，甘草总黄酮转移率为84.12％，二次纯化甘草黄酮粉含量为27.57％，甘草总黄酮转移率相对一次纯化甘草黄酮粉为74.44％，整体工艺甘草总黄酮的转移率为62.62％。整体工艺过程中，没有酸水和碱水的应用，有机溶剂得到高效回收利用。工业生产可以根据实际情况选择一次纯化甘草黄酮粉或二次纯化甘草黄酮粉进行黄酮单体的进一步提纯或其他用途。
实施例2
(1)甘草黄酮提取液浓缩：取甘草药材一级提取液经除去非黄酮成分后滤液5000l，减压蒸馏回收液体至适量，加入硅藻土，混匀，80℃烘干，粉碎，得甘草黄酮浸膏粉342kg；
(2)一次纯化：取上述甘草黄酮浸膏粉，加入二氯甲烷/甲醇/乙醇(v/v/v,4/1/1)混合溶剂进行提取，提取3次，每次0.5小时；每次分别加入混合溶剂1710、1368l，1368l，分别收集各级提取液和滤渣；一级提取液进行溶剂回收，浸膏60℃烘干，得一次纯化甘草黄酮粉117kg，二级、三级提取液继续用于新一轮甘草黄酮浸膏粉的纯化提取；
(3)二次纯化：取上述一次纯化甘草黄酮粉，加入乙酸乙酯/丙酮(v/v,1/1)混合溶剂进行提取，提取3次，每次0.5h；各级提取分别加入混合溶剂468l、351l、351l，分别收集各级提取液和滤渣；一级提取液进行溶剂回收，浸膏60℃烘干，得二次纯化甘草黄酮粉57kg，2级、3级提取液继续用于新一轮一次纯化甘草黄酮粉的纯化提取；
(4)甘草总黄酮含量测定：
标准液的制备：称取芦丁标准品20mg(精确到0.1mg)，以60％乙醇溶解于100ml容量瓶中，并稀释至刻度。取此样液20ml于50ml容量瓶中，加60％乙醇溶液5ml，以水稀释至刻度，即得标准液(1ml标准液约含0.08mg芦丁标准品)。
试样液的制备：分别精密称取一次纯化甘草黄酮粉、二次纯化甘草黄酮粉各20mg,至50ml容量瓶中，以60％乙醇稀释至刻度，即得试样液。
分别取上述两液各5ml于10ml容量瓶中，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，静置6min，加10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，静置6min，加入1mo/l氢氧化钠溶液4ml，摇匀，用30％乙醇定容，静置15min，用1cm比色皿，在波长510nm处测吸光度。
总黄酮的浓度c，按下式计算
c＝k*m1*a/a0/2500
式中：
m1—标准品中黄酮重量(mg)；
a—试样的吸光度；
a0—标准品的吸光度；
k—试样的稀释倍数。
统计应用一次纯化甘草黄酮粉、一次纯化甘草黄酮粉的含量和收率，数据见表2。
表2实施例2甘草黄酮粉含量测定
由表中数据看出，经过上述纯化步骤处理，一次纯化甘草黄酮粉含量为17.73％，甘草总黄酮转移率为87.32％，二次纯化甘草黄酮粉含量为27.04％，甘草总黄酮转移率相对一次纯化甘草黄酮粉为76.10％，整体工艺甘草总黄酮的转移率为66.45％。整体工艺过程中，没有酸水和碱水的应用，有机溶剂得到高效回收利用。工业生产可以根据实际情况选择一次纯化甘草黄酮粉或二次纯化甘草黄酮粉进行黄酮单体的进一步提纯或其他用途。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。