白头翁皂苷B4在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用的制作方法

本发明涉及白头翁皂苷b4的应用，具体涉及白头翁皂苷b4在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

背景技术：

溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,uc)是一种发生在结肠部位的慢性炎症性肠病，属自身免疫性疾病，临床表现为亚急性或慢性腹痛、腹泻伴黏液血便。溃疡性结肠炎发病机制不明，涉及遗传易感性、上皮屏障缺陷、免疫反应失调和环境因素等。临床治疗药物主要为抗炎药、皮质类固醇、生物制剂及免疫抑制剂，然而这些药物大多存在严重的毒副作用，病人治愈率低且易反复。肿瘤坏死因子tnf-α抗体在近二十年得到广泛使用，但存在毒副作用高、价格昂贵，给药途径为肌肉或皮下注射等问题。

jak(januskinases，jak激酶)/stat(signaltransducerandactivatoroftranscription，信号转导及转录激活蛋白)信号通路抑制剂托法替尼(tofacitinib)是一种非选择性可口服的jak抑制剂，可抑制jak-stat信号通路级联反应，从而显著抑制多种炎症因子介导的炎症反应。托法替尼于2012年11月被美国药品食品监督管理局(fda)批准用于自身免疫性疾病风湿性关节炎的治疗，并于2018年5月被美国fda批准用于治疗中度至重度uc，其高剂量(10mg/kg)临床缓解率约为40％。但因其作用于信号上游靶点，可引起多种非特异反应，包括高血脂、严重感染、恶性肿瘤及肺栓塞等毒副反应，其中部分可危及生命，且其毒性与剂量成正比。鉴于此，欧洲药品管理局安全委员会于2019开始对托法替尼进行综合评估，同时美国fda也发布托法替尼引起血凝及死亡风险的黑框警示(一种罕见的安全警告)，同时慎重使用或停用10mg/kg这一临床剂量，而妥协使用5mg/kg这一临床剂量。鉴于最新药物托法替尼较低的临床缓解率和较严重的不良反应，因此，目前uc临床治疗困境仍未得到很好解决，仍迫切需要研究新的替代药物。

近年来，以青蒿素为例的中药单体药理活性不断被发现，中药为新药发现提供了巨大的宝库。白头翁皂苷b4(anemosideb4，ab4)为毛茛科白头翁属植物白头翁的主要成分，其具有抗炎、抗细胞毒性、抗肿瘤等生物活性，但其对uc的治疗作用尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供白头翁皂苷b4在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：白头翁皂苷b4在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。

所述的药物含有白头翁皂苷b4和其生理上可接受的盐中的一种。

所述的药物含有药学上可接受的载体或辅料。

所述的载体优选为微囊、微球、纳米粒、脂质体中的至少一种。

所述的辅料优选为助溶剂、增溶剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、表面活性剂、缓释剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂中的至少一种。

所述的治疗溃疡性结肠炎的药物可采用常规方法制备成各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、丸剂等口服剂型。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.白头翁皂苷b4能够显著缓解溃疡性结肠炎模型小鼠症状，作用优于最新uc西药托法替尼和对uc有较大治疗前景的中药单体小檗碱。

2.白头翁皂苷b4不仅不会引起托法替尼和小檗碱两种药物在治疗溃疡性结肠炎过程中伴发的脾脏肿胀，且具有一定的缓解作用，同时对其他脏器无结构损伤。因此，白头翁皂苷b4对uc疗效确切，毒副作用低，安全性高，有望用于uc临床治疗，解决现有药物疗效不足、副作用多及毒性大的问题。

附图说明

图1为小鼠造模方法图。

图2为小鼠体重统计图；其中，与对照组比较，^#p<0.05，^##p<0.01，^###p＜0.001，^####p<0.0001；n＝4。

图3为小鼠粪便稠度评分统计图；其中，与对照组比较，^#p＜0.05，^###p＜0.001，^####p<0.0001；与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01；n＝4。

图4为小鼠便隐血评分统计图；其中，与对照组比较，^####p<0.0001；与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01；n＝4。

图5为小鼠疾病活动指数评分统计图；其中，与对照组比较，^##p＜0.01，^###p＜0.001，^####p<0.0001；与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01；n＝4。

图6为小鼠结肠长度测量及统计图；其中，a为小鼠结肠测量照片；b为结肠长度统计结果；与对照组比较，^##p＜0.01；与模型组比较，**p<0.01，***p＜0.001；n＝4。

图7为小鼠单位长度结肠及脾脏重量统计图；其中，a为小鼠单位长度结肠重量统计图；b为小鼠脾脏重量统计图；其中，与对照组比较，^##p<0.01，^###p<0.001；与模型组比较，**p<0.01；n＝4。

图8为小鼠结肠和脾脏he染色照片图；其中，a为结肠；b为脾脏。

图9为小鼠心、肝、肺、肾、脑he染色照片图(20×)；其中，a为心；b为肝；c为肺；d为肾；e为脑。

具体实施方式

下面将结合实施方式对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一、将小鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，中国长沙)随机分为7组，每组4只。采用硫酸葡聚糖(dss)诱导小鼠产生溃疡性结肠炎症状，然后对小鼠分组给药，以给药后小鼠炎症的缓解情况为指标考察各组药物的缓解和治疗效果。实验各组设置如下：

(1)正常组：实验期间(18天)内均给予自由饮水，饮食中不加入任何药物。

(2)模型组(dss组)：采用2％(w/v)dss循环诱导小鼠产生溃疡性结肠炎，造模方法：将dss以2％(w/v)的浓度溶于饮用水中，其中，第1-4，8-11及15-18天分别给予2％(w/v)dss溶液；第5-7和12-14天给水，第19天结束实验(图1)。

(3)托法替尼组(dss+托法替尼)：造模方法及周期同模型组，在造模第五天开始采用30mg/kg托法替尼(购自mce，美国)灌胃给药。

(4)小檗碱组(dss+小檗碱)：造模方法及周期同模型组，在造模第五天开始采用40mg/kg小檗碱(购自源叶，中国上海，≥95％)灌胃给药。

(5)白头翁皂苷b4组(dss+ab4)：造模方法及周期同模型组，在造模第五天开始采用100mg/kg白头翁皂苷b4(购自瑞芬思，中国成都，≥98％)灌胃给药。

二、实验过程中记录所有小鼠的体重、腹泻及便血情况，计算疾病活动指数评分(dai)。dai(8分)＝体重减轻程度评分(2分)+粪便稠度程度评分(3分)+便隐血程度评分(3分)。dai总分从0(未受影响)到8(严重结肠炎)。具体计算方法如下：

a)体重

每天监测小鼠的体重。体重减轻计算为原始体重(第0天)与每天体重之间的百分比差异。得分如下：无变化＝0；0-1％＝0.1；1-2％＝0.2；2-3％＝0.3；3-4％＝0.3……以此类推，19-20％＝0.19；≥20％＝2。

b)粪便

造模第5天、第7天、第12天、第15天、第19天(结束造模后第一天)检测小鼠粪便稠度。得分如下：正常＝0；软但仍然形成＝1；非常软＝2；腹泻＝3。

c)便隐血

同步检测小鼠便隐血情况，得分如下：阴性血隐＝0；阳性血隐-2min＝1，1min＝1.25，10s内显色＝1.5；立即显色＝1.75；肉眼可见粪便血迹＝2；直肠出血＝3。

根据以上评分标准，正常组各项积分均为零，表明正常组小鼠无任何相关异常反应。基于此进一步比较各组小鼠的体重、稀便、便血及以上指标积分累加所得的疾病活动指数：相比正常组，模型组从第2天开始体重显著下降，各药物治疗组体重下降有不同程度缓解，尤其白头翁皂苷b4治疗组自第12天开始体重较模型组比明显上升(图2)；相比正常组，模型组在五个测试时间(第5、7、12、15、19天)均显著升高了粪便稠度评分；相比模型组，在第12天仅有白头翁皂苷b4显著降低粪便稠度评分，在第19天小檗碱组和白头翁皂苷b4组显著降低评分(图3)；相比正常组，模型组在五个测试时间(第5、7、12、15、19天)显著升高了便血评分；相比模型组，托法替尼组在第12、15及19天显著降低了便血评分，白头翁皂苷b4组在第12天和第19天降低了便血评分(图4)；相比正常组，模型组在各测试时间点的dai评分明显上升；相比模型组，3个给药组在结束给药后第一天(第19天)均显著降低dai评分，同时，白头翁皂苷b4组在第12天也显著降低dai评分，且低于其他各组(图5)。以上结果表明白头翁皂苷b4组体重下降、稀便及便血程度均有显著改善作用，效果略优于两个阳性药物组。

三、将各组小鼠于第19天处死，迅速取出结肠并测量长度，用生理盐水洗净之后称重，并分离脾脏称重。

结果显示，相比正常组，模型组小鼠结肠发生了明显的缩短与肿胀；相比模型组，三个给药组显著改善了结肠缩短的情况，白头翁皂苷b4组改善结肠缩短效果最好(图6)，且白头翁皂苷b4改善了结肠肿胀的情况，效果优于托法替尼和小檗碱这两种阳性对照药(图7a)。相比正常组，模型组小鼠脾脏发生显著肿胀；相比模型组，白头翁皂苷b4组的脾脏肿胀有一定程度的缓解，未出现托法替尼组和小檗碱组伴发的进一步脾脏肿胀(图7b)。

四、对各组小鼠结肠、脾、肝、心、肾、肺、脑进行苏木精-伊红染色(he染色)，检测结肠及脾脏病理变化，并同时检测脏器是否存在结构损伤，以确定各给药组所用药物的潜在毒性。

结果显示：相对正常组，模型组小鼠的结肠出现严重结构破坏；相比模型组，三个给药组明显改善结肠结构破坏，白头翁皂苷b4组改善效果最好(图8a)。相对正常组，模型组及三个阳性药物组均出现脾脏细胞增多；白头翁皂苷b4组较轻微(图8b)。白头翁皂苷b4组的肝、心、肾、肺、脑等脏器的结构组织与模型组相比未出现明显的损伤(图9a-e)，表明白头翁皂苷b4组无明显毒性。

以上步骤二至四的结果表明，与正常组相比，模型组的小鼠临床症状各项指标评分及其指数显著升高，结肠发生明显缩短与肿胀，脾脏发生明显肿胀，说明dss能够有效诱导小鼠产生溃疡性结肠炎症状，其各项指标符合结肠炎的症状及发展规律。与模型组相比，三个给药组溃疡性结肠炎症状均能够改善，小鼠结肠变短的程度减轻，其中，白头翁皂苷b4组各项指标评分略优于其他两个阳性对照组。因此，本发明所提供的药物ab4，对uc有明显的治疗作用，同时可缓解脾脏的肿胀，且对各脏器无结构损伤作用，具有缓解和治疗uc的疗效，安全性较好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。