镰形棘豆的抗真菌感染提取物及其制备方法和用途与流程

本发明公开了一种抗真菌的镰形棘豆提取物的制备方法及其在抗真菌感染中的应用，属于中药领域。

背景技术：

真菌是自然界中广泛分布的微生物，也是人类皮肤粘膜表面常见的菌，正常情况下与人类共生。近年来，随着广谱抗菌药物、侵入性操作、器官移植和化疗药物应用的不断增加，临床真菌感染的发病率呈上升趋势。在抗真菌药物长期大量应用于临床的同时，真菌的耐药性越来越普遍，耐药程度也越来越高，耐药性已成为临床治疗抗真菌失败的主要原因。目前临床使用的抗真菌药物结构类型有限，主要为多烯类，三㘴类等，作用机理和靶点相对单一，且这些抗真菌药物存在种种的毒副作用和日益严峻的耐药性问题。因此，人们仍急需新型抗真菌药物。

真菌源皮肤疾病在宠物（犬、猫）及珍贵毛皮动物（狐狸、貉子、水貂等）中发病率逐年升高，成为宠物市场和毛皮动物特种养殖业的难题。该病主要致病源为犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌，为高度接触性传染病，传染性强，且人畜共患，直接对人类健康造成严重威胁，同时也给养殖业造成巨大的经济损失。然而，目前动物真菌源皮肤病的治疗主要是化学抗真菌药的外用软膏或喷剂，在治疗过程中多存在毒性强、使用频繁、短效、易产生耐药性等问题。一款高效无毒且长效的新型抗真菌动物用药迫在眉睫。

镰形棘豆(oxytropisfalcatabunge),为豆科棘豆属的一种药用植物，主产于我国青海、甘肃南部、四川西部、生长在海拔2700-4300m的河滩、沙地、沟谷、山坡、灌木林、草甸、资源丰富，藏药称“莪达夏”，是藏医的“三抗炎药”之一，并享有“草药之王”的美誉。该药根及根茎或全草入药，性味：辛，寒，有小毒，归经：入肺、脾经，具有清热解毒，生肌愈疮，消肿止痛，涩脉止血，通便等功效。其内服可治疗流感、扁桃体炎、喉炎、气管炎、炭疽病、麻风病等，外敷治疗疮疖肿痛、创伤、骨伤疼痛。民间多用于解毒、镇痛，刀伤等的治疗疗效良好。但是由于其毒性反应使得家畜食用后出现流产、产弱胎、畸胎等，成为草原毒害草之一。近年来藏药镰形棘豆以其独特的疗效和高原植物特有的生态，受到广大研究者的关注，其研究与应用逐年增多。大量研究发现它具有镇痛抗炎、止血、抗肿瘤、祛痰平喘等作用，但未见其在抗真菌方面的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于本发明公开了一种抗真菌的镰形棘豆提取物、其制备方法及其在抗真菌感染中的应用，以解决背景技术中存在的上述问题。

本发明提供的技术方案如下：

一种镰形棘豆的活性提取物，其特征是所述活性提取物选自镰形棘豆醇提物中萃取得到的石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物之一或其组合；所述活性提取物是采用包含以下步骤的方法制备得到的：⑴取镰形棘豆粗粉，用乙醇浸泡，超声波助溶提取，过滤，滤渣重复上述提取，过滤，合并提取液；⑵将提取液减压浓缩得到浓缩液，冻干后用蒸馏水分散；⑶用不同极性溶剂石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行梯度萃取，每种溶剂重复萃取，合并相同的有机相以及水相，减压浓缩即得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物。

本发明优选的技术方案如下：

1）乙醇提取物的制备：镰形棘豆适当粉碎，与溶剂体积1：20的比例，加入不同比例乙醇浸泡并超声提取1h,抽滤得到滤液。药渣重复提取一次，将两次滤液合并。然后55℃减压浓缩得到浓缩液。

2）不同极性部位的梯度萃取：取步骤（1）获得的乙醇膏状药材提取物，冷冻干燥后，用蒸馏水分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，合并相同溶剂的萃取液，萃取液真空浓缩干燥，分别得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、水提取物。

本发明所述方法中使用的乙醇优选60-90%乙醇。

本发明还提供一种药物组合物，其包括上述任一方法制备的提取物和药学上可接受的载体。

所述组合物任选以适合的药用制剂形式存在，所述制剂形式选自片剂，片剂、胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、喷膜剂、滴丸、滴丸剂和/或贴剂；所述片剂优选糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂或缓释片剂；所述胶囊剂优选硬胶囊剂、软胶囊剂或缓释胶囊剂。

本发明进一步提供了各种提取物在制备抗真菌感染药物的应用；所述真菌选自：石膏样小孢子菌(m.gypseum)、须癣毛癣菌(t.mentagrophytes)和/或犬小孢子菌(m.canis)。为此进行的抗真菌相关实验，以mic为活性指标。实验结果表明，镰形棘豆的石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物对外部真菌感染具有不同程度的效果，可用于抗真菌药物的制备。

附图说明：

图1：乙醇总提物抑真菌活性。

图2：不同极性部位mic。

具体实施方式

实施例1镰形棘豆乙醇提取物及其不同极性部位的制备

镰形棘豆（oxytropisfalcatabunge）适当粉碎，与溶剂体积1：20的比例，加入75％乙醇浸泡并超声提取1h,抽滤得到滤液。药渣重复提取一次，将两次滤液合并。然后将滤液减压浓缩，得到膏状药材提取物，冷冻干燥后，用蒸馏水分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，合并相同溶剂的萃取液，萃取液真空浓缩干燥，分别得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、水提取物、正丁醇提取物。

实施例2体外抗真菌活性测定

用菌丝生长速率法、微量稀释法（mic）进行药材乙醇提取物体外抑菌活性的测定，从定性和定量的角度对药材乙醇提取物的抗菌活性进行测定。

1.实验菌株：石膏样小孢子菌(m.gypseum)、须癣毛癣菌(t.mentagrophytes)、犬小孢子菌(m.canis)。

2.实验方法

1）测试对象的配置：将实施例1制备的5种提取物（即石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、水提取物、正丁醇提取物）分别用500uldmso溶解后用蒸馏水稀释至10mg/ml，按1:9加入融化状态的pad培养基（40-50℃），使最终浓度为1mg/ml。

2）培养基的制备：

马铃薯琼脂培养基（pda）制备：将新鲜马铃薯洗净去皮，切成小块，称量200g，放入1l蒸馏水中煮15-30min，用三层纱布过滤后，补足因蒸发而减少的蒸馏水至1l。在滤液中加入20g的葡萄糖和20g的琼脂，加热，待琼脂完全融化后，趁热分装于250ml的锥形瓶中并塞上棉塞，用报纸包好，于121℃高压蒸汽灭菌锅高压灭菌30min。灭菌完成后，转移至无菌操作台，待培养基温度降至50℃左右。倒无菌平板，晃匀，平放，制成pda平板，凝固后4℃保存，备用。

马铃薯液体培养基（pdb）制备：将新鲜马铃薯洗净去皮，切成小块，称量200g，放入1l蒸馏水中煮15-30min，用三层纱布过滤后，补足因蒸发而减少的蒸馏水至1l，在滤液中加入20g的葡萄糖。灭菌，4℃保存备用。

沙氏葡萄糖琼脂培养基（sda）制备：称量10g蛋白胨、40g葡萄糖、20g琼脂于大烧杯中，蒸馏水定容至1l，加热，待琼脂融化后，趁热分装于250ml的锥形瓶中并塞上棉塞，用报纸包好，于121℃高压蒸汽灭菌锅高压灭菌30min。转移至无菌操作台，待培养基温度降至50℃倒平板，晃匀，平放，冷却后4℃保存，备用。

制备含药平板：取1）中所得药材溶液1ml以及上述冷却至50℃左右的培养基约9ml倒入灭菌的培养皿中，制成浓度为5mg/ml的含药平板。待培养基冷却至50℃，加入1ml无菌体积水以及约9ml培养基制成该含药平板的对照平板，凝固后4℃保存，备用。

制备真菌平板：往已冷却至50℃左右的100ml培养基加入2ml菌悬液，迅速混匀，然后倾注无菌平板，水平静置待凝固后，4℃保存备用。

3）菌悬液的制备：将试验所需的石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌从冰箱中取出，用无菌接种环分别将3种真菌接种到sda平板上，27℃培养2周，活化真菌，使菌落均匀覆盖在培养基上。吸取灭菌的生理盐水2ml冲洗菌落表面的菌丝和孢子，将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板计数，将浓度调制为105~106cfu/ml，获得菌悬液，备用。

4）菌丝生长速率的测定

将石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌接种在pda平板上27℃培养5天备用。用已灭菌的打孔器在接种供试菌的pda平板边缘切取直径为0.4cm的菌饼，将该菌饼接入2）下所得的含药培养基上，有菌丝的一面朝下，每个培养皿接种3个菌饼。同时将2）下的对照平板做对照处理。做3次重复，置于27℃的恒温培养箱中培养。培养2-6d，每天用十字交叉法测量供试真菌在不同浓度含药培养基上的菌落直径，与对照比较计算各药液处理对菌丝直线生长的抑制率。按下式求出抑菌率：菌落增长直径（cm）=测量直径平均值－0.4抑菌率（%）=（空白对照菌落直径－处理菌落直径）÷空白对照菌落直径×100

5）最小抑菌浓度（mic）的测定

测定镰形棘豆乙醇提取物所配药液的最小抑菌浓度。取无菌96孔板，首先每孔加入100μl的pdb培养基，然后在第1列、第2列每孔分别加入2）项下的药材溶液100μl，混匀；2~11孔进行倍比稀释：从第二列取100μl液体至第3列，混匀；从第3列取100μl液体至第4列，依次类推，至第11列。11列混匀后取出100μl液体，弃去；最后每孔加入菌悬液100μl。此时2至11列样品浓度为2500、1250、625、312.5、156.25、78.13、39.06、19.53、9.77、4.88μg/ml。第一列为空白对照，第12列为生长对照。将该96孔板置于27℃恒温培养箱中培养48h，以肉眼观察无真菌生长的最低浓度判定为mic。每个样品重复实验3次。

3.实验结果

3.1乙醇总提物抗真菌活性结果见图1：乙醇总提物在试验浓度下，表现出广谱抑菌活性。

3.2最小抑菌浓度（micmg/ml）的测定：抗真菌活性极性部位mic测定结果见图2，结果显示氯仿部位对犬小孢子菌最小抑菌浓度为2.5mg/ml，对石膏样小孢子菌最小抑菌浓度为2.5μg/ml，对须癣毛癣菌最小抑菌浓度为5μg/ml。

抗真菌活性实验结果表明，镰形棘豆不同溶剂提取物对石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌均有不同程度的抑制作用，可用于抗真菌药物的应用。