小分子化合物双水杨酸酯在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用的制作方法

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种小分子化合物双水杨酸酯在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用。

背景技术：

随着肥胖、糖尿病在世界范围发病持续增加，非酒精性脂肪性肝病(nafld)是儿童和成人最常见的慢性肝脏疾病。数据显示，我国特定人群nafld患病率高达27％.nafld的早期阶段肝脏脂肪逐渐沉积，饱和脂肪酸、细菌脂多糖、毒性脂质代谢产物如鞘磷脂类等能引起脂肪沉积的肝组织nf-kb通路活性持续增加和其下游的炎症因子分泌增多，从而导致慢性代谢性炎症。慢性代谢性炎症不仅是nafld的一个显著特征，而且在nafld的恶性病程和代谢性疾病的共同疾病基础胰岛素抵抗的发生发展中起着关键作用，严重威胁人类健康。nafld不仅会进展成肝硬化、肝衰竭和肝癌，而且还与肝外肿瘤、糖尿病、心血管疾病发生率呈正相关，急需治疗药物。由于持续炎症可以引起糖脂代谢异常过程，加速nafld，因此，减轻或抑制慢性代谢性炎症成为人们探索有效治疗nafld和其它代谢性疾病的关键策略。

nafld等代谢性疾病状态下，肝细胞ampk活性普遍下降，由于ampk是组织细胞能量代谢调控的关键因子，肝脏组织ampk活性下降能引起肝脏脂肪沉积和炎症反应，因此ampk活性抑制与疾病病程正相关。ampk是广泛存在于真核细胞并高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞能量代谢平衡的主要调控因子。ampk不仅能直接调控参与脂质等合成代谢的多个酶和核转录因子活性，而且还通过与其它分子如pgc-1α、mtorc1介导的信号通路相互作用，调控细胞代谢和增殖。ampk是由α、β和γ三个亚单元组成，其中，α亚基是酶活性单位，β和γ亚基对α活性单位起调节作用。β和γ亚基与一些物质或分子如amp结合后，引起ampk蛋白结构变化而变构激活α活性单位，同时还保护α活性单位脱磷酸化。因此，改变细胞ampk活性响应状态有可能逆转nafld病理条件下的代谢异常，治疗nafld等代谢性疾病。

hawley等报道水杨酸(sa，salicylicacid)能与ampk的β1亚单元结合，导致其变构并激活ampk。常用药物阿司匹林(as，aspirin)为乙酰水杨酸，在体外酶活实验中不具有激活ampk的能力，考虑到阿司匹林可以在体内快速水解成水杨酸，因此可以在细胞水平激活ampk。双水杨酸酯(sal，salsalate)是由2个水杨酸分子以酯键结合而形成，具有解热、镇痛、抗炎作用，临床用于治疗急慢性风湿性关节炎、神经痛等中等度疼痛，对痛风也有较好的疗效。由于该药口服在胃中不分解，对胃肠道的刺激性较小，可以使用较高剂量(成人每天可以使用3-4.5g)。一般认为其在碱性肠液中逐渐分解成为2个分子的水杨酸而起作用，故可达较高血液浓度，且可以维持较长时间。

技术实现要素：

本发明需要解决的问题是提供一种小分子化合物治疗非酒精性脂肪肝病的方法，其特征是该小分子化合物可以直接激活ampk，在体内逆转ampk活性抑制作用，降低肝脏脂肪积聚，逆转nafld过程。本发明描述的小分子化合物为双水杨酸酯及及药学上可接受的盐，描述其体外激活ampk作用及在nafld小鼠模型上显著逆转ampk活性抑制，改善肝脏脂肪沉积等特性。本发明在小鼠nafld模型上研究了其对小鼠肝脏组织脂肪沉积的作用，发现sal可以显著降低肝脏组织脂肪沉积降低炎症反应。与此相对应的是sal治疗可以逆转小鼠肝脏ampk活性抑制。因此，本申请主要研究了sal对ampk酶活的影响，首次证明sal可以直接激活ampk，具有逆转ampk活性抑制的能力。可制备成治疗非酒精性脂肪肝病药物。

本发明与现有技术相比其有益效果是：

1.本发明所述双水杨酸酯可以直接激活ampk，作为候选化合物进行结构优化；

2.本发明所述双水杨酸酯在生理ph条件下以盐的形式存在，可以以药学上可接受的盐使用；

3.本发明所述化合物为临床用药，可拓展其应用范围，制备治疗非酒精性脂肪肝病药物；

4.本发明提供了一种体外筛选ampk激活剂的方法；

附图说明

图1.双水杨酸酯激活ampk实验。酶活测定示意图(a)及sal激活ampk实验结果(b)。

图2.双水杨酸酯10mm于ph7.5生理盐水溶液在室温留置1、2、4和24小时，hplc检测双水杨酸酯及水解产物水杨酸含量。左侧sa及sal为标准品对照品图。

图3.以不同浓度双水杨酸酯(sal)或阿司匹林(as)或水杨酸(sa)处理hek293t或肝癌hepg2细胞。ampk以及acc磷酸化以免疫印迹鉴定。

图4.双水杨酸酯对小鼠体重及肝组织脂肪沉积影响(a)模型建立及治疗示意图，(b)小鼠体重变化，(c)小鼠葡萄糖耐受测定，(d、e)小鼠肝脏及组织脂肪沉积测定。数据为mean+/-sd,**p<0.01,*p<0.05.

图5.双水杨酸酯改善肝脏及脂肪组织ampk和炎症过程。a.sal治疗改善高脂喂养引起的肝脏ampk抑制状态，b.小鼠以sal灌胃(200mg/kg)，2小时候处死，取肝脏及大腿肌肉组织，以免疫印迹方法检测ampk以及acc磷酸化情况。n＝3.表明双水杨酸酯体内激活ampk实验。c、d.sal逆转高脂食物喂养小鼠炎症及代谢基因表达。数据为mean+/-sd,**p<0.01,*p<0.05.

图6.sal改善高脂食物诱导的脂肪肝(a)及量化测定(b)，降低肝脏甘油三脂堆积(c)，抑制巨噬细胞迁移(d)。数据为mean+/-sd,**p<0.01,*p<0.05.

具体实施方式

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

hek293t以及hepg2细胞购于上海中科院细胞库，小鼠购自南京大学模式动物中心，化学试剂购自西格玛公司(上海)，fluorospark试剂盒购自日本wako公司，sam多肽由金斯瑞公司合成。

实施例一ampk激活剂体外筛选方法建立及双水杨酸酯激活ampk研究。

本发明以体外酶活方法研究了sal是否能够直接激活ampk。首先配制以下缓冲液，75mmnacl,2mmmgcl2,0.02％bsa,0.02％triton-100,andtris-hcl(50mm,ph7.5).然后在1.5mlep管中，按2μg/ml加入重组ampk(购自义翘生物，α1β1γ1)，每个反应15μl体积，双份，向管中加入空白对照、adp阳性对照或测试样品，包括不同浓度的sa，sal，as(去离子水，以naoh调至ph7.5)，室温孵育20分钟后，向每个管中加入含10μmsams及200μm新鲜配制的atp缓冲液，30℃孵育60分钟。反应在65℃灭活5分钟，以fluorospark试剂盒(日本wako公司)测定adp含量.所用仪器为spectramaxm3(moleculardevices)，发射及检测波长分别为540nm和590nm.以空白读数为1，折算化合物对ampk活性影响，绘制曲线(图1).

双水杨酸酯在生理ph条件下稳定性测定。文献报道水杨酸(sa)可以激活ampk。由于双水杨酸酯为2分子水杨酸酯化而来，可能通过水解产物激活ampk。为此我们模拟了sal在酶活实验(时长约60分钟)条件下的稳定性，发现在生理ph条件下，双水杨酸酯极少水解，即便室温放置24小时，仍有96％的sal以原药形式存在(图2)，所产生的sa浓度极低，达不到激活ampk的浓度，提示sal直接激活ampk，而非通过其水解产物等。

双水杨酸酯促进ampk磷酸化研究。我们以双水杨酸酯(sal)及水杨酸(sa)钠盐和阿司匹林(as)处理293t等细胞，研究了其在细胞水平诱导ampk活化的能力，发现sal可以诱导ampk以及其底物acc磷酸化(图3)，证明其具有激活ampk的能力。

实施例二双水杨酸酯可以降低小鼠脂肪组织炎症因子以及代谢相关基因表达，逆转小鼠肝脏及肌肉组织ampk失活，改善非酒精性脂肪肝状况。

我们在高脂食物喂食的nafld小鼠模型(图4)上验证了sal对ampk的作用。文献报道在高脂食物喂食的小鼠中ampk活性显著抑制。我们以免疫印迹方法测定了小鼠肝脏及肌肉组织中ampk的激活状况，发现sal治疗组ampk活性抑制逆转(图5a)。这一观察在小鼠上得到了进一步验证。我们以sal喂食健康小鼠，2小时候处死小鼠，检测肝脏以及肌肉组织中ampk磷酸化情况，发现sal可以在体内激活ampk(图5b)。

本发明还以rt-qpcr检测了脂肪组织中炎症因子等表达，证明高脂喂食可以显著增加炎症因子表达，sal治疗明显抑制炎症因子表达。肥胖不但引起胰岛素抵抗，还可以促使以葡萄糖和脂肪酸为原料的甘油三酯大量合成，继而发生内源性高脂血症和脂肪肝。sal治疗组逆转了hfd诱导的脂肪肝症状，降低甘油三酯量。我们还从脂肪组织分离出svf细胞，通过f4/80⁺cd11b⁺双染标记，流式细胞分析小鼠脂肪组织的atms浸润明显降低(图6)，表明sal可能抑制代谢性炎症应答过程。这些数据表明sal可以逆转ampk活性抑制，改善nafld病理状态。